Методическая статья

Иммунофлуоресценция пятно использованием IBA1 и TMEM119 для микроглиальной плотности, морфологии и периферической миелоидной клеточной инфильтрации анализа в мышиный мозг

DOI:

10.3791/60510

⸱

27 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает пошаговой рабочий процесс для иммунофлуоресцентного костейни IBA1 и TMEM119, в дополнение к анализу микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также периферической миелоидной инфильтрации в ткани мозга мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это протокол для двойной визуализации микроглии и проникновения макрофагов в ткани мозга мыши. TMEM119 (который маркирует микроглию выборочно), в сочетании с IBA1 (который обеспечивает исключительную визуализацию их морфологии), позволяет исследует изменения плотности, распределения и морфологии. Количественная оценка этих параметров имеет важное значение для получения информации о роли, которую играет микроглия, резидентные макрофаги мозга. В нормальных физиологических условиях микроглия регулярно распределяется по мозаичному узору и представляет собой небольшую сому с беспорядочными процессами. Тем не менее, в ответ на экологические факторы (наиболее травмы, инфекции, болезни или травмы), микроглиальная плотность, распределение и морфология изменяются различными способами, в зависимости от оскорбления. Кроме того, описанный метод двойного окрашивания позволяет визуализировать проникновение макрофагов в мозг на основе их экспрессии IBA1 и без колокализации с TMEM119. Таким образом, такой подход позволяет проводить дискриминацию между микроглией и инфильтративающимися макрофагами, что необходимо для обеспечения функционального понимания их явного участия в гомеостазе мозга в различных контекстах здоровья и болезней. Этот протокол интегрирует последние выводы в нейроиммунологии, которые относятся к идентификации селективных маркеров. Он также служит полезным инструментом как для опытных нейроиммунологов, так и для исследователей, стремящихся интегрировать нейроиммунологию в проекты.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Будь то острое или хроническое, нейровоспаление находится под сильным влиянием микроглии, резидентов макрофагов мозга. Визуализация микроглии с помощью иммуностоинга ценна для изучения нейровоспаления с использованием световой микроскопии, высокодоступной техники. В гомеостастатных условиях, микроглии, как правило, распространяются в nonoverlapping, мозаика, как картина. Они проявляют небольшие сомы, которые расширяют неразрешимые процессы1, которые иногда контактируют друг с другом2. Микроглиальные неразрежденные процессы динамически обследуют паренхиму головного мозга, взаимодействуя с нейронами, другими глиальными клетками и кровеносными сосудами при нормальных физиологических условиях3. Микроглия оснащена арсеналом рецепторов, которые позволяют им выполнять иммунологические задачи и реагировать на изменения в среде мозга, на гибель клеток или на повреждение тканей. Кроме того, они оказывают ключевые физиологические функции, в частности, в синаптической формирования, технического обслуживания и ликвидации4,5.

Среди доступных маркеров, используемых для изучения микроглии, ионизированная молекула адаптера связывания кальция 1 (IBA1) является одним из наиболее широко используемых. IBA1 является кальциевым связывающим белком, который обеспечивает исключительную визуализацию микроглиальной морфологии, включая тонкие дистальные процессы, что подтверждается электронной микроскопией6. Этот инструмент сыграл важную роль в характеристике микроглиальной трансформации, ранее называемой "активацией", в широком спектре моделей болезней животных7,8,9. При наличии нейровоспаления микроглиальный ответ включает в себя: микроглиоз, который определяется как увеличение плотности клеток, изменения в распределении, которые иногда приводят к кластеризации, увеличению тела клетки, а также утолщение и сокращение процессов, связанных с более амибойдформы10,11,12,13.

Иммуностогирование ограничено наличием антител, направленных против конкретных маркеров. Важно отметить, что IBA1 выражается в микроглии, но и периферических макрофагов, которые проникают в мозг14. В то время как наблюдение IBA1-положительных клеток внутри мозга стало маркером микроглии в этой области исследований, периферийные инфильтрации макрофагов было сообщено в различных условиях, даже незначительно в здоровом мозге15,16 ,17,18. Следовательно, использование IBA1 само по себе не позволяет селективной визуализации микроглии. Кроме того, макрофаги принимают молекулярно-морфологические особенности резидентов микроглии, как только они проникли в мозг, тем самым препятствуя дифференциации19. Это представляет собой проблему при изучении функции как микроглии, так и инфильтрации макрофагов.

В то время как микроглии и периферических макрофагов имеют четкое происхождение (например, от эмбрионального желтка мешок и костный мозг, соответственно20,21), есть все большее число выводов, указывающих, что две популяции клеток оказывают различные роли в мозге19. Поэтому крайне важно использовать методы, которые различают эти две популяции без инвазивных манипуляций (т.е. химер костного мозга или парабиоза), которые могут модулировать их плотность, распределение, морфологию и функции. TMEM119 стал микроглии конкретных маркера через здоровье и болезни условия22. В сочетании с IBA1, этот маркер становится полезным для дифференциирования этих клеток от проникновения макрофагов, которые TMEM119-отрицательный и IBA1-положительный. Хотя это регулируется в развитии, TMEM119 выражается уже в послеродовые дни 3 (P3) и 6 (P6), неуклонно растет до достижения взрослых уровней между P10 и P1422. IBA1 выражается уже в эмбриональный день 10.5 (E10.5)23. Таким образом, предлагаемый протокол двойной маркировки полезен для изучения этих двух популяций на протяжении всей послеродовой жизни.

Этот протокол обеспечивает пошаговую иммуностоинизационную процедуру, которая допускает дискриминацию между микроглией и периферийными макрофагами. В нем также объясняется, как проводить количественный анализ микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также анализ инфильтрации периферических макрофагов. В то время как исследование микроглии и периферических макрофагов полезно само по себе, этот протокол далее позволяет локализацию нейровоспалительных фойе; таким образом, он также служит платформой для определения конкретных регионов для проведения расследований с использованием дополнительных (пока больше времени и затрат) методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами институциональных комитетов по этике животных в соответствии с Канадским советом по уходу за животными и Комитетом по уходу за животными Университета Лаваля.

1. Иммуностоидинг

  1. Выберите три секции мозга мыши, содержащие область интереса (ROI) (т.е. гиппокамп) с помощью атласа мозга. Поместите секции в пластиковую многоскважинную пластину и накройте их 350 злителками фосфатно-буферного сосуда (PBS)(Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов, мозг должен быть проникнут 4% параформальдегида и сократить до толщины 50 мкм с вибратом. Для 24 многослойной пластины каждая скважина может вместить до шести секций. Рекомендуемый объем раствора для каждой скважины составляет 350 л (до трех секций) и 500 Л л для скважин, содержащих шесть секций. Для более высокого количества секций рекомендуется использовать 12 многоколодцк. Убедитесь, что выбранный объем раствора для каждого колодца полностью покрывает ткани и позволяет секциям плавать. Рекомендуемые объемы применяются для каждого решения, используемого в остальной части протокола.
  2. Вымойте образцы, покрыв их 350 л PBS и дайте им отдохнуть, поместив многослойную пластину поверх многофункционального шейкера при комнатной температуре (RT). Удалите PBS после 5 мин и замените его 5x на свежий PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления растворов рекомендуется переложить пипетку. При заливке в любом растворе, убедитесь, что место кончик пипетки против стенки колодца для защиты целостности тканей. Также не забудьте использовать новый пипетку для каждого нового решения.
  3. Удалить PBS и добавить 350 л 10 мМ цитрат натрия цитрат буфера с рН 6,0 (Таблица 1).
  4. Запечатайте многослойную пластину парафинаи и дайте ей плавать на ранее разогретой водяной бане в течение 40 минут при 70 градусах Цельсия.
  5. Дайте многослойной пластине остыть около 15 мин.
  6. Удалите буфер цитрата натрия и промойте секции в PBS, как это делается в шаге 1.2.
  7. Удалить PBS и добавить 350 л свежеприготовленных 0,1% NaBH4 (Таблица 1) и пусть инкубировать в течение 30 минут на RT.
  8. Удалите раствор 0,1% NaBH4 и мыть разделы в PBS, как это делается в шаге 1.2.
  9. Удалить PBS и добавить блокирующий буфер (Таблица 1) для 1 ч на RT на вершине многоцелевой шейкер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы подготовить удвоенные объемы блокирующего буфера, так как одно и то же решение будет использовано на следующем этапе.
  10. Удалите блокирующий буфер и замените блокированием буфера, содержащего смесь первичных антител (1:150 мышь IBA1 и 1:300 TMEM119). Запечатать тарелку парафинаю пленкой и дать ей инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  11. На следующий день теплые образцы на RT в течение примерно 15 минут.
  12. Вымойте разделы 5x в течение 5 минут каждый в PBS с тритоном (PBST)(Таблица 1).
  13. Удалить PBST и добавить блокирующий буфер, содержащий смесь вторичных антител (1:300 осла анти-мышь Alexa 488 для IBA1; 1:300 коза анти-кролик Alexa 568 для TMEM119) для 1,5 ч на RT. Начиная с этого момента, защитить образцы от света.
  14. Удалите блокирующий буфер и смойте разделы 5x, как это делается в шаге 1.2, за исключением этого времени с PBST.
  15. Снимите PBST и добавьте 4",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (DAPI) в течение 5 минут на RT.
  16. Удалить DAPI и мыть разделы 3x в течение 5 минут каждый в фосфатном буфере (PB).
  17. Установите секции на слайд микроскопа. Дайте им высохнуть, защищаясь от света.
  18. Когда высушите, добавить несколько капель монтажа флуоресценции среды и накрыть крышкой, избегая образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните слайды, защищаясь от света, внутри гистологического слайд-бокса, при 4 градусах Цельсия. Образцы могут храниться в течение нескольких месяцев.

2. Визуализация для анализа плотности и распределения

  1. С помощью широкоугольного эпифлюоресцентного микроскопа используйте низкое увеличение и канал DAPI, чтобы найти рентабельность инвестиций (т.е. область CA1 гиппокампа).
  2. Приобретайте изображения в 20x, используя числовую диафрагму (NA) 0,5, с каналами DAPI, 488 и 568 с разрешением 0,3 мкм/пиксель. Захват мозаичной картинки, покрывающей рентабельность инвестиций. Кроме того, принять отдельные фотографии, которые будут сшиты в большее изображение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозаичное изображение представляет собой супер изображение, составленное меньшими изображениями. Мозаичные изображения обычно используются для преодоления ограниченной площади поля зрения высоких увеличений. Некоторые программы включают в себя функцию мозаики; тем не менее, изображения также могут быть сшиты вручную вместе с другим программным обеспечением для редактирования фотографий путем сшивания отдельных изображений в один. Не забудьте добавить информацию о масштабе в файл. Для этого типа анализа рекомендуется иметь по крайней мере 300 микроглиальных клеток, изображенных на рентабельность инвестиций/животных (соответствующих примерно 10-15 снимкам для гиппокампа, например), с минимум пятью животными на экспериментальное состояние. На рисунке 1АКК показаны изображения колмаркированной микроглии.
  3. Сохранить изображение в виде файла TIFF.

3. Визуализация для анализа морфологии

  1. Используя конфокальный или структурированный подсветку, используйте канал DAPI, чтобы найти рентабельность инвестиций при низком увеличении.
  2. Используя 40-разную цель (т.е. масло NA 1.4), найдите ячейку IBA1/TMEM119 внутри рентабельности инвестиций. В то время как живая визуализация, двигайтесь по оси. Как только сигнал случайно выбранной микроглии исчезает, установите этот уровень в качестве начала стека. Двигайтесь по оси в противоположном направлении до тех пор, пока сигнал микроглии не исчезнет и не установите эту точку в конце стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2АЗС показаны изображения микроглии IBA1/TMEM119.
  3. Создайте стек во всех трех каналах (DAPI, 488, 568), используя 0,33 мкм с интервалом 0,15 мкм/пиксель. Добавьте информацию о масштабе в файл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая интервальная зона зависит от разрешиваемых сил цели (например, для 40-x цели, такой как масло NA 1.4, она составляет 0,33 мкм). Для анализа морфологии рекомендуется иметь не менее 20 клеток на одно животное с минимум пятью животными на экспериментальное состояние.
  4. Сохранить файл в виде файла TIFF.

4. Анализ плотности и распределения

  1. Откройте FIJI/ImageJ с установленным плагином ближайшего соседского расстояния (NND). Откройте изображение 20x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте поисковую систему с ключевым словом "Ближайший расчет расстояний соседа с ImageJ", чтобы найти инструкции по установке. Плагин Автор Yuxiong Мао.
  2. Чтобы установить шкалу вручную на основе шкалы, отпечатанной на изображении, выберите инструмент прямой линии(рисунок 3E),поместите курсор на край шкалы и, нажав клавишу переноса, нарисуйте линию как можно ближе к шкале на изображении (Рисунок 3I/c1 В), выберите Анализ Установите масштаб,затем введите правильную информацию(рисунок 3J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала иногда может содержаться в метаданных файла и устанавливаться автоматически.
  3. Выберите изображение Цветовая гамма Сделать композитный для создания композитного изображения всех каналов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения изображения, FIJI/ImageJ автоматически создаст композит в формате RGB.
  4. В баре меню выберите Анализ Набор измерений. Проверить площадь, Центр, и периметр. На вкладке Перенаправить на,нажмите кнопку и выберите открытый файл(рисунок 3K).
  5. Перейти к изображению Цветовая гамма Инструмент канала для открытия инструмента канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это меню позволит отключать определенный цвет. Канал DAPI может быть полезен для определения рентабельности инвестиций и подтверждения ячеек. Он может быть отключен, чтобы сделать подсчет легче.
  6. Нарисуйте грубый периметр рентабельности инвестиций с помощью инструмента выбора от руки(рисунок 3D).
  7. Включите инструмент чистки выбора, дважды нажав овальный инструмент на панели инструментов и убедитесь, что поле для выбора enable проверяется(рисунок 3G). Этот инструмент будет использоваться для более точного разграничения рентабельности инвестиций. Выберите подходящий размер кисти от 200 до 400.
  8. Используя кисть выбора, отрегулируйте периметр, чтобы наилучшим образом соответствовать рентабельности инвестиций. Нажмите T на клавиатуре, чтобы добавить к менеджеру roI(рисунок 3L).
  9. Выберите Анализ (ru) Измерьте или нажмите ключ M, и окно результатов всплывет. Копировать и вставить результаты на листе данных, а затем сохранить информацию о области (т.е. области рентабельности инвестиций; Рисунок 3R).
  10. После копирования области ROI, стереть информацию из окна результатов, нажав на него и нажав клавишу Backspace.
  11. Перейти к окну менеджера ROI(рисунок 3L), право нажмите на roI след, изменить имя, чтобы соответствовать имени изображения, а затем сохранить.
  12. Дважды щелкните инструмент кисти в панели инструментов. Выберите черный цвет и размер кисти 10. Убедитесь, что вариант Краска наложения не остановить(Рисунок 3H).
  13. В канале TMEM119 тщательно поместите черную точку в центре сомы для каждой микроглии TMEM119. Поместите белую точку в центре клеток, которые не являются положительными для TMEM119 (для обозначения проникновения макрофагов). Повторите одну и ту же процедуру для всех клеток, содержащихся в рентабельности инвестиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы все точки (черный и белый) расположены в одном канале. Личность канала может быть проверена (красный, синий или зеленый), посмотрев на цвет меток окна изображения.
  14. Выберите изображение Цветовая гамма Сплит-канал. Появится окно для каждого канала. Затем определите канал, который имеет точечные аннотации, и закройте два других окна.
  15. Перенаправьте новое изображение разделенного канала. Перейти к анализу Набор измерений. На вкладке Перенаправить на,нажмите кнопку и выберите изображение разделенного канала(рисунок 3K).
  16. Выберите изображение Тип (тип) 8-битный. Перейти к изображению Отрегулируйте и выберите Порог (рисунок 3O). Чтобы отрегулировать порог, сдвиньте кнопку второй панели, вплоть до левой (пороговое значение 0) в обоих барах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставит только черные точки на изображении, появляясь белыми.
  17. Выберите рентабельность инвестиций в окне менеджера ROI. Выберите Анализ (ru) Анализ частиц (рисунок 3N). На размер (дюйм): напишите 1'20. Держите единицу пикселей неконтролируемой, проверьте дисплей, обобщить и добавить к менеджеру,и нажмите Ok. Резюме окно будет всплывающее и дать количество очков(Рисунок 3P). Копировать и вставить информацию в лист данных.
  18. Выберите плагины NND. Окно NND будет всплывающее(Рисунок 3 "). Копируйте/вставьте всю информацию в лист данных. Каждое число представляет расстояние, которое каждая микроглия имеет до ближайшей соседней микроглии.
  19. Вернитесь к пороговому окну и сдвиньте первый бар вправо (пороговое значение 255 в обоих барах), что оставит все белые точки видимыми, появляясь белыми(рисунок 3M).
  20. Выберите Анализ (ru) Анализ частиц. Резюме окно, которое обеспечивает количество очков будет всплывающее(Рисунок 3P). Копировать и вставить информацию в лист данных.
  21. Перейдите к менеджеру ROI, выберите все точки, нажмите правой кнопкой мыши и сохраните имя изображения. Это позволит сохранить все точки в почтовом файле(рисунок 3L). Выберите файл Сохранить как,и сохранить файл с именем, которое позволяет идентифицировать анализируемое изображение.
  22. Получить плотность микроглии (для каждого изображения), разделив количество IBA1 '/TMEM119 "двойной положительные клетки на площадь рентабельности инвестиций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения для каждой картины могут быть усреднена для каждого животного. Данные могут быть представлены как средняя - стандартная ошибка средней (SEM) всех животных.
  23. Определите NND, получив среднее значение значений NND всех клеток TMEM119.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в качестве среднего - SEM всех животных.
  24. Рассчитайте индекс интервала с помощью формулы: NND2 x плотность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в качестве среднего - SEM всех животных. Единицы для этого измерения будут произвольными единицами.
  25. Количественная микроглиальная группа путем выявления клеток, которые имеют NND под 12 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, 12 мкм выбран, так как это приблизительное расстояние между двумя непосредственно сопоставления микроглиальных клеток, касающихся друг друга с беседками. Если существует более трех микроглий, которые отвечают этому условию, вернитесь к изображению и проверьте, являются ли эти клетки частью одного или нескольких кластеров.
  26. После подтверждения количества кластеров напишите количество кластеров в таблице данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кластеров может быть разделено по области рентабельности инвестиций, чтобы получить плотность клеток / мм2 для каждого животного. Данные могут быть представлены в виде среднего SEM всех животных.
  27. Чтобы определить процент инфильтрации периферических миелоидных клеток, вычислите процент iBA1/TMEM119- клеток над общим числом миелоидных клеток (TMEM119/IBA1) - TMEM119-/IBA1) для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в качестве среднего - SEM всех животных.

5. Анализ морфологии

  1. Открыть FIJI/ImageJ.
  2. Откройте 40x изображение с помощью изображения J или FIJI. Появится окно всплывающих окон, спрашивающее, следует ли открывать изображения в стеке. Нажмите OK. Далее выберите Изображение Стеки Проект по открытию окна «Проекция». Включите все ломтики, от первого до последнего ломтика. Убедитесь, что максимальная интенсивность выбрана в соответствии с типом проекции,и нажмите OK
  3. Нажмите на новое окно с проектом «К». Выберите изображение Цвета Разделение каналов. Проведите следы на изображениях канала IBA1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие каналы (TMEM119 и DAPI) могут быть открыты и консультироваться по мере необходимости во время микроглиального анализа морфологии.
  4. В баре меню выберите Анализ Набор измерений. Проверьте площадь, Центр, и периметр. На вкладке Перенаправить на, выберите открытый файл(рисунок 3K).
  5. Установите шкалу, описанную в шагах 4.2.
  6. Для измерения размера сомы в канале IBA1, нарисуйте грубый периметр сомы с помощью инструмента выбора от руки(рисунок 3D).
  7. Включите инструмент чистки выбора, дважды нажав на овальный инструмент на панели инструментов, а затем проверь Включить поле кисти выбора (Рисунок 3G). Выберите размер кисти выбора от 10 до 20(рисунок 3B).
  8. Используя кисть выбора, отрегулируйте след, чтобы наилучшим образом соответствовать соме. Масштабирование позволит точность во время этого шага(Рисунок 2I).
  9. Нажмите на клавишу T, чтобы добавить след сомы к менеджеру roI(рисунок 3L).
  10. Выберите Анализ (ru) Измерьте или нажмите клавишу M. Окно результатов всплывет. Копировать и вставить результаты на листе данных(рисунок 3R).
  11. Чтобы сохранить информацию о области сомы, перейдите в окно менеджера ROI, нажмите на рентабельность инвестиций, измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, укажите, что след для сомы, а затем сохраните файл.
  12. Для измерения области беседки в канале IBA1 нажмите на микроглиальную оконечность процесса с помощью инструмента выбора полигона, который запустит форму полигона(рисунок 3C).
  13. Следуя советам микроглиальных процессов, обойти микроглии, нажав на кончики каждой конечности процесса, чтобы сформировать полигон, который наилучшим образом представляет область, покрытую микроглиальными арборизациями (Рисунок 2DЗ.Х.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полигон соединяет все конечности микроглиального процесса. Линии, образующие полигон, никогда не должны пересекаться. При нажатии вокруг микроглиального процесса отзыв, будьте осторожны, чтобы избежать отрезать любую часть процесса. Иногда полезно добавить дополнительные очки, чтобы обойти процесс. Количество точек, формирующих полигон, напрямую не связано с количеством дистальных процессов и, таким образом, не имеет значения для исследования.
  14. Чтобы закрыть полигон, нажмите на отправную точку полигона.
  15. Нажмите на клавишу T, чтобы добавить след менеджера roI(рисунок 3L). Выберите Анализ (ru) Измерьте или нажмите клавишу M. Окно результатов всплывет. Копировать и вставить результаты на листе данных(рисунок 3R).
  16. Чтобы сохранить информацию о области беседки, перейдите в окно менеджера ROI, нажмите на рентабельность инвестиций, измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, укажите для беседки, а затем сохраните файл.
  17. Определите область сомы путем усреднения всех сома областях для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде среднего - SEM всех животных.
  18. Определите область беседки, усреднев все области беседки для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде среднего - SEM всех животных.
  19. Рассчитайте индекс морфологии с помощью формулы сома области / области arborization для каждой микроглиальной клетки и в среднем на животное.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде среднего - SEM всех животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показана сомаркировка микроглии с использованием IBA1 и TMEM119 в корональном разделе суставного гиппокампа, изображенного в 20x флуоресценционной микроскопией. Успешное окрашивание показывает микроглиальные клеточные тела и их тонкие процессы(рисунок 1АКС). Это окрашивание позволяет определить микроглиальную плотность и распределение и идентификацию микроглиальных кластеров(рису...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол можно разделить на две критические части: качество окрашивания и анализа. Если окрашивание не является оптимальным, оно не сможет представлять микроглиальные клетки адекватно, тем самым влияя на плотность, распределение и измерения морфологии. Кроме того, доля инфильтрации периферических миелоидных клеток может быть занижена. Это оптимизированная версия протокола окрашивания, но есть несколько факторов, которые могут привести к неоптимальным изображениям. Даже если перфузия животного не включена в этот прот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Натали Верно за ее руководство и помощь в проведении экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Эммануэль Планель и Серж Ривест за использование их флуоресценции и конфокальных микроскопов, соответственно. Эта работа частично финансировалась за счет стипендий От Мексиканского совета по науке и технике (CONACYT; F.G.I), Фонда Фамиль-Чокетт и Центра тематика де речерче-н-р неврологии (CTRN; к К.П.), Фонды де Рехерче дю Квебек - Санте (до М.Б.), и Шастри Индо-канадский институт (к KB), а также Грант Discovery от естественных наук и инженерных исследований Совета Канады (NSERC) в M.E.T. M.E.T. имеет канадский научно-исследовательский кафедры (Tier II) нейроиммунной пластичности в области здравоохранения и терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouseInvitrogen/ThermofisherA21202
Alexa Fluor 568 козий анти-кроликInvitrogen/ThermofisherA11011
Biolite 24 Well multidish ThermoFisher930186
бычья сыворотка альбуминEMD Millipore Corporation2930
Лимонная кислотаSigma-AldrichC0759-500G
DAPI Краситель нуцелеиновой кислотойInvitrogen/ThermofisherMP 01306
Тонкая кистьХудожественный магазин
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Желатин из кожи холодноводной рыбыSigma-AldrichG7765
Микроскоп Защитное стеклоFisher Scientific1254418
Микрослайды положительно заряженныеVWR48311-703
Моноклональная мышь Anti-IBA1MilliporeMABN92
Na2H2PO4· H2OBioShop Canada Inc.SPM306, SPM400
Na2HPO4BioShop Canada Inc.SPD307, SPD600
NaBH4Sigma-Aldrich480886
NaClFisher ScientificS642500
Нормальная ослиная сыворотка (NDS)Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.017-000-121
Нормальная козья сыворотка (NGS)Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.005-000-121
Парапленка-МПарапленкаPM-999
Кролик моноклональный Анти-TMEM119Abcamab209064
Реципрокная встряхивающая ванна модель 25Прецизионнаянаучно-трансферная
пипетка
Трис буфер гидрохлоридаBioShop Canada Inc.TRS002/TRS004
Тритон-Х-100Сигма-ОлдричТ8787
Твин 20Сигма-ОлдричП7949-100МЛ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359(2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915(2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Теги

TMEM119IBA1ImageJ

Похожие статьи