Method Article

В экстракорпоральная стимуляция и визуализация внеклеточной ловушки релиз в дифференцированных человеческих моноцитов полученных макрофагов

DOI:

10.3791/60541

⸱

November 1st, 2019

 ,  ,  , 
1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол для обнаружения макрофагов внеклеточной ловушки (MET) производства в живой культуре клеток с помощью микроскопии и флуоресценции окрашивания. Этот протокол может быть расширен для изучения конкретных маркеров белка MET путем окрашивания иммунофлюоресценции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выброс внеклеточных ловушек (ЭТ) нейтрофилов был определен в качестве фактора, способствующего развитию заболеваний, связанных с хроническим воспалением. Нейтрофил ETs (NETs) состоят из сетки ДНК, гистоновых белков и различных грануловых белков (т.е. миелопероксидаза, эластаза и катепсина G). Другие иммунные клетки, включая макрофаги, также могут производить ЭТ; однако, в какой степени это происходит in vivo и играют ли макрофагвевные внеклеточные ловушки (МЕТ) роль в патологических механизмах, не были детально изучены. Чтобы лучше понять роль МЕТ в воспалительных патологиях, был разработан протокол для визуализации выпуска MET из первичных макрофагов человека in vitro, которые также могут быть использованы в экспериментах по иммунофлуоресценции. Это позволяет дальнейшую характеристику этих структур и их сравнение с ЭТ, выпущенными от нейтрофилов. Макрофаги, полученные из моноцитов (HMDM), производят MET при воздействии различных воспалительных стимулов после дифференциации на провоспалительный фенотип M1. Высвобождение МЕТ может быть визуализировано с помощью микроскопии с помощью зеленого флуоресцентного пятна нуклеиновой кислоты, которое является impermeant для живых клеток (например, SYTOX зеленый). Использование свежеизолированных первичных макрофагов, таких как HMDM, выгодно в моделировании воспалительных явлений in vivo, которые имеют отношение к потенциальным клиническим применениям. Этот протокол также может быть использован для изучения met релиз из человеческих моноцитов клеточных линий (например, THP-1) после дифференциации в макрофаги с phorbol myristate ацетат или другие макрофаг клеточные линии (например, морин макрофаг-как J774A.1 клеток).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высвобождение ETs от нейтрофилов было впервые определено как врожденный иммунный ответ, вызванный бактериальной инфекцией1. Они состоят из позвоночника ДНК, к которому связаны различные гранулированные белки с антибактериальными свойствами, втомся нейтрофил эластаза и миелопероксидаза2. Основная роль нейтрофилов ETs (NETs) заключается в захвате патогенных микроорганизмов и содействовать их ликвидации3. Однако, в дополнение к защитной роли ЭТ в иммунной защите, все большее число исследований также обнаружили роль в патогенезе болезни, особенно во время развития воспаления управляемых заболеваний (т.е. ревматоидного артрита и атеросклероз4). Высвобождение ETs может быть вызвано различными провоспалительными цитокинами, включая интерлейкин 8 (IL-8) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ)5,6, и локализованное накопление ETs может увеличить повреждение тканей и вызвать провоспалительный ответ7. Например, ETs были замешаны как играющие причинно-следственную роль в развитии атеросклероза8, содействие тромбозу9, и прогнозирование сердечно-сосудистого риска10.

В настоящее время признано, что в дополнение к нейтрофилов, другие иммунные клетки (т.е., тучные клетки, эозинофилы, и макрофаги) может также освободить ETs на воздействие микробной или про-воспалительной стимуляции11,12. Это может быть особенно важно в случае макрофагов, учитывая их ключевую роль в развитии, регуляции и разрешении хронических воспалительных заболеваний. Поэтому важно получить более глубокое понимание потенциальной взаимосвязи между выходом ET из макрофагов и развитием болезней, связанных с воспалением. Недавние исследования показали наличие МЕТ и NET в нетронутых человека атеросклеротических бляшек и организованныхтромбов 13. Аналогичным образом, METs были вовлечены в вождения травмы почек через регулирование воспалительных реакций14. Однако, в отличие от нейтрофилов, имеются ограниченные данные о механизмах формирования МЕТ из макрофагов. Недавние исследования с использованием человеческих моделей in vitro образования MET показывают некоторые различия в путях, участвующих в каждом типе клеток (т.е. в отношении отсутствия цитруллинации гистона с макрофагами)6. Тем не менее, некоторые из них показали, что NET релиз также может произойти в отсутствие гистон цитруллинации15.

Общая цель этого протокола заключается в предоставлении простого и прямого метода оценки выпуска MET в клинически релевантной модели макрофагов. Есть целый ряд различных моделей макрофагов in vitro, которые были использованы для изучения METs (т.е. линии моноцитов человека THP-1 и различных линий макрофагов murine)16. Есть некоторые ограничения, связанные с этими моделями. Например, дифференциация моноцитов THP-1 на макрофагы обычно требует грунтового шага, такого как добавление phorbol myristate acetate (PMA), который сам активирует белковую киназу C (PKC)-зависимые пути. Этот процесс, как известно, вызывает ET релиз4 и приводит к низкой базальной MET релиз из клеток THP-1. Другие исследования выявили некоторые различия в биоактивности и воспалительных реакций, установленных макрофагов in vivo по сравнению с PMA-обработанных клеток THP-117.

Аналогичным образом, поведение и воспалительные реакции различных макрофагов, похожих на минына, клеточные линии не полностью представляют спектр реакции первичных макрофагов человека18. Таким образом, с целью изучения образования макрофагов ET в клинических условиях, первичные человеческие моноциты полученных макрофагов (HMDMs), как полагают, более релевантной модели, а не моноцитные или мурин макрофаг-подобных клеточных линий.

ET релиз от M1 поляризованных HMDMs было продемонстрировано после воздействия этих клеток на ряд различных воспалительных стимулов, в том числе миелопероксидаза полученных окислительной гипохлорной кислоты (HOCl), PMA, TNF и IL-86. Описано здесь протокол для поляризации HMDMs на M1 фенотип и визуализировать последующее освобождение MET при воздействии этих воспалительных стимулов. PMA используется в качестве стимула MET релиз для облегчения сравнения с предыдущими исследованиями, которые использовали нейтрофилов. Важно отметить, что HOCl, IL-8 и TNF также используются для стимулирования выпуска MET, которые, как полагают, являются лучшими моделями воспалительной среды in vivo. Микроскопический метод визуализации ET релиз включает в себя окрашивание внеклеточной ДНК в живых клеточных культурах с помощью SYTOX зеленый, непроницаемый флуоресцентный зеленый нуклеиновой кислоты пятно, которое было успешно применено в предыдущих исследованиях нейтрофилов. Этот метод позволяет быстро и качественно оценить выпуск ET, но он не подходит в качестве отдельного метода для количественной оценки объема выпуска ET. Альтернативная методология должна использоваться, если требуется количественная оценка для сравнения масштабов выпуска ET в результате различных условий лечения или вмешательства.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HMDM были изолированы от человеческих баффи пальто препаратов, поставляемых банком крови с этики утверждения из Сиднея местного района здравоохранения.

1. Культура HMDM

  1. Изолировать моноциты из буйных препаратов пальто, подготовленных из периферической крови здоровых доноров человека с помощью коммерчески доступной подготовки к изоляции лимфоцитов, а затем контртекущие центробежные элутриации19, 20.
  2. Подтвердите наличие моноцитов путем цитоспиннинга и окрашивания с модифицированным пятном Giemsa для характеристики моноцитов19.
  3. При стерильных условиях отрегулируйте плотность моноцитов до 1 х 106 клеток/мл с помощью носителей RPMI-1640 без сыворотки. Добавьте 1 мл этой клеточной подвески к каждой скважине 12 хорошо пластины культуры ткани. Культура в клеточном инкубаторе при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO2 на 2 ч для содействия присоединению к пластине культуры тканей.
  4. В стерильных условиях, удалить клеточные носители и заменить полным RPMI-1640 культуры средств массовой информации, содержащие 10% (v/v) объединенных человеческой сыворотки и 20 мМ L-глютамин.
  5. Культура клеток при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO2 в клеточном инкубаторе в течение 8 дней, меняя носитель каждые 2 дня.

2. Поляризация HMDM

  1. В стерильных условиях подготовьте грунтовочные носители M1, добавив интерферон (IFN) и 20 нг/мл и липополисахарид (LPS; 1 мкг/мл) в полные средства культуры RPMI-1640. Подготовьте M2 грунтовки средств массовой информации, добавив интерлейкин 4 (IL-4; 20 нг/мл) для полного RPMI-1640 культуры средств массовой информации.
  2. В стерильных условиях, аспирные носители из тканевых культурных плит, которые содержат HMDM, которые были посеяны и культивированы, как описано в разделе 1.
  3. Тщательно промыть колодцы, содержащие клетки 3x со стерильными PBS (предварительно подогретый до 37 градусов по Цельсию), используя 1 мл aliquots PBS.
  4. Добавьте 1 мл либо m1 или M2 грунтовки средств массовой информации для каждого хорошо, содержащих HMDM (в зависимости от того, подходит для эксперимента).
  5. Инкубировать клетки в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO2 в клеточном инкубаторе.

3. Стимулирование HMDM, чтобы вызвать MET релиз

  1. В стерильных условиях подготовьте культурные носители, содержащие различные стимуляторы выпуска MET (в зависимости от того, что подходит для эксперимента) к полному медиа RPMI-1640: PMA (25 нм), рекомбинантный ТНФЗ (25 нг/мл) или рекомбинантный ИЛ-8 (50 нг/мл) ).
  2. Для экспериментов со стимуляцией HOCl, подготовить HOCl (200 мкм) в HBSS (предварительно подогретый до 37 градусов по Цельсию), непосредственно перед добавлением к клеткам. Убедитесь, что HOCl не подготовлен в полных носителях ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация запаса раствора HOCl количественно измеряет сяпучие абсорбции раствора на уровне 292 нм и рН No 116 и с использованием коэффициента вымирания 350 М-1см-121.
  3. После лечения поляризации, описанного в разделе 2, аспирировать клеточные носители из каждого колодца и тщательно мыть клетки 3x с 1 мл aliquots либо: стерильные PBS (для PMA, TNF и IL-8) или HBSS (для HOCl), которые были предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию.
  4. Для экспериментов с PMA, TNF или IL-8: добавьте 1 мл полного носителя, содержащего PMA, TNF или IL-8 после удаления PBS в заключительном этапе стирки.
  5. Для экспериментов с ТНФЗ инкубируйте клетки на 6 ч при 37 градусах По Цельсия при наличии 5% CO2 в клеточном инкубаторе. Для экспериментов с PMA и IL-8, инкубировать клетки для 24 h при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO2 в инкубаторе клетки.
  6. Для экспериментов с HOCl добавьте 1 мл HOCl в HBSS после удаления HBSS в заключительном этапе стирки. Затем инкубировать клетки в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO2 в клеточном инкубаторе.
    1. Тщательно аспирируйте супернатант клетки и мыть клетки 3x с 1 мл aliquots HBSS, как описано в шаге 3.3.
    2. После удаления HBSS с заключительного шага стирки, добавьте 1 мл полного НОСИТЕЛЯ культуры RPMI-1640. Затем инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO2 в клеточном инкубаторе.

4. Визуализация MET в культуре живых клеток

  1. Подготовка SYTOX зеленый краситель в HBSS в концентрации 40 мкм.
  2. В конце лечения, описанного в разделе 3, чтобы вызвать выброс MET, непосредственно добавить 25 зЛ из 40 мкм красителя к каждому хорошо, содержащему HMDM.
  3. Инкубировать клетки при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин в темноте.
  4. Поместите HMDM в колодцы культуры тканей на стадии микроскопа перевернутого флуоресцентного микроскопа для визуализации.
  5. Процедуры микроскопа
    1. Включите источник флуоресцентного света широкого спектра, источник яркого поля света и перевернутый микроскоп, установленный цифровой камерой с высоким разрешением (см. Таблица Материалов).
    2. Поверните колесо фильтра в положение "номер 2" для зеленой флуоресценции (возбуждение 504 нм, выбросы 523 нм) для визуализации зеленых окрашенных образцов, содержащихся в колодцах культуры тканей.
    3. Используя 5x цель, сосредоточить изображение с грубым фокусом, затем тонкой фокусировки ручки на микроскоп, пока изображение появляется резким, ясным и сосредоточены при просмотре через микроскоп окуляр.
    4. Переключите микроскоп в режим камеры.
    5. Запустите связанное программное обеспечение.
    6. Выберите вкладку Захвата на программном обеспечении.
    7. Нажмите кнопку Воспроизведения, чтобы просмотреть изображение и настроить тонкую ручку фокусировки на микроскопе до тех пор, пока изображение не появится резким, ясным и сосредоточенным в окне предварительного просмотра программного обеспечения.
    8. Нажмите кнопку захвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Захваченное изображение будет автоматически отображаться в сопроводительном программном обеспечении.
    9. В рамках программного обеспечения, нажмите Файл (ru) Сохранить как необходимый тип файла изображения.
    10. На микроскопе поверните колесо фильтра в положение "номер 5" для яркого поля изображения и повторите шаги 4.5.2-4.5.9 для получения соответствующего яркого изображения.
    11. Повторите шаги 4.5.2-4.5.10 по мере необходимости для последующего приобретения изображения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Яркие изображения, показывающие морфологические изменения HMDM в ответ на стимулы для дифференциации клеток, показаны на рисунке 1. M1 поляризованные макрофаги в результате экспериментов с HMDM, подвергшимися воздействию ИФНЗ и LPS, показали удлиненную и веретенцовую форму клеток, о чем свидетельствуют черные стрелки на рисунке 1 (средняя панель). Для сравнения, морфология поляризованных макрофагов M2 после воздействия HMDM на ИЛ-4 на 48 ч, как правило, круглая ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генерация и визуализация образования MET с использованием M1 дифференцированных HMDMs представляет собой новую модель in vitro, которая может быть полезна для исследования потенциальной патологической роли этих структур макрофагов, особенно при хронических воспалительных Условия. Он обеспечивает надежный протокол для стимуляции первичных макрофагов человека, чтобы освободить METs, которые также могут быть использованы в смежных исследованиях с человеческими моноцитами или мининовые линии макрофагов. Успешная реализация э...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Вечным грантом IMPACT (IPAP201601422) и Грантом Биомедицинского проекта Фонда Ново Нордиска (NNF17OC0028990). Кроме того, Y' признает получение австралийской премии аспирантуры от Университета Сиднея. Мы хотели бы поблагодарить г-на Пэта Пизансаракита и г-жу Морган Джонс за помощь в изоляции моноцитов и культуре тканей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Флуоресцентный источник света широкого спектра 120QEXFO Photonic Solutions, Торонто, Канадасерия x-cite Corning
CellBIND Multiple Well Plate (12 лунок)Sigma-AldrichCLS3336For Cell Culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)Polysciences Inc.24606Характеристика моноцитов
Ганкса сбалансированный раствор соли (HBSS)Thermo-Fisher14025050Для промывочных стадий и обработки HOCl
Хлорноватистая кислота (HOCl)Sigma-Aldrich320331Для стимуляции MET
Интерферон гаммаThermo-FisherPMC4031Для прайминга M1
Интерлейкин 4Integrated Sciencesrhil-4Для М2 прайминга
Интерлейкин 8Милтенил Биотек130-093-943Для стимуляции МЕТ
L-глутаминСигма-Олдрич59202СДобавлен в питательные среды
ЛипополисахаридИнтегр Наукиtlrl-eblpsДля М1 прайминг
ЛимфопрепAxis-Shield PoC AS1114544Для выделения моноцитов
Olympus IX71 инвертированный микроскопOlympus, Токио, Япония
Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma-AldrichP8139Для стимуляции MET
Фосфатный буферный раствор (PBS)Sigma-AldrichD5652Для этапов промывки
RPMI-1640 средыSigma-AldrichR8758Для клеточной культуры
SYTOX greenLife TechnologiesS7020Для MET визуализация
TH4-200 светлопольный источник светаOlympus, Токио, Япониясерия x-cite
Фактор некроза опухоли альфаLonza300-01A-50Для стимуляции MET

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639(2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111(2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Trap ReleaseHuman Monocyte derived MacrophagesM1 PolarizationSYTOX Green StainingFluorescence MicroscopyHypochlorous Acid StimulationPMA StimulationTNF Alpha StimulationInterleukin 8 StimulationMET Visualization

Related Articles