В экстракорпоральная стимуляция и визуализация внеклеточной ловушки релиз в дифференцированных человеческих моноцитов полученных макрофагов

Высвобождение ETs от нейтрофилов было впервые определено как врожденный иммунный ответ, вызванный бактериальной инфекцией¹. Они состоят из позвоночника ДНК, к которому связаны различные гранулированные белки с антибактериальными свойствами, втомся нейтрофил эластаза и миелопероксидаза^2. Основная роль нейтрофилов ETs (NETs) заключается в захвате патогенных микроорганизмов и содействовать их ликвидации³. Однако, в дополнение к защитной роли ЭТ в иммунной защите, все большее число исследований также обнаружили роль в патогенезе болезни, особенно во время развития воспаления управляемых заболеваний (т.е. ревматоидного артрита и атеросклероз⁴). Высвобождение ETs может быть вызвано различными провоспалительными цитокинами, включая интерлейкин 8 (IL-8) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ)^5,6, и локализованное накопление ETs может увеличить повреждение тканей и вызвать провоспалительный ответ⁷. Например, ETs были замешаны как играющие причинно-следственную роль в развитии атеросклероза⁸, содействие тромбозу⁹, и прогнозирование сердечно-сосудистого риска¹⁰.

В настоящее время признано, что в дополнение к нейтрофилов, другие иммунные клетки (т.е., тучные клетки, эозинофилы, и макрофаги) может также освободить ETs на воздействие микробной или про-воспалительной стимуляции^11,12. Это может быть особенно важно в случае макрофагов, учитывая их ключевую роль в развитии, регуляции и разрешении хронических воспалительных заболеваний. Поэтому важно получить более глубокое понимание потенциальной взаимосвязи между выходом ET из макрофагов и развитием болезней, связанных с воспалением. Недавние исследования показали наличие МЕТ и NET в нетронутых человека атеросклеротических бляшек и организованных^{тромбов 13}. Аналогичным образом, METs были вовлечены в вождения травмы почек через регулирование воспалительных реакций¹⁴. Однако, в отличие от нейтрофилов, имеются ограниченные данные о механизмах формирования МЕТ из макрофагов. Недавние исследования с использованием человеческих моделей in vitro образования MET показывают некоторые различия в путях, участвующих в каждом типе клеток (т.е. в отношении отсутствия цитруллинации гистона с макрофагами)⁶. Тем не менее, некоторые из них показали, что NET релиз также может произойти в отсутствие гистон цитруллинации¹⁵.

Общая цель этого протокола заключается в предоставлении простого и прямого метода оценки выпуска MET в клинически релевантной модели макрофагов. Есть целый ряд различных моделей макрофагов in vitro, которые были использованы для изучения METs (т.е. линии моноцитов человека THP-1 и различных линий макрофагов murine)¹⁶. Есть некоторые ограничения, связанные с этими моделями. Например, дифференциация моноцитов THP-1 на макрофагы обычно требует грунтового шага, такого как добавление phorbol myristate acetate (PMA), который сам активирует белковую киназу C (PKC)-зависимые пути. Этот процесс, как известно, вызывает ET релиз⁴ и приводит к низкой базальной MET релиз из клеток THP-1. Другие исследования выявили некоторые различия в биоактивности и воспалительных реакций, установленных макрофагов in vivo по сравнению с PMA-обработанных клеток THP-1¹⁷.

Аналогичным образом, поведение и воспалительные реакции различных макрофагов, похожих на минына, клеточные линии не полностью представляют спектр реакции первичных макрофагов человека¹⁸. Таким образом, с целью изучения образования макрофагов ET в клинических условиях, первичные человеческие моноциты полученных макрофагов (HMDMs), как полагают, более релевантной модели, а не моноцитные или мурин макрофаг-подобных клеточных линий.

ET релиз от M1 поляризованных HMDMs было продемонстрировано после воздействия этих клеток на ряд различных воспалительных стимулов, в том числе миелопероксидаза полученных окислительной гипохлорной кислоты (HOCl), PMA, TNF и IL-8⁶. Описано здесь протокол для поляризации HMDMs на M1 фенотип и визуализировать последующее освобождение MET при воздействии этих воспалительных стимулов. PMA используется в качестве стимула MET релиз для облегчения сравнения с предыдущими исследованиями, которые использовали нейтрофилов. Важно отметить, что HOCl, IL-8 и TNF также используются для стимулирования выпуска MET, которые, как полагают, являются лучшими моделями воспалительной среды in vivo. Микроскопический метод визуализации ET релиз включает в себя окрашивание внеклеточной ДНК в живых клеточных культурах с помощью SYTOX зеленый, непроницаемый флуоресцентный зеленый нуклеиновой кислоты пятно, которое было успешно применено в предыдущих исследованиях нейтрофилов. Этот метод позволяет быстро и качественно оценить выпуск ET, но он не подходит в качестве отдельного метода для количественной оценки объема выпуска ET. Альтернативная методология должна использоваться, если требуется количественная оценка для сравнения масштабов выпуска ET в результате различных условий лечения или вмешательства.

HMDM были изолированы от человеческих баффи пальто препаратов, поставляемых банком крови с этики утверждения из Сиднея местного района здравоохранения.

1. Культура HMDM

1. Изолировать моноциты из буйных препаратов пальто, подготовленных из периферической крови здоровых доноров человека с помощью коммерчески доступной подготовки к изоляции лимфоцитов, а затем контртекущие центробежные элутриации^{19, 20}.
2. Подтвердите наличие моноцитов путем цитоспиннинга и окрашивания с модифицированным пятном Giemsa для характеристики моноцитов¹⁹.
3. При стерильных условиях отрегулируйте плотность моноцитов до 1 х 10⁶ клеток/мл с помощью носителей RPMI-1640 без сыворотки. Добавьте 1 мл этой клеточной подвески к каждой скважине 12 хорошо пластины культуры ткани. Культура в клеточном инкубаторе при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO₂ на 2 ч для содействия присоединению к пластине культуры тканей.
4. В стерильных условиях, удалить клеточные носители и заменить полным RPMI-1640 культуры средств массовой информации, содержащие 10% (v/v) объединенных человеческой сыворотки и 20 мМ L-глютамин.
5. Культура клеток при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO₂ в клеточном инкубаторе в течение 8 дней, меняя носитель каждые 2 дня.

2. Поляризация HMDM

1. В стерильных условиях подготовьте грунтовочные носители M1, добавив интерферон (IFN) и 20 нг/мл и липополисахарид (LPS; 1 мкг/мл) в полные средства культуры RPMI-1640. Подготовьте M2 грунтовки средств массовой информации, добавив интерлейкин 4 (IL-4; 20 нг/мл) для полного RPMI-1640 культуры средств массовой информации.
2. В стерильных условиях, аспирные носители из тканевых культурных плит, которые содержат HMDM, которые были посеяны и культивированы, как описано в разделе 1.
3. Тщательно промыть колодцы, содержащие клетки 3x со стерильными PBS (предварительно подогретый до 37 градусов по Цельсию), используя 1 мл aliquots PBS.
4. Добавьте 1 мл либо m1 или M2 грунтовки средств массовой информации для каждого хорошо, содержащих HMDM (в зависимости от того, подходит для эксперимента).
5. Инкубировать клетки в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO₂ в клеточном инкубаторе.

3. Стимулирование HMDM, чтобы вызвать MET релиз

1. В стерильных условиях подготовьте культурные носители, содержащие различные стимуляторы выпуска MET (в зависимости от того, что подходит для эксперимента) к полному медиа RPMI-1640: PMA (25 нм), рекомбинантный ТНФЗ (25 нг/мл) или рекомбинантный ИЛ-8 (50 нг/мл) ).
2. Для экспериментов со стимуляцией HOCl, подготовить HOCl (200 мкм) в HBSS (предварительно подогретый до 37 градусов по Цельсию), непосредственно перед добавлением к клеткам. Убедитесь, что HOCl не подготовлен в полных носителях ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация запаса раствора HOCl количественно измеряет сяпучие абсорбции раствора на уровне 292 нм и рН No 11⁶ и с использованием коэффициента вымирания 350 М^-1см^-121.
3. После лечения поляризации, описанного в разделе 2, аспирировать клеточные носители из каждого колодца и тщательно мыть клетки 3x с 1 мл aliquots либо: стерильные PBS (для PMA, TNF и IL-8) или HBSS (для HOCl), которые были предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию.
4. Для экспериментов с PMA, TNF или IL-8: добавьте 1 мл полного носителя, содержащего PMA, TNF или IL-8 после удаления PBS в заключительном этапе стирки.
5. Для экспериментов с ТНФЗ инкубируйте клетки на 6 ч при 37 градусах По Цельсия при наличии 5% CO₂ в клеточном инкубаторе. Для экспериментов с PMA и IL-8, инкубировать клетки для 24 h при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO₂ в инкубаторе клетки.
6. Для экспериментов с HOCl добавьте 1 мл HOCl в HBSS после удаления HBSS в заключительном этапе стирки. Затем инкубировать клетки в течение 15 мин при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO₂ в клеточном инкубаторе.
   1. Тщательно аспирируйте супернатант клетки и мыть клетки 3x с 1 мл aliquots HBSS, как описано в шаге 3.3.
   2. После удаления HBSS с заключительного шага стирки, добавьте 1 мл полного НОСИТЕЛЯ культуры RPMI-1640. Затем инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия в присутствии 5% CO₂ в клеточном инкубаторе.

4. Визуализация MET в культуре живых клеток

1. Подготовка SYTOX зеленый краситель в HBSS в концентрации 40 мкм.
2. В конце лечения, описанного в разделе 3, чтобы вызвать выброс MET, непосредственно добавить 25 зЛ из 40 мкм красителя к каждому хорошо, содержащему HMDM.
3. Инкубировать клетки при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин в темноте.
4. Поместите HMDM в колодцы культуры тканей на стадии микроскопа перевернутого флуоресцентного микроскопа для визуализации.
5. Процедуры микроскопа
   1. Включите источник флуоресцентного света широкого спектра, источник яркого поля света и перевернутый микроскоп, установленный цифровой камерой с высоким разрешением (см. Таблица Материалов).
   2. Поверните колесо фильтра в положение "номер 2" для зеленой флуоресценции (возбуждение 504 нм, выбросы 523 нм) для визуализации зеленых окрашенных образцов, содержащихся в колодцах культуры тканей.
   3. Используя 5x цель, сосредоточить изображение с грубым фокусом, затем тонкой фокусировки ручки на микроскоп, пока изображение появляется резким, ясным и сосредоточены при просмотре через микроскоп окуляр.
   4. Переключите микроскоп в режим камеры.
   5. Запустите связанное программное обеспечение.
   6. Выберите вкладку Захвата на программном обеспечении.
   7. Нажмите кнопку Воспроизведения, чтобы просмотреть изображение и настроить тонкую ручку фокусировки на микроскопе до тех пор, пока изображение не появится резким, ясным и сосредоточенным в окне предварительного просмотра программного обеспечения.
   8. Нажмите кнопку захвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Захваченное изображение будет автоматически отображаться в сопроводительном программном обеспечении.
   9. В рамках программного обеспечения, нажмите Файл (ru) Сохранить как необходимый тип файла изображения.
   10. На микроскопе поверните колесо фильтра в положение "номер 5" для яркого поля изображения и повторите шаги 4.5.2-4.5.9 для получения соответствующего яркого изображения.
   11. Повторите шаги 4.5.2-4.5.10 по мере необходимости для последующего приобретения изображения.

Яркие изображения, показывающие морфологические изменения HMDM в ответ на стимулы для дифференциации клеток, показаны на рисунке 1. M1 поляризованные макрофаги в результате экспериментов с HMDM, подвергшимися воздействию ИФНЗ и LPS, показали удлиненную и веретенцовую форму клеток, о чем свидетельствуют черные стрелки на рисунке 1 (средняя панель). Для сравнения, морфология поляризованных макрофагов M2 после воздействия HMDM на ИЛ-4 на 48 ч, как правило, круглая и плоская, о чем свидетельствуют черные стрелки на рисунке 1 (крайне правая панель).

Способность дифференцированных HMDM фенотипов для освобождения METs была визуализирована живой клеточной флуоресценции изображения с SYTOX зеленый, как представлено на рисунке 2. На рисунке 2А показаны контрольные данные, полученные от каждого фенотипа HMDM, инкубированных в течение 24 ч при отсутствии каких-либо провоспалительных стимулов. В этом случае, было очень ограниченное зеленое окрашивание, как и ожидалось, учитывая клетку impermeant характер этого пятна. Рисунок 2B показал положительное окрашивание для METs, в результате воздействия M1 HMDMs на HOCl, PMA, IL-8, или TNF. MeTs показаны белыми стрелками, показанными как зеленые полосы, в результате нитей внеклеточной ДНК. С HOCl, в дополнение к окрашиванию внеклеточной ДНК, было некоторое зеленое окрашивание очевидное в клетках. Это клеточное окрашивание также наблюдается в некоторой степени с другими стимулами и, как полагают, отражает потерю целостности мембраны в результате ET-независимых клеток смерти в результате лечения условиях.

На рисунке 2B также показаны соответствующие эксперименты, проведенные с М2 HMDMs, которые подверглись воздействию Ил-4. В этом случае не было выделения ДНК из клеток, о чем свидетельствует отсутствие нитей/полос внеклеточной ДНК; однако, было некоторое клеточное поглощение зеленого флуоресцентного красителя с HOCl и TNF. Для сравнительных целей на рисунке 3 показаны репрезентативные данные, указывающие на выброс МЕТ из макрофагов THP-1, подвергающихся воздействию ТНФЗ (50 нг/мл) на 4 ч. В этом случае следует отметить, что неполяризованная популяция клеток была использована, а моноциты THP-1 были дифференцированы к макрофагам путем предварительной обработки с ПМА (50 нг/мл на 72 ч), как описано ранее22.

Рисунок 1: Морфологические изменения дифференциально поляризованных HMDMs. Представитель ярко-поля изображения из недифференцированных и дифференцированных HMDMs (n No 5). HMDMs культивировались с полными носителями, содержащими сыворотку человека и глутамин в течение 8 дней до грунтовки к фенотипу M1 или M2 при воздействии на IFN и LPS или IL-4, соответственно, для 48 ч. Шкала бар 200 мкм. Стрелки показывают примеры клеток, показывающих морфологические характеристики M1 или M2 HMDMs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: METs, производимые M1 HMDMs после HOCl, PMA, IL-8 и TNF. В качестве контроля использовались репрезентативные изображения SYTOX green stained HMDMs от (A)Нестимулированные М1 и М2 HMDMs, инкубированные на 24 ч при отсутствии каких-либо воспалительных стимулов, демонстрирующих отсутствие выпуска MET. (B) M1 и M2 HMDMs лечились с 1) HOCl (200 мкм, 15 мин), PMA (25 нм), или IL-8 (50 нг/мл) с инкубации для 24 ч или 2) TNF (25 нг/мл) с инкубации на 6 ч, чтобы вызвать MET релиз. МЕТ были визуализированы добавлением зеленого цвета SYTOX, о чем свидетельствуют белые стрелки в верхней панели от M1 HMDMs. В соответствующих экспериментах с М2 ММДМ METS не наблюдалось. Шкала бар 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: MET, производимые неполяризованными макрофагами THP-1 после стимуляции ТНФЗ. Репрезентативные изображения макрофагов SYTOX, окрашенных зеленым цветом TNP-1, которые были дифференцированы по предварительной обработке с PMA (50 нг/мл для 72 ч) до дальнейшей инкубации в течение 4 ч при отсутствии или наличии TNF (50 нг/мл), чтобы вызвать выброс MET. МЕТ были визуализированы путем добавления SYTOX зеленый. Данные являются репрезентативными для повторяют культурные скважины из экспериментов n No 3. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.