Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Хроническая пост-Ишемия Боль Модель для комплексного регионального болевого синдрома Тип-I у крыс

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60562

⸱

21 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Приведенный здесь протокол, в который подробно описаны шаги по созданию животной модели хронической послеишемской боли (CPIP). Это хорошо признанная модель, имитирующая человеческий сложный региональный болевой синдром типа I. Механическая и тепловая гиперчувствительность дополнительно оценивается, а также капсаицин-индуцированного ноцифенсивного поведения наблюдается в модели CPIP крысы.

Аннотация

Сложный региональный болевой синдром типа I (CRPS-I) является неврологическим заболеванием, которое вызывает сильную боль среди пациентов и остается нерешенным заболеванием. Тем не менее, основные механизмы КРБС-Я до сих пор не выявлено. Известно, что ишемия / реперфузии является одним из ведущих факторов, вызывающих КРБС-I. С помощью длительной ишемии и реперфузии задней конечности, крыса хронической после ишемии боли (CPIP) модель была создана для имитации КРБС-I. Модель CPIP стала хорошо признанной животной моделью для изучения механизмов CRPS-I. В этом протоколе описаны подробные процедуры, связанные с созданием крысиной модели CPIP, включая анестезию, за которой следует ишемия/реперфузия задней конечности. Характеристики модели крысы CPIP дополнительно оцениваются путем измерения механической и тепловой гиперчувствительности задней конечности, а также ноцифенцев реакции на острый капсаицин инъекции. Крыса CPIP модель экспонатов несколько КРБС-I-подобных проявлений, в том числе отек задних конечностей и гиперемии на ранней стадии после создания, стойкие тепловой и механической гиперчувствительности, и увеличение ноцифенцеватных реакций на острый капсаицин инъекции. Эти характеристики делают его подходящей животной моделью для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в КРБС-I.

Введение

Комплексный региональный болевой синдром (КРБС) отражает сложные и хронические болевые симптомы в результате переломов, травм, хирургии, ишемии или травмы нерва1,2,3. КРБС делится на 2 подкатегории: CRPS type-I и type-II (CRPS-I и CRPS-II)4. Эпидемиологические исследования показали, что распространенность КРБС была приблизительно 1:20005. КРБС-I, который не показывает никаких очевидных повреждений нерва, может привести к хронической боли и резко влияет на качество жизни пациентов. Текущие доступные методы лечения показывают неадекватные терапевтические эффекты. Таким образом, КРБС-Я по-прежнему остается важной и сложной клинической проблемой, которую необходимо решить.

Создание доклинической модели животных, имитирующей CRPS-I, имеет решающее значение для изучения механизмов, лежащих в основе CRPS-I. Для того, чтобы решить эту проблему, Coderre и др. разработан крысы модель, применяя длительную ишемию и реперфузии на заднюю конечность, чтобы резюмировать CRPS-I6. Известно, что ишемия / реперфузионная травма является одной из основных причин КРБС-I7. Крыса CPIP модель экспонатов многие CRPS-I-подобные симптомы, которые включают отек задних конечностей и гиперемии на ранней стадии после создания модели, а затем с стойкими тепловой и механической гиперчувствительности6. С помощью этой модели, предлагается, что центральная чувствительность боли, периферийные активации канала TRPA1 и реактивного производства видов кислорода, и т.д. способствовать CRPS-I8,9,10. Недавно мы успешно создали модель крысы CPIP и выполнили РНК-секвенирование псового корневого ганглиев (DRGs), которые иннервировать пораженную заднюю лапу11. Мы обнаружили некоторые потенциальные механизмы, которые, возможно, участвуют в посредничестве боли гиперчувствительности CRPS-I11. Мы также определили переходный рецептор потенциал ваниллоид 1 (TRPV1) канал в DRG нейронов в качестве важного вклада в механические и тепловой гиперчувствительности CRPS-I12.

В этом исследовании мы описали подробные процедуры, связанные с созданием крысиной модели CPIP. Мы также оценили модель крысc CPIP путем измерения механической и тепловой гиперчувствительности, а также ее отзывчивости к острому капсаицину. Мы предлагаем, чтобы крыса CPIP модель может быть надежной моделью животных для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в CRPS-I.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протоколы животных были одобрены Комитетом по этике животных Китайского медицинского университета Чжэцзяна.

1. Звери

  1. Получить самца Спраг-Доули (SD) крыс (280-320 г, 8-10 недель возраста) из Шанхайского центра лабораторных животных. Дом животных в Чжэцзян Китайский медицинский университет Лаборатория животных центра. Обратите внимание, что условия размножения должны включать 12 ч/ 2ч светлых/темных циклов и поддерживать постоянную температуру при температуре 24 градусов по Цельсию. Обеспечить воду и пищу объявление libitum. Обратите внимание, что в общей сложности 48 крыс используются в этом исследовании. Одно замечание, в этой модели, мы должны наблюдать боль ответ в течение всего процесса. Если применяется обезболивающее, то мы не можем успешно установить модель боли. После экспериментов крысы приносятся в жертву.

2. Создание модели CPIP

  1. Анестезия всех крыс (в том числе фиктивных и CPIP модельных групп) с фенобарбиталом натрия (50 мг/кг, интраперитонеальная инъекция (i.p.). Поддерживать анестезию с до 20 мг/кг/ч фенобарбитал (i.p.) при необходимости. Проверьте рефлексы каждого животного, щипая его заднюю лапу или хвост овойслик с помощью щипцы. Убедитесь, что крысы не реагируют до создания модели. Поместите ветеринарную мазь на глаза, чтобы избежать сухости во время процедуры. Поместите обезопаданых крыс на подогревом площадку поддерживается при 37 градусов по Цельсию для следующей процедуры.
  2. Ишемия и реперфузия задней лапы
    1. Смазать правую заднюю лапу и лодыжку глицеролом, как только крыса обезглавлена.
    2. Сдвиньте Nitrile 70 Durometer O-кольцо с 7/32 "(5,5 мм) внутренний диаметр в большую сторону 1,5 мл Eppendorf трубки (с оснастки крышка отрезали перед использованием). Аккуратно вставьте заднюю лапу в полую трубку Eppendorf до достижения дна.
    3. Постепенно сдвиньте O-кольцо от трубки к правой задней конечности возле голеностопного сустава и поместите на 3 ч. Применить такое же обращение к фиктивной группе крыс, за исключением того, что сломанное О-кольцо, которое отрезано и не должно вызывать ишемию, должно быть размещено вокруг лодыжки.
    4. Отрежьте O-кольцо 3 ч после шага ишемии. Внимательно следите за крысой, пока она не выздоровеет достаточно сознания для поддержания строгого recumbency. Обратите внимание, что крысы, которые получили анестезию не должны быть возвращены в компанию других крыс, пока он полностью не выздоровел.

3. Ноцифенсивные поведенческие тесты

  1. Поместите крысу в прозрачную камеру Plexiglas, которая сидит на полу сетки. Привычка крысы для 0.5 h перед любым поведенческим испытанием.
  2. Механическая аллодыния
    1. Используйте нити фон Фрея (0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 и 26,0 г нитей) для теста. Начните тест со средней нити (4,0 г). Вертикально нанесите нити на среднюю подошвенную поверхность задней лапы. Слегка нанесите подходящую силу, чтобы согнуть нить до 5 с. Внезапное опрокидывание задней лапы в ответ на раздражители считается ноцифенсивным поведением. Провести механический аллодиния тест в дни -3, -2, -1, и через день до дня 13.
    2. Применяйте метод тестирования вверх-вниз для проверки порога. Применить метод Диксона для расчета 50% порога снятия лап (PWT)13,14,15.
  3. Тепловая гипералгезия
    1. Используйте метод Харгривса для изучения тепловой гипералгезии. Непосредственно цель световой луч, излучаемый из лампочки (50 Вт) на заднюю лапу для измерения задержки удаления лапы (PWL). Установите 20 с в качестве порога отсечения, чтобы избежать чрезмерных повреждений от нагрева.
    2. Повторите каждый тест 3x в 5 минут интервалы для каждой задней лапы. Возьмите в среднем из этих трех тестов, как PWL каждой крысы16. Проведите термическую гипералгезию тест в дни -3, -2, -1, и через день до дня 13.
  4. Капсаицин-индуцированное острое ноцифефенсивное поведение
    1. Приготовьте капсаициновый бульонный раствор (200 мМ) с использованием диметилсульксида (ДМСО) и далее разбавьте до 1:1000 в стерильный фосфат-буферный солевой раствор (PBS) для инъекции задней лапы. Окончательная концентрация DMSO в PBS составляет 0,1% (автомобиль содержит 0,1% DMSO только в PBS). Введите капсаицин или транспортное средство в заднюю лапу (внутриплантарная инъекция) объемом 50 л с использованием иглы 30 Г, прикрепленной к шприцу 1 мл.
    2. Запись ноцифенцев поведение (т.е., лизать, кусаться, или вздрагивая вводили лапы) с помощью видеокамеры в течение 10 минут сразу после инъекции и количественно послеэтого,как ранее описано17,18,19.
  5. Оценка отеков лапы хинд: Оцените отек задней лапы, измеряя увеличение диаметра лапы. Измерьте с помощью цифрового калибровки и вычислите разницу между базальным значением и тестовым значением, наблюдаемым в разных точках времени. Оцените изменения толщины лап на 15 мин, 24 ч, 48 ч и 72 ч после создания модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После размещения O-кольцо на лодыжке, ipsilateral задняя лапа кожа показала цианоз, указание гипоксии ткани(Рисунок 1A). После резки O-кольцо, ipsilateral задняя лапа начала заполняться кровью и показал сильный отек, который продемонстрировал интенсивный признак гиперемии(Рисунок 1A). Отек лап постепенно уменьшился и вернулся к нормальной 48 ч после ишемической / реперфузии процедуры (двусторонний ANOVA с Sidak после специальног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает подробные методы для создания модели крыс CPIP путем применения ишемии / реперфузии задних конечностей крыс. Она включает в себя оценку внешний вид задних конечностей, отек, механические / тепловой гиперчувствительности, и острое ноцифенцевальное поведение в ответ на капсаицин инъекции.

Ишемия/реперфузия конечностей является распространенным фактором, способствующим КРБС-I у пациентов12. Этот протокол описывает, как установить крысы CPIP модель, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конфликтах интересов в этой работе.

Благодарности

Этот проект был спонсирован Национальным фондом естественных наук Китая (81873365 и 81603676), Чжэцзян провинциальных природных наук фонды для уважаемых молодых ученых (LR17H270001) и научно-исследовательских фондов из Чжэцзян Китайский медицинский университет ( 2019J01, 2018 Y37, 2018 Y19).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл Eppendorf TubeEppendorf22431021
DMSO Sigma-AldrichD1435
КапсаицинAPEXBIOA3278
Цифровой штангенциркульMeinaiteNA
Уплотнительное кольцо Уплотнительные кольца Западныйнитрил 70 Дюрометр7/32 дюйма<бр/> внутренний диаметр
Подошвенный испытательный аппаратUGO Basile, Италия37370
von Frey filamentsUGO Basile, ИталияNC12775

Ссылки

  1. Goh, E. L., Chidambaram, S., Ma, D. Complex regional pain syndrome: a recent update. Burns, Trauma. 5 (1), 2(2017).
  2. Birklein, F., Ajit, S. K., Goebel, A., Rsgm, P., Sommer, C. Complex regional pain syndrome - phenotypic characteristics and potential biomarkers. Nature Reviews Neurology. 14 (5), (2018).
  3. Shim, H., Rose, J., Halle, S., Shekane, P. Complex regional pain syndrome: a narrative review for the practising clinician. British Journal of Anaesthesia. , (2019).
  4. Urits, I., Shen, A. H., Jones, M. R., Viswanath, O., Kaye, A. D. Complex Regional Pain Syndrome, Current Concepts and Treatment Options. Current Pain, Headache Reports. 22 (2), 10(2018).
  5. Helyes, Z., et al. Transfer of complex regional pain syndrome to mice via human autoantibodies is mediated by interleukin-1-induced mechanisms. Proceedings of National Academy Sciences of the United States of America. 116 (26), 13067-13076 (2019).
  6. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-Type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1), 94-105 (2004).
  7. Coderre, T. J., Bennett, G. J. A hypothesis for the cause of complex regional pain syndrome-type I (reflex sympathetic dystrophy): pain due to deep-tissue microvascular pathology. Pain Medicine. 11 (8), 1224-1238 (2010).
  8. Klafke, J. Z., et al. Acute and chronic nociceptive phases observed in a rat hind paw ischemia/reperfusion model depend on different mechanisms. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 468 (2), 229-241 (2015).
  9. Tang, Y., et al. Interaction between astrocytic colony stimulating factor and its receptor on microglia mediates central sensitization and behavioral hypersensitivity in chronic post ischemic pain model. Brain Behavioral Immunology. 68, 248-260 (2018).
  10. Kim, J. H., Kim, Y. C., Nahm, F. S., Lee, P. B. The Therapeutic Effect of Vitamin C in an Animal Model of Complex Regional Pain Syndrome Produced by Prolonged Hindpaw Ischemia-Reperfusion in Rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (1), 97-101 (2017).
  11. Yin, C., et al. Transcriptome profiling of dorsal root ganglia in a rat model of complex regional pain syndrome type-I reveals potential mechanisms involved in pain. Journal of Pain Research. 12, 1201-1216 (2019).
  12. Hu, Q., et al. TRPV1 Channel Contributes to the Behavioral Hypersensitivity in a Rat Model of Complex Regional Pain Syndrome Type 1. Frontiers in Pharmacology. 10, 453(2019).
  13. Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).
  14. Chai, W., et al. Electroacupuncture Alleviates Pain Responses and Inflammation in a Rat Model of Acute Gout Arthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2018, 2598975(2018).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Fang, J. Q., et al. Parameter-specific analgesic effects of electroacupuncture mediated by degree of regulation TRPV1 and P2X3 in inflammatory pain in rats. Life Sciences. 200, 69-80 (2018).
  17. Tai, Y., et al. Involvement of Transient Receptor Potential Cation Channel Member A1 activation in the irritation and pain response elicited by skin-lightening reagent hydroquinone. Scientific Reports. 7 (1), 7532(2017).
  18. Liu, B., et al. TRPM8 is the principal mediator of menthol-induced analgesia of acute and inflammatory pain. Pain. 154 (10), 2169-2177 (2013).
  19. Liu, B., et al. Oxidized Phospholipid OxPAPC Activates TRPA1 and Contributes to Chronic Inflammatory Pain in Mice. PLoS One. 11 (11), 0165200(2016).
  20. Terkelsen, A. J., Gierthmuhlen, J., Finnerup, N. B., Hojlund, A. P., Jensen, T. S. Bilateral hypersensitivity to capsaicin, thermal, and mechanical stimuli in unilateral complex regional pain syndrome. Anesthesiology. 120 (5), 1225-1236 (2014).
  21. Drummond, P. D., Morellini, N., Finch, P. M., Birklein, F., Knudsen, L. F. Complex regional pain syndrome: intradermal injection of phenylephrine evokes pain and hyperalgesia in a subgroup of patients with upregulated alpha1-adrenoceptors on dermal nerves. Pain. 159 (11), 2296-2305 (2018).
  22. Minert, A., Gabay, E., Dominguez, C., Wiesenfeld-Hallin, Z., Devor, M. Spontaneous pain following spinal nerve injury in mice. Experimental Neurology. 206 (2), 220-230 (2007).
  23. Kingery, W. S., et al. Capsaicin sensitive afferents mediate the development of heat hyperalgesia and hindpaw edema after sciatic section in rats. Neuroscience Letters. 318 (1), 39-43 (2002).
  24. Xu, J., et al. Activation of cannabinoid receptor 2 attenuates mechanical allodynia and neuroinflammatory responses in a chronic post-ischemic pain model of complex regional pain syndrome type I in rats. European Journal of Neuroscience. 44 (12), 3046-3055 (2016).
  25. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1-2), 94-105 (2004).
  26. Weissmann, R., Uziel, Y. Pediatric complex regional pain syndrome: a review. Pediatric Rheumatology Online Journal. 14 (1), 29(2016).
  27. Kim, H., Lee, C. H., Kim, S. H., Kim, Y. D. Epidemiology of complex regional pain syndrome in Korea: An electronic population health data study. PLoS One. 13 (6), 0198147(2018).
  28. Tang, C., et al. Sex differences in complex regional pain syndrome type I (CRPS-I) in mice. Journal of Pain Research. 10, 1811-1819 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ишемия-реперфузиязадняя конечностьмеханическая аллодиниятермическая гипералгезияинъекция капсаицинанити фон Фреяметод Харгривзаноцицептивное поведение
Хроническая пост-Ишемия Боль Модель для комплексного регионального болевого синдрома Тип-I у крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.