Методическая статья

Высокий метод выхода для изоляции церебральных перицитов от мыши

DOI:

10.3791/60588

⸱

14 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of the Blood Brain Barrier, University of Artois, 2Department of Neurology, Universitätsmedizin Mannheim, Heidelberg University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представляем протокол для извлечения перицитов мурин. Основываясь на безантибиотиков обогащения ориентированных перицитов, этот протокол является ценным инструментом для исследования in vitro обеспечения высокой чистоты и высокой урожайности, тем самым уменьшая количество экспериментальных животных, используемых.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы церебральный перициты стали центром обширных исследований в области сосудистой биологии и патологии. Важность перицитов в формировании гематоэнцефалического барьера и физиологии в настоящее время продемонстрировано, но его молекулярная основа остается в значительной степени неизвестной. Поскольку патофизиологическая роль церебрального перицита при неврологических расстройствах интригует и имеет большое значение, модели in vitro не только достаточно уместны, но и способны включать различные методы для этих исследований. В качестве моделей in vitro были предложены несколько методов для извлечения перицитов головного мозга, хотя желательно использовать протокол, свободный от антибиотиков с высокой отдачей. Самое главное, метод, который увеличил выход на добычу снижает использование большего числа животных.

Здесь мы предлагаем простой и эффективный метод извлечения церебральных перицитов с достаточно высокой производительностью. Гомегенат ткани мозга мыши смешивается с раствором BSA-декестран для разделения тканевого мусора и микрососудистых гранул. Мы предлагаем трехэтапное разделение с последующей фильтрацией для получения микросудна богатый фильтррат. С помощью этого метода количество микрососудистых фрагментов, полученных от 10 мышей, достаточно для семени 9 скважин (9,6см каждая) из 6-колодца пластины. Самое интересное с этим протоколом, пользователь может получить 27 перицитов богатых скважин (9,6 см2 каждый) в проходе 2. Чистота перицитных культур подтверждается выражением классических перицитных маркеров: NG2, PDGFR-и CD146. Этот метод демонстрирует эффективный и осуществимый инструмент in vitro для физиологических и патофизиологических исследований перицитов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Церебральный перициты являются важным компонентом нейрососудистой единицы (НВУ), которая включает в себя функциональную единицу с церебральными эндотелиальными клетками гематоэнцефалического барьера (BBB), глиальных клеток, внеклеточной матрицы и нейронов. Перициты являются жизненно важной частью регулируемого функционирования центральной нервной системы (ЦНС), поскольку они служат одним из интерфейсов для обмена молекулярной и клеточной информации.

Церебральный перициты встроены в аблюминальной стороне микрососудов мозга, и имеют важное значение для создания1 и поддержания2 физиологии BBB. Несколько последних работ также подчеркнули роль церебральных перицитов в ангиогенезе3 и созревания сосудов4, эндотелиальный морфогенез5 и выживание6, и в контроле метаболизма холестерина мозга7. Важно отметить, что дисрегуляция в любом из этих процессов являются этиологическими признаками нейродегенеративных заболеваний.

Действительно, перициты являются функциональной необходимостью для нормального функционирования BBB и его защиты от прогрессирования ряда неврологических заболеваний. Вырождающаяся физиология и потеря перицитов являются общими знаменателями в прогрессировании болезни Альцгеймера8,потери нейронов во время дисфункции белого вещества9,рассеянный склероз10, септический энцефалопатия11, острый фазовый ишемический инсульт12 и при других неврологических расстройствах. Перициты также играют важную роль в метастазах опухоли13. Интересно, что перициты также были показаны для демонстрации роли спасения после неврологических травм и расстройств: в ремиелинизации в головном мозге1, ишемический инсульт, повреждение спинного мозга14 и содействие ангиогенез15. Восприимчивость перицитов для усиления патофизиологического проявления неврологических травм и расстройств делает их потенциальной терапевтической целью16.

Модели исследований в пробирке перицитов в BBB являются важными инструментами для проведения обширных исследований. Эти модели обеспечивают платформу для более сложных исследований, представляя рабочие модели BBB и многое другое. Например, эти модели могут быть использованы для понимания клеточной физиологии в перицитах и среди других типов клеток НВУ. Кроме того, модели in vitro являются инструментами для исследования фармакологических исследований новых препаратов и молекул на перициты. Эти модели также могут быть использованы для понимания патофизиологической роли перицитов по отношению к неврологическим расстройствам. Тем не менее, разработка моделей in vitro требует увеличения объема производства, с тем чтобы обеспечить экспериментальную свободу. Эти модели должны быть простыми и быстрыми, и уменьшить количество экспериментальных животных, используемых. Кроме того, желательно разработать такие модели в модели двойной и тройной клеточной культуры.

Есть много протоколов, которые были разработаны. Протоколы, предложенные Tigges et al.17,Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20,и Крауч и Доэтч21 являются похвальными подходами, которые удовлетворяют большинство предметов первой необходимости. Все эти методы дают эффективные результаты, но зависимость от большого количества экспериментальных животных остается общим знаменателем для этих протоколов. Таким образом, становится обязательным разработать высокопроизводительный метод, который может изолировать и очищать перициты с максимально возможной эффективностью. В этом протоколе чистота клеток, полученная после второго прохода, проверяется несколькими перицитами. Мы проверили на тромбоцитов- Производные Фактор роста Рецептор-я (PDGFR- ) , который используется в качестве классического маркера перицитов17, и для NG2 (нейрон-глиальный антиген 2), который является маркером перицита опосредованного сосудистого морфогенеза22 и васкуляризации23. Мы также проверили кластер дифференциации 146 (CD 146), который был зарегистрирован как одна из молекул, выраженных в перицитах17,18.

Здесь мы представляем протокол для извлечения первичных перицитов у мышей (дикий тип или трансгенетика), который удовлетворит все вышеупомянутые требования с высокой производительностью. Мы используем антибиотик и иммунопаннинг бесплатный метод пролиферации первичных церебральных перицитов, который зарекомендовал бы себя как эффективная модель для проведения исследований в пробирке.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Института в отношении использования и обращения с животными. В соответствии с французским законодательством животноводческое учреждение в Университете Артуа было одобрено местными властями (справка: B62-498-5). В соответствии с законодательством Европейского союза (Directive 2010/63/EU), все процедуры были одобрены местным комитетом по уходу за животными и использованию (Комитет по этике этерименции Animale du Nord-Pas-De-Calais, ссылка: C2EA 75) и Французское министерство исследований (ссылка: 20150915411121212).

1. Подготовка решений

  1. Подготовка 500 мл стирального буфера A (WBA): 10 мМ HEPES решение в Хэнка сбалансированное решение соли (HBSS). Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  2. Подготовьте 500 мл стирального буфера B (WBB): 0,1% Бовин сывороточный альбомин (BSA) с 10 мм HEPES раствор в HBSS. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  3. Приготовьте 300 мл 30% раствора dextran в WBA, смешивая раствор на ночь при комнатной температуре. Автоклав раствор при 110 градусах По цельсию в течение 30 минут перед использованием. После автоклавирования, пусть раствор отдыха при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Хранить раствор при температуре 4 градусов по Цельсию.
  4. Приготовьте 100 мл раствора BSA 0,1% в холодном растворе dextran. Встряхните энергично в течение 3-4 мин и хранить при 4 градусах Цельсия.
  5. Подготовка полного Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) культуры средств массовой информации путем растворения 20% икроножной сыворотки, 2 мМ глутамин, 50 мкг /мл гентамицин, 1% витаминов, 2% аминокислот Basal Medium Eagle (BME) в Basal DMEM СМИ и хранить при 4 кС. Добавьте 1 нг/мл Основной коэффициент роста фибробластов (bFGF) перед использованием.
  6. Подготовка полного перицита средств массовой информации, добавив перицита рост добавки (при условии перицитных средств массовой информации) и 20% фетальной сыворотки теленка (FCS) в перицитной культуры базальных средств массовой информации и хранить при 4 c.

2. Восстановление тканей мозга и удаление обезврежек

  1. Для обеспечения согласованности используйте мышей одного возраста и одного пола в каждой партии экстракции. Используйте приют для животных без патогенов и предоставьте доступ к воде. Для обеспечения эффективности и минимального использования животных, избежать потери ткани материала.
  2. Эвтаназия C57BL/6J, 4-6 недель, мышей мужского пола (лаборатории Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Франция).
  3. Быстро вырезать ткани мозга в стерильных условиях, избежать каких-либо повреждений ткани. Аккуратно поместите ткань в 40 мл холодного фосфата буферного солья (PBS).
  4. Перенесите ткани мозга в холодном PBS в чашку Петри (100 мм х 15 мм).
  5. Поместите ткани мозга на стерильные сухие без ворса протрите и с изогнутыми щипцы наконечник, удалить мозжечок, striatum и затылочной нервов.
    1. Удалите все видимые оленя с ватным тампоном. Поместите ткани мозга вверх дном и открыть доли с ватным тампоном с помощью внешних легких ударов. Удалите все видимые кровеносные сосуды.
    2. Поместите оболья свободной ткани мозга в чашку Петри (100 мм х 15 мм) с 15 мл холодного WBB.

3. Гомогенизация

  1. Перенесите ткань в минометную трубку для измельчителей ткани Dounce и добавьте 3-4 мл ВББ с щипками.
  2. Фарш ткани с "свободной" пестик 55 раз. Промыть "свободный" пестик с WBB. Теперь фарш суспензии с "жесткой" пестик 25 раз.
  3. Разделите суспензию поровну на две трубки 50 мл и добавьте 1,5-кратный объем холодной 30% BSA-dextran, энергично встряхивая трубки, чтобы смешать суспензию.

4. Изоляция сосудистой фракции

  1. После энергичноввстрятки труб, центрифуга труб в течение 25 минут при 3000 х г и 4 кв. c.
  2. Перенесите супернатант (наряду с верхним слоем миелина) на 2 новых трубки и центрифугируй в течение 25 минут при 3000 х г и 4 кв. м. Сохранить гранулы от первого центрифугирования, добавив 3 мл холодного ВБб (держать гранулы при 4 градусах Цельсия).
  3. Повторите шаг 4.2 и тщательно сохраняйте гранулы от2-й центрифугации.
  4. Откажитесь от декекна и миелина с тканями мусора из труб со ступени 4.3. Сохранить гранулы в холодном WBB.
  5. Объедините содержимое трубки 1 и трубки 2 от шага 4.1 и доставьте до конечного объема 10 мл с холодным WBB.
  6. Повторите этот шаг для труб от шага 4.2 и шага 4.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконец, есть 3 трубки из 3 центрифуги.
  7. Отлините гранулы 6 вверх и вниз с помощью 10 мл пипетки, пока не останется видимых скоплений гранул.
  8. С помощью вакуумной сборки фильтра и нейлонового сетчатого фильтра отфильтруйте клеточные суспензии каждой трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг фильтрации имеет важное значение для того, чтобы удалить больше / больше судов через сетчатый фильтр.
  9. Восстановить и resuspend капилляров путем соскабливания фильтра с помощью плоских щипцы наконечник или скребок в WBB при комнатной температуре. Фильтр подвески со свежим фильтром, чтобы восстановить больше капилляров
  10. Разделите фильтрат поровну на две трубки и центрифугу в течение 7 мин при 1000 х г и РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага центрифугации, подготовить ферментативное решение. Определить объем ВББ, требуемый в соответствии с количеством используемых животных (см. Таблицу Материалов). Добавьте 1x DNase 1 и 1x гидрохлорида Тосила-Л-лисиламетана (TLCK) (см. Таблица материалов)в ВВБ и предварительно потеплейте до 37 градусов по Цельсию.
  11. Соберите гранулы со ступени 4.10 в одной трубке с предварительно подогретым ВББ с ферментами. Добавить предварительно разогретый 1x коллагенеза / диспази. Поместите трубку в трясущейся столовой водяной бане при 37 градусах по Цельсию ровно 33 мин.
  12. Остановите реакцию фермента, добавив 30 мл холодного ВББ. Centrifuge подвески в течение 7 мин на 1000 х г и RT.
  13. Откажитесь от супернатанта тщательно и отмежевать гранулы в WBB с 6 вверх и вниз ударов с помощью 10 мл пипетки. Этот шаг должен быть менее строгим и сравнительно быстрым.
  14. Centrifuge подвески в течение 7 мин на 1000 х г и RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага, отбросить покрытие от культуры блюда и промыть их один раз с DMEM при комнатной температуре. Пальто клеточной культуры блюда, по крайней мере 1 ч на RT.
  15. Откажитесь от супернатанта из трубки, полученной на шаг 4.14, и отразите гранулы в новых полных средствах DMEM, наплитуйте клетки (Day 0, P0) в 9 колодцах 6-ну колодца (1 скважина по 9,6 смкаждая).

5. Распространение церебральных перицитов

  1. Поддерживайте клеточные культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в стерильном инкубаторе. Замените культурные носители после 24 ч (день 1) покрытия клеток путем тщательного удаления мусора. После первого дня, изменить культуру средств массовой информации в каждые 48 ч.
  2. Наблюдайте за клеточной культурой не менее 7-8 дней. К этому времени, клеточные наросты на вершине эндотелиального неизлечимого слоя должны быть наблюдаемыми.
  3. Прохождение клеток на 8-10 день (в зависимости от стельности) в перицитной культуры среды для прохождения 1 (P1) на желатина покрытием культуры пластин. Изменяйте культурные носители каждые 2 дня. Наблюдайте за клетками в течение 6-7 дней. Клетки последовательно делятся снова на проход 2 (P2) на день 17 (и проход 3 (P3) на день 24 только при необходимости, выращенные в перицитной среде в пластинах с покрытым желатином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть готовы к экспериментам/ наблюдению при почти 80-90% в нештатной ситуации.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол(рисунок 1)эффективно дает 9 скважин (из 6-колодцев) во время посева на P0(Рисунок 2А (P0: День 1)).

От P0 до P2 существуют специфические морфологические характеристики, по которым можно наблюдать эндотелиальные клетки (указанные белыми стрелками) и постепенное увеличение перицитов (указанных черными стрелками). В P0, удлиненные эндотелиальные клетки, развивающиеся из микрососудов в изобилии(Рисунок 2A, P0: День 3), в то время как обилие таких удлиненных клеток уменьшается в P1 и отсутствует в P2. Напротив, перициты появляются как четырехсторонние клетки, которые в изобилии в P2(Рисунок 2A, P2: День 18).

Чтобы подтвердить чистоту перицитной культуры в P2, мы проверили выражение NG2, CD146 и PDGFR-бета как перицитные маркеры с помощью количественных ПЦР(Рисунок 2B),иммуноцитохимия(рисунок 2C), и западный пятно (Рисунок 3). Перициты в P2 выражают более высокие уровни CD146, NG2 и PDGFR-я по сравнению с выражением в общем мышечном мозге (г-жа Br) экстракт. В качестве контроля, выражение эндотелиальных маркеров Occludin и CD31, астроцитов маркер глиальных фибриллярный кислотный белок (GFAP) и микроглии маркер CD11b также наблюдались отсутствует в P2.

figure-results-1
Рисунок 1: Резюме протокола. Этот план представляет собой критические шаги для добычи перицитов, который начинается с распада ткани со стеклянной шлифовальной шлифовальной машиной с последующим 3-ступенчатое разделение в декентине и фильтрации. В этом протоколе используется 33-минутный шаг пищеварения ферментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Морфология клеток и выражение маркеров. (A) Фазовые контрастные изображения перицитов на стадиях распространения P0, P1 и P2. Обильные эндотелиальные клетки в P0 показаны белыми стрелками. Их число уменьшилось в P1, и они исчезли в P2. Перициты обозначены черными стрелками. (B) Анализ CD146, NG2 и PDGFR-я выражение ПЦР в перицитах в P2 с перицитами в P1 и мыши мозга (г-жа Br) образцы. (C) Репрезентативные изображения перицитов в P2, демонстрирующие положительное иммуностоирование CD146, PDGFR-и, NG2. Шкала бар: 50 мкм (20x увеличение) и 20 мкм (40x увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Представительная чистота клеточных культур. Анализ экспрессии CD146, PDGFR-q, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b и Тубулина по западным промоканиям в перицитах в образцах P2 и мышиного мозга (г-жа Бр). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Репрезентативное сравнение различных методов распада тканей, очищения, обогащения и ферментативного пищеварения. Каждый опубликованный протокол обобщается с указанием количества животных, используемых для каждого протокола. Также указаны объемы производства в отношении количества скважин, полученных при посевной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Церебрачные перициты являются неотъемлемой частью НВУ и играют активную роль в индукции и поддержании BBB24. Аналогичным образом, роль этих клеток в различных нейродегенеративных расстройств и сосудистых патологий интригует. Таким образом, эффективная высокоэффективная модель первичной перицитной ячейки обеспечит эффективную платформу для исследований in vitro.

Существуют различные протоколы, которые были предложены для изоляции первичных перицитов(рисунок 4). Tigges et al.17 предложили метод, включающий корковую ткань с оленями. Этот подход является тендеризация тканей из 6 мышей (37 кВ, 70 мин пищеварения с ферментами папаин / DNase следуют дезинтеграции шаг через 21 G и 18 G иглы. Этот протокол предполагает одношаговое разделение (центрифугирование в 22% растворе BSA/PBS), которое дает по крайней мере 2 коллагена, которые я покрывал колодцами 6-колодца. Клетки поддерживаются в эндотелиальной среде роста клеток (ECGM) до прохождения 3, а затем в среде роста перицитов (PGM) для пропускающих клеток для содействия пролиферации перицитов. В другом аналогичном подходе, Chen et al.18 предложил диссоциацию тканей, подав ткани стерилизованные лезвия бритвы и пищеварение ткани с коллагеназой/DNase в течение 90 мин при 37 градусах Цельсия. После одношагового разделения (центрифугирование в 22% BSA) клеток, слой миелина удаляется и гранулы промывают дважды в ECGM. Микрососуды покрываются в 3 колодцах коллагена, которые я покрывал 6-колодными пластинами. После достижения слияния, клетки проходят дважды, а затем поддерживается в PGM. В конце концов, если клетки передаются в соотношении 3, мы можем получить 27 скважин 6-ну колодца только при использовании 10 мышей в начале протокола.

В Томсен и др., авторы предлагают изоляции церебральных перицитов через двухступенчатый фермент пищеварения19. Удаляются менинги и белое вещество, а образцы мозга разрезаются на мелкие кусочки. Части ткани проходят первую реакцию фермента в коллагенезе/DNase I в течение 75 мин при 37 градусах По Цельсия, после одного шага разделения в 20% BSA. Гранулы собираются и далее перевариваются в коллагенезе/диспазе/DNase I в течение 50 мин при 37 градусах Цельсия. Этот шаг сопровождается разделением микросудов в градиенте Percoll 33% и далее промывается один раз. Микрососуды посеяны на коллагене IV/фибронектин покрытием 35 мм посуды. Распространение перицитов благоприятствует 10% FCS и гентамицин сульфат в DMEM в течение 10 дней. В другом двухступенчатом подходе к пищеварению ферментов, Yamazaki et al. предлагают измельчение вырезанной ткани в холодном DMEM20. В первой реакции фермента, образцы обрабатываются коллагеназа / DNase I в течение 75 мин при 37 градусов по Цельсию. После одного шага центрифугирования, гранулы снова промывают один раз и вторая реакция фермента инициируется в коллагеназе / диспазы в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия. После одношагового разделения гранулы вновь приостанавливаются и центрифугируется в 22% растворе BSA. Наконец, микрососудистые гранулы перекрываются и покрывают 6-колодецной пластиной. Для 5 мозга мыши, 1 хорошо 6-колой пластины могут быть покрыты. Для получения перицитов, эндотелиальные культуры проходят трижды при сохранении в мозге мыши эндотелиальной клетки (mBEC) среднего II. Крауч и Doetsch20 предложить метод очистки перицитов FACS. Образцы тканей из коры головного мозга и желудочковой зоны мозга мыши микро-расчленены и тщательно измельчаются скальпелем. После коллагеназа / диспазы инкубации фермента в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, переваренные ткани отделяется от миелина и мусора центрифугированных в 22% v/v Percoll раствор. Суспензия клетки затем инкубируется в флуоресцентно спряженным антителам для анализа FACS и сортировки. Отсортированные клетки покрыты коллагеном покрытием скважин 24 хорошо пластины. Предполагается, что одна кора дает достаточно ежеклеток для одного покрытия в 1 скважине из 24-колодца пластины.

Даже если эти методы продуктивны, эти методы поставляются с несколькими ограничениями, от использования большого количества животных для односерийной изоляции до очень ограниченного количества выходных данных.

За время разработки предлагаемого протокола нам удалось получить высокую мощность: 9 скважин из 6-колодца пластины от 10 мышей. С этой целью удаление оленей обеспечивает одноступенчатое удаление крупных сосудов из ткани. Дробилка Dounce ткани больше подходит для мягких тканей, таких как мозг. Он также обеспечивает сокращение образцов с рыхлым пестиком, гомогенизация с жесткой пестик, и предотвращает ненужные повреждения клеток. Одной из основных целей в протоколах первичной культуры клеток является минимальная трата тканей и длительное извлечение сосуды головного мозга. В представленном протоколе это достигается путем повторного центрифугирования экстран-BSA проникнутой ткани гомената. Трехступенчатый подход центрифугирования помогает восстановить большое количество сосудизмовизм из ткани гомегената. Это обеспечивает 3x улучшенное восстановление микросудов. После разделения, фильтрация является следующим важным шагом, который выступает за исключение гладкой мышечной клетки связанных крупных сосудов. Как уже упоминалось ранее сочетание различных ферментов было предложено для ферментативного пищеварения. В то время как DNase и коллагенеза / диспазы используются для уменьшения скоплений клеток и изолировать одиночные клетки соответственно, это очень важно, чтобы предотвратить гибель клеток в такой инвазивной среде, и это предотвращается TLCK, что тем самым увеличивает конечную урожайность. Первоначально, первый проход позволен для того чтобы вырасти endothelial monolayer, который более поздно поддерживает рост прикрепленных перицитов на unilayer. Так как выживание первичных эндотелиальных клеток уменьшается при прохождении, это повышает вероятность извлечения перицита. Кроме того, этот протокол использует еще один проход, который обеспечивает предотвращение эндотелиального загрязнения клеток. Следует отметить, что при большем количестве клеток из P2 зависимость от дальнейшего прохождения клеток уменьшается. Кроме того, это уменьшает возможность роста перицита обгоняют гладкие мышечные клетки, которые распространяются на гораздо более высокой скорости.

Для достижения более высокой производительности, Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение и должны быть точно выполнены в отношении температуры и времени. Смешивание ткани гомегената в BSA-dextran должно быть быстрым. Диссоциация гранул после этапов центрифугации должна быть быстрой, чтобы предотвратить гибель клеток. Кроме того, 33 мин ферментативного пищеварения должно быть сделано с точностью и осторожностью. Одним из ограничений для этого протокола является 7-8-дневный срок, что эндотелиальный unilayer разрешено расти и далее способствовать росту перицитов. Очевидно, что изоляция микрососудов является btter, рост unilayer быстрее, и, следовательно, Есть увеличение числа перицитов. Рекомендуется не использовать менее 10 мышей в каждой экстракции для обеспечения достаточного количества микрососудистых фракций для дальнейшего роста перицитов. Если следует ежектовая точкам внимательно, то желаемая плотность клеток для культуры перицита головного мозга может быть легко достигнута.

Модели In vitro обеспечивают осуществимую платформу для разработки производных моделей для получения дополнительной информации о патофизиологической значимости и коммуникации между другими клетками НВУ во время неврологических расстройств. Изолированные перициты могут быть включены в двухклеточной культуры (с эндотелиальных или глиальных клеток) и трехклеточной культуры (эндотелиальных и глиальных клеток) моделей. Разработка этих моделей здесь не обсуждалась. В заключение, этот протокол обеспечивает один подход для изоляции первичных клеток с более высоким выходом и лучшую платформу для исследования in vitro, связанные с биологией церебральных перицитов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LT и FG были предоставлены Национальным агенством речерче (ANR, ANR-15-JPWG-0010) в рамках Совместной программы ЕС – Neurodegenerative Disease Research (JPND) для проекта SNOWBALL.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аминокислоты BMESigmaB-6766хранятся при 4°С.
Базальная ДМИнвитроген316000083хранить при 4°С.
Основной фактор роста фибробластовSigmaF-0291хранить при -20°С.
BSASigmaA-8412Магазин в 4 °C.
Коллагеназа диспажеСигма10269638001Приготовьте 10-кратный стоковый раствор в стерильном PBS-CMF. Отфильтруйте раствор с помощью 0,22 μ m шприц отфильтровать и хранить при -20 °C. Примечание: Для этапа ферментного расщепления протокола, для каждого набора из 10 мышей для экстракции, 300 &m; Требуется 10-кратное распыление коллагеназы.
DextranSigma31398
DNase ISigma11284932001Приготовьте стоковый раствор 1000X, растворив 100 мг в 10 мл стерильной воды, и храните при температуре -20°C.
ЖелатинSigmaG-2500Готовят рабочее покрытие путем приготовления 0,2% раствора желатина в стерильном PBS-CMF (8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 0,2 г/л KH2PO4, 2,86 г/л NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Автоклавировать раствор не менее 20 минут при температуре 120°С; C и хранить при комнатной температуре. Посуду для культуры покрывать не менее чем на 4 часа при температуре 4°С.
ГентамицинBiochrom AGA-2712Хранить при 4°С.
ГлутаминMerckI.00289хранить при -20 °C.
HBSSSigmaH-8264Магазин в 4 градуса по Цельсию.
HEPESSigmaH-0887Магазин при 4 °C.
MatrigelBD Biocoat354230Приготовьте рабочий лакокрасочный раствор Matrigel путем разведения материала в холодном DMEM в соотношении 1:48 с его конечной концентрацией 85&мкм; г/см2. Посуду для клеточных культур следует покрывать не менее 1 часа при комнатной температуре.
Перициты Средняя мышьНаучные исследовательские лаборатории1231Хранить при 4 °C.
Тозил Лизин ХлорметилкетонSigmaT-7254Приготовьте 1000X стоковый раствор в WBA, растворив 16 мг в 10,88 мл WBA для получения 4 мл раствора и храните при 4 °C.
ВитаминыСигмаВ-6891хранить при температуре -20°С.
Требования к оборудованию
Инструменты для фильтрацииSefar, нейлоновая сетка, пористость
Лабораторное оборудованиеРоторная центрифуга
Водяная баня с мешалкой
Laminar Flow Hood: BSL2
Стеклянная посуда (все компоненты должны нагреваться) стерилизованный)Шлифовальная машина для тканей со стеклом Пестик
I: 0,0035 - 0,0065 дюйма
Пестик II: 0,0010 - 0,0030 дюйма
Вакуумный фильтр в сборе с грубой пористостью Опорное основание
Хирургические инструменты для препарирования (все компоненты подлежат термической стерилизации)Щипцы, ножницы, горелка Бунзена, вата Тампоны, калибр
60 мкмс поворотным ведромфильтра из фриттированного стекла

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
  2. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  3. Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
  4. Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106(2017).
  5. Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
  6. Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
  7. Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
  8. Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932(2013).
  9. Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
  10. Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
  11. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  12. Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
  13. Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385(2016).
  14. Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
  15. Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
  16. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  17. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  18. Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
  19. Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
  20. Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
  21. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  22. Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
  23. Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
  24. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NG2PDGFRCD146

Похожие статьи