Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Cytofast — это инструмент визуализации, используемый для анализа результатов кластеризации. Cytofast можно использовать для сравнения двух методов кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. Cytofast может быстро генерировать количественный и качественный обзор данных массовой цитометрии и выявить основные различия между различными алгоритмами кластеризации.
Сложность данных, генерируемых массовой цитометрией, потребовала новых инструментов для быстрого визуализации аналитических результатов. Методы кластеризации, такие как Cytosplore или FlowSOM, используются для визуализации и идентификации клеточных кластеров. Для анализа ниже по течению, недавно разработанный пакет R, Cytofast, может генерировать быструю визуализацию результатов от методов кластеризации. Цитофаст учитывает фенотипическую характеристику клеточных кластеров, вычисляет изобилие клеточного кластера, затем количественно сравнивает группы. Этот протокол объясняет применение Cytofast к использованию данных массовой цитометрии на основе модуляции иммунной системы в микроокружении опухоли (т.е. естественный ответ клетки убийцы )) на вызов опухоли следуют иммунотерапии (PD-L1 блокады). Демонстрация полезности Cytofast с FlowSOM и Cytosplore показано. Cytofast быстро генерирует визуальные представления групповых групповых групповых иммунных клеток и корреляции с составом иммунной системы. Различия наблюдаются в анализе кластеризации, но разделение между группами видно с помощью обоих методов кластеризации. Cytofast визуально показывает модели, индуцированные PD-L1 лечения, которые включают в себя более высокое изобилие активированных подмножеств НК ячейки, выражая более высокую интенсивность активации маркеров (т.е., CD54 или CD11c).
Массовая цитометрия (цитометрия во время полета, или CyTOF) позволяет обнаружить широкий спектр внутриклеточных или внеклеточных биомаркеров в миллионах одиночных клеток. Высокомерный характер данных масс-цитометрии требует определенных инструментов анализа, таких как методы кластеризации клеток, такие как SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Фенограф4, VorteX5, и эшафот карты6. Кроме того, различные методы сокращения размерности были разработаны (т.е. основной анализ компонентов (PCA)7, t-распределенный стохастический сосед встраивания »t-SNE»8, иерархический стохастический сосед встраивания »HSNE»9, равномерное многообразное приближение и проекция »UMAP»10, и диффузионные карты11)для улучшения скорости измерения.
Анализ высокомерных потоков и массовых цитометрических данных часто не имеет автоматических процессов для проведения статистических тестов на кластерной частоте и связи с клиническими исходами. Ранее мы разработали R-рабочий процесс, известный как Cytofast12, который позволяет визуальный и количественный анализ вниз по течению методов кластеризации Cytosplore или FlowSOM.
Описанный здесь протокол разъясняет использование Cytofast в R и показывает, как генерировать количественные и качественные тепловые карты и графики. Кроме того, он облегчает определение связей между наблюдаемыми фенотипами иммунных и клиническими исходами. В настоящем докладе также описывается анализ конкретного набора данных масс-цитометрии с использованием двух различных процедур кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. При использовании Cytofast с обоими методами кластеризации, соответственно показано, что фенотип активации НК-клеток находится под влиянием блокады контрольно-пропускного пункта PD-L1.
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по экспериментам на животных LUMC и были выполнены в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных LUMC в соответствии с руководящими принципами голландских и европейских комитетов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментальной настройки, C57BL/6 мышей были подкожно привиты на правом фланге с опухолью толстой кишки MC38 при концентрации 0,3 х 106 клеток / 200 Л фосфат-буферного солима (PBS). Через 10 дней, когда опухоли были ощутимы, мышей лечили PD-L1 блокирующими антителами (клон MIH-5, 200 мкг/мышь, внутриперитонеальная инъекция) или подвергались инсценировке. Опухоли были resected 3 дня спустя после инъекции PD-L1, обработанные ex vivo, и проанализированы CyTOF массовой цитометрии с использованием 38 маркеров13.
1. Оборудование и программное обеспечение для анализа данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте компьютер (Windows 7 или новее) и процессор I5 на 2,4 ГГц или эквивалент, установленная память оперативной памяти 6 ГБ, и 10 ГБ свободного пространства жесткого диска. Пакет R Cytofast использует существующие функции: в основном flowCore, pheatmapи ggplot. Командные строки, которые будут выполняться в R, включены в протокол. Ресурс для Инструкций R можно найти по адресу https://education.rstudio.com/.
2. Создание кластеров
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продемонстрировать два метода кластеризации Cytosplore и FlowSOM с Cytofast, НК-клетки (CD161)в микро-окружающей среды опухоли 3 дня после лечения PD-L1 анализируются.
3. Визуализация: Анализ кластеризации после обработки
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является методом, который является общим для обоих методов кластеризации. Таким образом, он может быть выполнен после кластеризации либо с FlowSOM или Cytosplore.
Рабочий процесс Cytofast (рисунок 1) предназначен для обеспечения количественного и качественного обзора данных, первоначально сгруппированных программным обеспечением анализа (т.е. FlowSOM или Cytosplore). Cytofast выполняет несколько возможных выходов, включая тепловую карту всех кластеров, определенных в анализе и основанных на выражении маркеров(рисунок 2 и рисунок 3). Дендрограмма сверху представляет иерархическое сходство между идентифицированными кластерами. Верхняя панель отображает другую тепловую карту, показывающую относительное количество соответствующих подмножеств в каждом образце. Дендрограмма справа показывает сходство между образцами и основана на иерархической кластеризации, выполняемой на евклидовых расстояниях между образцами. Комбинированные тепловые карты показаны для FlowSOM, за которымследуют Cytofast на рисунке 2 и для Cytosplore, за которым следуют Cytofast на рисунке 3. Cytofast также может быть использован для представления данных количественно и отображения результатов в boxplots (с помощью функции cytoBoxplots), как показано на рисунке 4 и рисунке 5.
Аналогичные кластеры были обнаружены между двумя различными методами (например, кластер 8 из Cytosplore соответствует кластеру 10 из FlowSOM),и совместное выражение некоторых ингибирующих маркеров, таких как PD-1 и LAG-3, все еще было видно в обоих методах). Оба метода кластеризации позволили дискриминации между PD-L1 против. PBS лечил мышей. В отличие от этого, некоторые различия между обоими методами могут быть выделены. FlowSOM идентифицирует 2 кластера (MHC-II)в то время как Cytosplore показывает только один кластер (MHC-IIзум). Это связано с первоначальной стратегией gating, в которой НК-клетки были вручную закрыты на клетки CD161, а затем дальнейшей обработки FlowSOM. Тем не менее, Cytosplore автоматически закрытых ячеек от CD45- населения на первом уровне HSNE, которые затем были сгруппированы в более высоком иерархическом уровне. Таким образом, Cytosplore определил подмножества клеток НК более точно, чем то, как ручной gating сосредоточены на CD161. Тем не менее иерархическая кластеризация образцов была сохранена, как показано в дендрограмме справа, что свидетельствует о том, что сегрегация между двумя группами (PD-L1 и PBS) не зависит от выбранного метода кластеризации.
Количество кластеров можно определить вручную с помощью обоих методов. Cytofast позволяет пользователю оценить неоднородность своих данных и может дать представление о том, как выбрать количество кластеров, в которые данные должны быть разделены. Другие функции включены в пакет Cytofast, такие как функция msiPlot (шаг 3.4.2), показывающий средний график интенсивности сигнала (MSI) каждого маркера на группу(рисунок 6 и рисунок 7). Эта функция позволяет обнаруживать глобальные изменения, такие как увеличение экспрессии CD54 или CD11c в НК-клетках группы PD-L1. Дополнительные функции могут быть включены в пакет Cytofast, такие как отображение данных в барных графиках и других методах представления данных. Последнее требует добавления инструментов ggplot, которые могут быть сгенерированы R.
Рисунок 1: Рабочий процесс пакета Cytofast. Данные были получены с помощью массовой цитометрии из опухоли через 3 дня после лечения иммунотерапией или не лечиться. Были сравнены две различные методы кластеризации: Cytosplore и FlowSOM. Cytofast был использован для визуализации различий между двумя методами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обзор кластера и изобилие кластеров в группе, как анализируется Cytofast после Cytosplore. Тепловая карта всех нк-клеточных кластеров (CD161- клетки, автоматически определяемые Cytosplore),которые были определены через 3 дня после иммунотерапии (PD-L1). Данные, показанные на основе кластеризации Cytosplore и объединены из необработанных и PD-L1 обработанных групп. Уровни маркера выражения ArcSinh5 отображаются в радужной шкале. На нижней панели относительное изобилие каждого образца представлено по зеленой и фиолетовой шкале. Дендрограмма справа представляет сходство между образцами на основе частот подмножеством. Шкала частот представляет дисперсию среднего. Низкая или высокая частота представлена зеленым или фиолетовым цветом, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обзор кластера и изобилие кластеров в группе, как анализируется Cytofast после FlowSOM. Тепловая карта всех нк-клеточных кластеров (предварительно загнано на CD161и события), которые были выявлены через 3 дня после иммунотерапии (PD-L1). Показанные данные основаны на кластеризации FlowSOM и объединены из необработанных и PD-L1 обработанных групп. Уровни маркера выражения ArcSinh5 отображаются в радужной шкале. На нижней панели относительное изобилие каждого образца представлено по зеленой и фиолетовой шкале. Дендрограмма справа представляет сходство между образцами на основе частот подмножеством. Шкала частот представляет дисперсию среднего. Низкая или высокая частота представлена зеленым или фиолетовым цветом, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Цитофаст представление с boxplots кластеров определяется Cytosplore. Частота каждого кластера представлена в почтовом участке, разделенном на две группы (PBS и PD-L1). Одна индивидуальная точка соответствует одной мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представление Cytofast с boxplots кластеров, определенных FlowSOM. Частота каждого кластера представлена в почтовом участке, разделенном на две группы (PBS и PD-L1). Одна индивидуальная точка соответствует одной мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Распределение участков интенсивности сигнала из НК-клеток, автоматически закрытых Cytosplore. Распределение интенсивности сигнала отображается в гистограмме для трех конкретных маркеров: CD45, CD11c и CD54. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Распределение участков интенсивности сигнала из НК-ячеек, автоматически закрытых FlowSOM. Распределение интенсивности сигнала отображается в гистограмме для трех конкретных маркеров: CD45, CD11c и CD54, разделенных группами PBS и PD-L1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительные файлы 1.1-1.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительные файлы 2.1-2.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительные файлы 4.1-4.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Авторам нечего раскрывать.
Cytofast — это инструмент визуализации, используемый для анализа результатов кластеризации. Cytofast можно использовать для сравнения двух методов кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. Cytofast может быстро генерировать количественный и качественный обзор данных массовой цитометрии и выявить основные различия между различными алгоритмами кластеризации.
Мы признаем финансирование европейской комиссией премии H2020 MSCA по предложению No 675743 (ISPIC). Мы благодарим Тетье ван дер Слуис и Ирис Пардьек за тестирование протокола.
| Компьютер | Dell | NA | NA |
