Мы описываем платформу, которая использует библиотеку изогенных устойчивых к антибиотикам Escherichia coli для дерепликации антибиотиков. Идентичность антибиотика, вырабатываемого бактериями или грибами, может быть выведена ростом кишечной палочки, выражающей свой ген резистентности. Эта платформа является экономически эффективной и действенной по времени.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Антибиотическая дерепликация с использованием платформы устойчивости к антибиотикам
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Одной из основных проблем в поиске новых антибиотиков из экстрактов натуральных продуктов является повторное открытие общих соединений. Для решения этой проблемы, dereplication, который является процесс идентификации известных соединений, осуществляется на образцах, представляющих интерес. Методы дерепликации, такие как аналитическое разделение с последующей масс-спектрометрией, отнимают много времени и ресурсоемки. Для улучшения процесса дерепликации мы разработали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP). ARP представляет собой библиотеку из примерно 100 генов устойчивости к антибиотикам, которые были индивидуально клонированы в кишечную палочку. Эта коллекция штаммов имеет много применений, в том числе экономически эффективный и поверхностный метод для антибиотиков dereplication. Этот процесс включает в себя брожение антибиотикопроизводящих микробов на поверхности прямоугольных блюд Петри, содержащих твердую среду, тем самым позволяя секрецию и диффузию вторичных метаболитов через среду. После 6-дневного периода брожения микробная биомасса удаляется, а в блюдо Петри добавляется тонкая агар-накладка, чтобы создать гладкую поверхность и обеспечить рост штаммов индикатора кишечной палочки. Наша коллекция штаммов ARP затем прикрепляется на поверхность антибиотикосодержащей чашки Петри. Пластина следующий инкубируется на ночь, чтобы обеспечить рост кишечной палочки на поверхности наложения. Только штаммы, содержащие устойчивость к конкретному антибиотику (или классу), растут на этой поверхности, что позволяет быстро идентифицировать произведенное соединение. Этот метод успешно используется для выявления производителей известных антибиотиков и в качестве средства для выявления лиц, производящих новые соединения.
Введение
С момента открытия пенициллина в 1928 году натуральные продукты, полученные из экологических микроорганизмов, оказались богатым источником противомикробных соединений1. Приблизительно 80% антибиотиков натурального продукта получены из бактерий рода Streptomyces и других актиномицетов, в то время как остальные 20% производится грибковых видов1. Некоторые из наиболее распространенных антибиотиков леса, используемые в клинике, такие как к-лактамы, тетрациклины, рифамицины, и аминогликозиды, были первоначально изолированы от микробов2. Однако, в связи с ростом бактерий с множественной лекарст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка E. coli Библиотека Глицерол запасов (от Агар Сланц)
- Полоса ARP / MARP E. coli штаммов из лисогенного бульона (LB) агар наклоняется на Петри блюда, содержащие LB агар и соответствующий выбираемый маркер (Таблица 1).
- Подготовка культур для каждого из штаммов кишечной палочки путем прививки 3 мл LB, содержащий соответствующий выбираемый маркер с одной колонией. Выращивайте на ночь при 37 градусах Цельсия с аэрацией (250 об/мин).
- Смешайте 800 л культуры и 200 л стерильного 80% глицерола в кривиальной 1,8 мл. Смешайте, инвертируя трубки 3-4 раза, и храните при -80 градусов по Цельсию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следующие результаты были получены, когда коллекция антибиотикообразующих штаммов, представляющих интерес, была дереплицирована с помощью ARP и/или MARP.
Диаграмма рабочего процесса dereplication ARP/MARP изображена на рисунке 1,а библиотечные карты пластины показаны на дополнительной рисунке 1 и дополнительной рисунке 2. Рисунок 2 демонстрирует положительный результат дерепликации, в котором экологич.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный выше протокол может применяться как к открытию новых противомикробных соединений, так и к адъювантам, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками для спасения их деятельности. Платформа использует высокую специфичность субстрата механизмов резистентности и их cognate антибиотики, чтобы дереплицировать соединения в сырых экстрактов природного продукта. Несмотря на то, что время, необходимое для подготовки пластин дерепликации, является длительным (2 недели), сам процесс дерепликации.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследования в лаборатории Райта, относящиеся к ARP/MARP, были поддержаны Исследовательским фондом Онтарио и канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FRN-148463). Мы хотели бы поблагодарить Соммера Чоу за содействие в расширении и организации библиотеки ARP.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Пленки для холодильного хранения | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ампициллин Натриевая соль | Био Магазин | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Бульон (катионно-скорректированный) | Бектон Дикинсон | 212322 | |
| BBL Фитон Пептон (Соитон) | Бектон Дикинсон | 211906 | |
| Карбонат кальция | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Аппликаторы с ватным наконечником | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1,8 мл mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Одноразовая пробирка для посева, 16 мм x 100 мм | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Этиловый спирт безводный | коммерческий спирт | P016EAAN | |
| стеклянных шариков, твердый | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Глицерин | био магазин | GLY001.4 | |
| Соляная кислота | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Мгновенная герметизация стерилизационного пакета | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Гептагидрат сульфата железа (II) | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Канамицина сульфат | био магазин | KAN201.50 | |
| LB Бульон Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Сульфат магния гептагидрат | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore мембранный фильтр, 0,45 &; m размер пор | Millipore-Sigma | HAWP00010 | рулон 10 футов, гидрофильный, белый, простой |
| Microtest Plate 96 лунка, круглое основание | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Нью-Брансуик Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Однолуночная пластина | Thermo Fisher Scientific | 264728 | с крышкой, стерильная, необработанная |
| чашка Петри 92 мм x 16 мм с кулачками | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Инструменты для закрепления ETH | Zurich-Custom | order | |
| Хлорид калия | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Картофельный крахмал | Насыпной амбар | 279 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Нитрат натрия | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Аппликаторы древесины | Dukal Corporation | 9000 | |
| Экстракт дрожжей | Fisher Scientific | BP1422-2 |
Ссылки
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening f....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
