Методическая статья

Изображение Dpp Релиз из drosophila крыла диска

DOI:

10.3791/60528

⸱

30 октября 2019 г.

 , 
1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сроки воздействия лигандов могут повлиять на их последствия для развития. Здесь мы покажем, как изображение выпуска drosophila кости морфогенетического белка (BMP) называется Dpp из клеток крыла диска.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансформирующая сверхсемейная группа Фактор роста (TGF-я) имеет важное значение для раннего эмбрионального узорства и развития взрослых структур в многоклеточных организмах. Суперсемейка TGF-я включает в себя TGF-я, костяного морфогенетического белка (BMPs), активицинов, факторов роста и дифференциации, и нодаль. Давно известно, что количество лиганда, подвергаемого воздействию клеток, имеет важное значение для его воздействия. Считалось, что градиенты концентрации на длинных дистанциях создали эмбриональную модель. Однако в последнее время стало ясно, что сроки воздействия этих лиганд также имеет важное значение для их вниз по течению транскрипционных последствий. Суперсемейная лига н.е. TGF-я не может иметь следствие развития до тех пор, пока не высвобождается из клетки, в которой она была произведена. До недавнего времени было трудно определить, когда эти лиганды были освобождены из клеток. Здесь мы покажем, как измерить высвобождение Дрозофилы БМП под названием Decapentaplegic (Dpp) из клеток крыла примордия или диска крыла. Этот метод может быть изменен для других систем или сигнализации лигандов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфогенетические белки костей (БМП) необходимы для раннего эмбриогенеза и узорства взрослых структур. BMPs производятся и выделяются, чтобы повлиять на транскрипцию генов-мишеней, необходимых для роста и дифференциации клеток в ответных клетках. Decapentaplegic (Dpp) является Drosophila омолог БМП4, что важно для развития эмбриональных и взрослых структур, как крыло1,2,3,4. Несколько групп сосредоточили свое внимание на роли Dpp в узорчатом крыльях взрослых мух, потому что 1) крылья состоят из двух прозрачных листов эпителии с последовательной моделью venation, которые могут быть легко оценены; 2) диски крыла также разумно плоские, могут быть культивированы вне личинки, и просты для изображения и количественноразличия различий в шаблоне; и 3) развитие модели крыла чувствительно к Dpp так, что малые perturbations в тропе повлияют на картину venation крыла.

Dpp производится в клетках, расположенных в передней/ задней границе диска крыла5,6,7,8. Dpp связывается с комплексом типа 1 и типа 2 серина / трионин киназы рецепторов9,10. После Dpp связывания, тип 2 рецепторфориды типа 1 рецептор, который затем фосфорилаты матерей против Dpp (Mad), Smad 1/5/8 омолог. Фосфорилированный SMAD набирает дополнительный co-Smad (Медея), который позволяет ему войти в ядро, где он регулирует целевые гены, что приводит к вниз по течению эффекты, такие как распространение или дифференциация4,11.

Недавно, Бейтс Лаборатория показала, что ненадлежащее освобождение Dpp в крыло диска может привести к снижению Mad фосфорилирования, снижение экспрессии генов цели, и крыло шаблонных дефектов12,13. Несколько ионных каналов влияют на развитие крыла Дрозофилы и связанных с ним структур14,15. Эти ионные каналы также могут быть вовлечены в выпуск Dpp. При определении механизма высвобождения морфогена важно, чтобы был метод визуализации событий релиза.

Доктора Аурелио Телеман и Стивен Коэн создали белок синтеза Dpp-GFP, который способен спасти потерю Dpp, что означает, что он биологически активен и высвобождается биологически значимым образом16. Здесь мы описываем, как мы визуализировать события выпуска Dpp с помощью этого Dpp-GFP. Этот белок синтеза особенно полезен, потому что GFP является рН чувствительным таким образом, что, когда он находится в кислых пузырьков, флуоресценция закаляется17. Поэтому, когда белок, помеченный GFP, высвобождается из везикли в более нейтральную внеклеточную среду, интенсивность флуоресценции GFP увеличивается на17. Мы воспользовались чувствительностью pH GFP, чтобы определить, находится ли Dpp-GFP в кислых пузырьках. Мы изображения дисков крыла, выражающих Dpp-GFP до и после добавления хлорида аммония, который нейтрализует внутриклеточные отсеки пузырьков18. Мы обнаружили значительное увеличение флуоресценции пунктуры после добавления хлорида аммония, предполагая, что внутриклеточные Dpp-GFP затушевывается до добавления хлорида аммония18. Мы пришли к выводу, что внутриклеточные Dpp-GFP находится в кислых мембранных отсеков, таких как пузырьки, и не утоляется при добавлении хлорида аммония, чтобы нейтрализовать рН внутриклеточных отсеков18. Это делает живую визуализацию Dpp-GFP полезным методом визуализации динамики Dpp в диске крыла Drosophila, поскольку он высвобождается из кислых отсеков во внеклеточной среде.

Здесь мы описываем метод, который мы используем для визуализации событий выпуска Dpp с помощью Dpp-GFP. Dpp-GFP может быть выражен в его родной шаблон в drosophila крыла дисков с использованием системы UAS-GAL419. Это метод, который был использован, чтобы определить, что Irk каналы воздействия Dpp релиз18. Мы проверили метод с помощью живых изображений z-stacks. Мы не видим Dpp-GFP puncta движущихся в плоскости фокуса в временных рядах, если мы приобрели в одной плоскости фокуса. Мы также не видим движения Puncta Dpp-GFP, если мы изображены в z-стеке. Мы пришли к выводу, что пунктта Dpp-GFP, увиденная с помощью этого метода, является событиями высвобождения, а не движением пузырьков внутриклеточного. Этот метод живой визуализации Dpp-GFP потенциально может быть использован для тестирования других модификаторов dpp релиз для их воздействия на динамику Dpp или может быть изменен, чтобы посмотреть на динамику других лигандов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сбор яиц для создания лари для вскрытия

  1. Крест 30-40 девственной самки Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu летает до 10-15 самцов Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые два генотипа, содержащие Dpp-GAL4 и UAS-Dpp-GFP, могут использоваться до тех пор, пока балансеры имеют личинок маркеров, позволяющих подбирать соответствующее потомство во время личиночной стадии.
  2. Чтобы собрать яйца, переверните скрещенных мух в свежий флакон с едой и позвольте им заложить 3-4 ч, прежде чем удалить их из флакона. Для поощрения откладки яиц, небольшое количество дрожжевой пасты из гранулированных дрожжей, смешанных с небольшим количеством воды могут быть добавлены в верхней части пищи, прежде чем мухи вводятся в флакон. Такой же набор скрещенных мух можно хранить и использовать на срок до 7 дней коллекции яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой стандартный рецепт питания Drosophila кукурузной муки должен быть приемлемым. Используется здесь рецепт питания, описанный Hazegh и Reis20.
  3. Держите флаконы коллекции яиц при 25 градусах по Цельсию в течение примерно 144 ч, пока личинки не будут на третьем этапе instar (блуждающих).
  4. Для выбора подходящих личинок для вскрытия (тех, которые выражают как Dpp-GAL4, так и UAS-Dpp-GFP) сначала выберите личинки, которые не являются ТБ. Эти личинки будут нормальной длины, а не короткие и жирные.
  5. Среди личинок, не относящих туберкулез, будут личинки, выражающие CyO-GFP и личинки, выражающие Dpp-GFP. Чтобы выбрать Dpp-GFP, выражающий личинки, просмотрите их под флуоресценцией стереомикроскоп. В то время как Dpp-GFP и CyO-GFP, выражающие личинку, будут иметь некоторую флуоресценцию GFP, Dpp-GFP, выражающие личинки, можно отличить в том, что GFP ограничен дисками крыла, а флуоресценция гораздо менее яркая, чем CyO-GFP, выражающая личинки. Выберите эти менее яркие личинки для вскрытия.

2. Подготовка решения для личинки изображения и вскрытия

  1. Для живой визуализации крыльев дисков, подготовить модифицированные HL3 media21 (70 мм NaCl, 5 мм KCl, 1,5 мм CaCl2 дигидрат, 4 мМ MgCl2, 10 мм NaHCO3, 5 мм трегалозы дигидрат, 115 мм сахароза, 5 мм HEPES). Это носители позволяет крыло диска, чтобы быть в живых для изображения21.
  2. Отрегулируйте pH до 7.1 с помощью HEPES и профильтруйте фильтром 0,22 мкм. Используйте этот носители как для вскрытия диска крыла, так и в качестве монтажного носителя для живой визуализации.

3. Подготовка слайдов для монтажа диска крыла

  1. Поместите два куска бесцветной двусторонней ленты шириной через слайд микроскопа, оставляя пространство около 5 мм между ними. Куски ленты должны быть достаточно длинными, чтобы концы ленты лежали заподлицо с краями слайда микроскопа.
  2. Используйте плоский край (например, конец ручки пары рассекающих щипцы), чтобы прижать ленту к слайду, чтобы никакие носители не могли просачиваться под ним.
  3. Поместите 25 зл модифицированных носителей HL3 между двумя кусками ленты. Диск крыла будет установлен в этой капле носителя между кусками ленты, так что лента предотвращает крышку от дробления диска (Рисунок 1A).

4. Рассекание и монтаж дисков крыла для визуализации

  1. Вскрыть личинки в подготовленных модифицированных HL3носителей 26.
  2. Аккуратно разрыв личинок пополам с помощью двух пар щипцы и отбросить заднюю половину личинки.
  3. Возьмитесь за середину передней половины личинки одной парой щипцы и использовать другую пару закрытых щипцы, чтобы подтолкнуть рот крючки обратно в личинки, пока личинка полностью перевернуты.
  4. Диски крыла можно легко найти, глядя на острые изгибы в двух темных цветных первичных ветвей трахеи, которые проходят по обе стороны от личинок. Диски крыла лежат прямо под этими изгибами в трахее в перевернутой личинке.
  5. Аккуратно снимите диски крыла и перенесите их в 25 л носителей HL3 на подготовленном слайде микроскопа. Важно, чтобы убедиться, что никакие части трахеи не остаются прикреплены к расчлененных дисков крыла, поскольку это может привести к дискам плавать, что затрудняет визуализацию.
  6. Упорядочить диск крыла так, что peripodial сторона крыла мешок сталкивается вверх от микроскопа слайд с диском лежал плоский (см. Рисунок 1A,B).
  7. Обложка крыла диска и ленты с крышкой и печать coverslip с помощью лака для ногтей. Как только польский высохнет, немедленно перейдите к изображению шаги ниже.

5. Освобождение изображений Dpp

  1. Изображение установленного диска крыла с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с 40-м масляным объективом и лазером 488 нм. Dpp-GFP должен появиться как полоса флуоресценции GFP вниз по центру диска крыла с небольшой puncta Dpp-GFP освобождается от этой центральной полосы клеток.
  2. Собирайте изображения со скоростью 2 Гц в течение 2 минут, чтобы визуализировать выпуск Dpp. Для достижения наилучших результатов установите лазер в обстановке, достаточно сильной, чтобы получить четкое изображение клеток Dpp-releasing, чтобы избежать чрезмерного отбеливания во время сбора изображений. Изображения могут быть собраны в виде временных рядов, которые затем могут быть экспортированы в виде файлов AVI (без сжатия, 3 кадра/с) для получения видеофайлов релиза Dpp.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты работы этого протокола. Когда протокол успешен, Dpp-GFP можно рассматривать как полосу вниз по центру диска крыла с ядрами видимыми как нефлуоресцентные круги в пределах dpp-GFP области (Рисунок 2). Dpp-GFP релиз виден как флуоресцентные puncta, которые появляются и исчезают. Мы наблюдали, как флуоресценция Dpp-GFP появлялась и исчезала в клеточных телах и вдали от клеточных тел. Dpp сигнализации зависит от actin...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BMPs, такие как Dpp сделать их значительное влияние, когда они связывают комплекс мембранных связанных рецепторов, чтобы вызвать каскад внутриклеточной сигнализации в соседних или, видимо, далеких клеток. Лаборатория доктора Томаса Корнберга показала, что клетки, которые производят контактные клетки сигнала Dpp, которые получают сигнал, используя на основе актина тонкие фипаподия-подобные структуры, называемые цитонемы15,24,25. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Саралу Прадхан за работу над более ранней версией этого протокола. Мы хотели бы поблагодарить NSF-IOS 1354282 за финансирование в то время как мы разработали этот протокол. Мы хотели бы поблагодарить NIH-NIDCR RO1DE025311 за финансирование нашей лаборатории в настоящее время.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пекарские дрожжиRed Star   
CaCl2 дигидратFisher ScientificC79-500
CoverslipsVWR484-457
Двусторонняя лентаScotch
Drosophila Agar Type IIApex66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb HuЭта акция скоро будет доступна в Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb HuЭтот запас скоро будет доступен в Bloomington Drosophila Stock Center
Dumont Tweezers #5World Precision Instruments500233Щипцы для препарирования
HEPESSigma AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
Light Corn SyrupKaro
Солодовый экстрактBreiss
MgCl2FisherScientificAC223210010
Предметные стеклаSigma AldrichS8400
NaClFisherScientific S271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
Лак для ногтейElectron Micsroscopy Sciences72180
Пропионовая кислотаVWRU330-09
Соевая мукаADM Специальные ингредиенты062-100
СахарозаFisher ScientificS5-3
СахарозаFisherS512
TegoseptGenesee Scientific20-259
Трегалоза дигидратChem-Impex Интернэшнл, Инк.00766
Жёлтая кукурузная мукаQuaker
Zeiss LSM 780 конфокальный микроскопZeissMicroscope для визуализации в реальном времени
Zeiss SteREO Discovery.V8 микроскопZeissMicroscope для вскрытия

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
  2. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
  3. Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
  4. Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
  5. Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
  6. Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
  7. de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
  10. Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
  11. Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
  12. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  13. Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
  14. George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
  15. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  16. Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
  17. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  18. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  19. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  20. Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).
  21. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  22. Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
  23. Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
  24. Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
  25. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  26. Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BMPGFP

Похожие статьи