Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Монокулярный визуальный лишение и глазной доминирование Пластика Измерения в мыши первичной визуальной коры

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60600

⸱

8 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Clinical Hospital of Chengdu Brain Science Institute, MOE Key Lab for NeuroInformation, University of Electronic Science and Technology of China, 2Sichuan Institute for Brain Science and Brain-inspired Intelligence, 3Department of Electronic Engineering, City University of Hong Kong, 4Centre for Biosystems, Neuroscience, and Nanotechnology, City University of Hong Kong

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробные протоколы для монокулярной визуализации зрения и анализа пластики глазного доминирования, которые являются важными методами для изучения нейронных механизмов визуальной пластичности в критический период и влияния специфических генов на визуальное развитие.

Аннотация

Монокулярная лишение зрения является отличной экспериментальной парадигмой, чтобы вызвать первичной зрительной корковой реакции пластичности. В целом, реакция коры на контралатеральный глаз на стимул гораздо сильнее, чем реакция ипсилатерального глаза в бинокулярном сегменте первичной зрительной коры мыши (V1). В критический период млекопитающих, зашивание контралатерального глаза приведет к быстрой потере отзывчивости клеток V1 к контралатеральной стимуляции глаз. С продолжающимся развитием трансгенных технологий, все больше и больше исследований используют трансгенных мышей в качестве экспериментальных моделей для изучения влияния конкретных генов на глазное доминирование (OD) пластичность. В этом исследовании мы вводим подробные протоколы для монокулярной визуальной депривации и вычисляем изменения в пластичности OD в мыши V1. После монокулярной депривации (MD) в течение 4 дней в критический период измеряются кривые настройки ориентации каждого нейрона, а кривые настройки четырех нейронов уровня в V1 сравниваются между стимуляцией ипсилатеральных и контралатеральных глаз. Контралатеральный индекс смещения (CBI) может быть рассчитан с помощью глазной оценки OD каждой клетки, чтобы указать степень пластичности OD. Этот экспериментальный метод важен для изучения нейронных механизмов пластичности ОД в критический период и для съемки роли конкретных генов в нервном развитии. Основным ограничением является то, что острое исследование не может исследовать изменения в нервной пластичности одной и той же мыши в разное время.

Введение

Монокулярная визуальная депривация является отличной экспериментальной парадигмой для изучения пластичности V1. Чтобы изучить важность визуального опыта в нервном развитии, Дэвид Хубэль и Торстен Визель1,2 лишили котят нормального зрения на один глаз в различные моменты времени и в течение различных периодов времени. Затем они наблюдали изменения интенсивности реакции в V1 для обездоленных и необездоеденных глаз. Их результаты показали аномально низкое число нейронов, реагирующих на глаз, который был зашивается закрыты в первые три месяца. Тем не менее, ответы от нейронов в котят остались идентичныво во всех отношениях, чтобы те из нормального взрослого кошачьего глаза, который был зашепан закрыты в течение года, и котята не восстановить. MD у взрослых кошек не может вызвать ПРО пластичности. Таким образом, влияние визуального опыта на проводку V1 сильно во время краткой, четко определенной фазы развития, до и после чего те же стимулы имеют меньшее влияние. Такая фаза повышенной восприимчивости к визуальному вхожжью известна как критический период в зрительной коре.

Хотя мышь ночная животное, отдельные нейроны в мыши V1 имеют сходные свойства с нейронами, найденными у кошек3,4,5. В последние годы, с быстрым развитием трансгенных технологий, все большее число исследований в области визуальной нейронауки использовали мышей в качестве экспериментальной модели6,7,8. В мышах визуальных исследований, нейробиологи используют мутантов и нокаут мыши линий, которые позволяют контролировать генетический состав мышей. Хотя мышам V1 не хватает OD колонны, одиночные нейроны в бинокулярной зоне V1 показывают значительные свойства OD. Например, большинство клеток более сильно реагируют на контралатеральную стимуляцию, чем на ипсилатеральную стимуляцию. Временное закрытие одного глаза в критический период вызывает значительный сдвиг в распределении индекса OD9,10,11. Таким образом, MD может быть использован для создания модели пластичности OD для исследования того, как гены, участвующие в нервных расстройств развития влияют на корковую пластичность in vivo.

Здесь мы внедряем экспериментальный метод md и предлагаем широко используемый метод (электрофизиологическая запись) для анализа изменений в пластичности ОД во время монокулярной визуальной депривации. Метод широко используется во многих лабораториях уже более 20 лет12,13,14,15,16. Есть и другие методы, используемые в измерении пластичности ОД, а также, такие как хронические визуальные вызвал потенциал (VEP) записи17, и внутреннее оптическое изображение (IOI)18. Существенным преимуществом этого острого метода является то, что его легко следовать, и результаты удивительно надежны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом протоколе, мышей C57Bl/6 мышки были получены от института животных лаборатории Академии медицинских наук Sichuan и стационара провинции Sichuan. Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных, Университет электронных наук и технологий Китая.

1. Монокулярная депривация (MD) в послеродовой день 28 у мышей

  1. Положите хирургические инструменты, шовную иглу (диаметр 0,25 мм, диаметр струны 0,07 мм) и ватные тампоны в алюминиевую коробку и автоматически автоматизируй их при 120 градусах По Цельсию за 0,5 л. Стерилизовать капот с помощью 75% этанола. Высушите хирургические инструменты в сушильной печи.
  2. Приготовьте 2% раствор агарозы, положите его на водяную ванну при 75 градусах Цельсия, чтобы избежать затвердевания.
  3. Используйте изофруран, смешанный с кислородом, для обезболительной терапии мыши (2% индукции и 1,2-1,5% обслуживания). Зафиксировать мышь на стереотаксическом аппарате и использовать теплорегулирующее устройство для поддержания температуры тела мыши при температуре 37 градусов по Цельсию и предотвращения переохлаждения.
  4. Нанесите тонкий слой нефтяной глазной мази на оба глаза.
  5. Под анатомическим микроскопом с подсветкой шов веко на один глаз. Сделать иглу пройти, хотя обе стороны века 2x(Рисунок 1А) и сделать около четырех стежков.
  6. Узел нить 2-3x, а затем обрезать поток. Нанесите 3 злиц мгновенного сушки клея на узел, чтобы повысить его устойчивость. Затем вырежьте дополнительную нить швов.
  7. Обеспечить интраперитонеальную инъекцию бупренорфина (1 мг/кг) в мышь.
  8. Перенесите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 градусов по Цельсию и предотвращать переохлаждение и контролировать ее до тех пор, пока она не придет в сознание.
  9. Когда мышь полностью проснулся место его в отдельной клетке проведения.
  10. Проверяйте веки ежедневно, чтобы убедиться, что они остаются закрытыми и неинфицированными. Исключите мышь, если обнаружено отверстие для век.
  11. Перед электрофизиологической записью используйте изофруран, смешанный с кислородом, для обезболности мыши (2% индукции и 1,2-1,5% обслуживания).
  12. Удалите стежки ножницами для глаз, чтобы разоблачить глазное яблоко. Тщательно обрезать веки.
  13. Промыть глаз раствором хрусталика и проверить глаза под микроскопом для ясности. Исключите мышей с непрозрачностью роговицы или признаками инфекции.

2. Craniotomy в бинокль мыши V1 области после монокулярной лишения на 4-й день

  1. После анестезии мыши, проверить на глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
  2. Поместите и зафиксировать мышь на стереотаксическом аппарате. Отрегулируйте высоту ушной прыги и зубного стержня, чтобы сохранить мозг плоским и стабильным.
  3. Используйте грелку для поддержания температуры тела.
  4. Нанесите на поверхность глаз на нефтяной основе глазную мазь, чтобы они не были влажными.
  5. Удалите волосы на голове мыши, чтобы разоблачить ее кожу. Натрите кожу чередующимися скрабы йода и 70% этанола 3x.
  6. Вырежьте 8 х 8 мм области кожи между ушами, чтобы разоблачить череп и удалить ткань головы. Затем удалите надлежащую соединительную ткань с перекисью водорода 30%.
  7. Просверлите отверстие 1 х 1 мм в черепе над мозжечкой. Прикрепите небольшой костяной винт в отверстие в качестве эталона.
  8. Выполните небольшую краниотомию диаметром 1 мм в бинокулярной области V1 от контралатерального полушария до лишенного глаза(рисунок 1B,A-P: лямбда -0,51-лямбда 1,67 мм; М-Л: -2,6----3,0 мм; D-V: 0-1 мм). Аккуратно удалите фрагмент черепа, не повредив мозг.
  9. Обложка подвергаются корковой поверхности с 75 qL 2% агарозы при 40 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить сушки.
  10. Зафиксите вольфрамовый электрод на стереотаксической раме. Поместите вольфрама электрод вертикально на поверхности открытой коры, бинокль области V1, чтобы убедиться, что клетки, которые записаны реагировать на оба глаза.
  11. Используйте ватные тампоны, чтобы удалить гель для глаз и применить кремниевое масло к глазу каждые 2 ч.

3. Визуальная стимуляция и электрофизиологическая запись

  1. Замаскируйте один глаз непрозрачной пластиковой пластиной. Расположите LCD-монитор на 23 см от глаза мыши.
  2. Снизить анестезию до 0,5-0,8%, когда мышь полностью обезболивается.
  3. Предварительное продвижение микроэлектрода медленно с маслом гидравлического микроманипулятора. Остановите его, когда наблюдается высокое соотношение сигнала к шуму и электрод продвинут до слоя 4(рисунок 1C,примерно 250-450 мкм в глубину). Убедитесь, что коэффициент усиления установлен на уровне 1000, фильтр - 300-100 Гц, а частота выборки - 40 Гц.
  4. На светодиодном мониторе представлена полнополевой движущейся синусоидальной решетки(рисунок 1D,12 направлений, 100% контраст, 2 Гц временной частоты, 0,04 цикла на степень пространственной частоты).
  5. Измерьте реакцию клетки, стимулируя ипсилатеральный и контралатеральный глаз отдельно. Настоящее 3-5x всего.
  6. Измерьте реакцию от пяти до восьми ячеек при каждом проникновении. Выполните четыре-шесть проникновений в каждой мыши.
  7. После записи отрегулируйте скорость потока изофлуран до 5% или больше, продолжайте изофлуранное воздействие в течение 1 мин, а затем выполните вывих шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные проникновения были расположены по крайней мере 200 мкм друг от друга в бинокулярной зоне V1.

4. Оффлайн сортировка спайков и анализ данных

  1. Обнаружить шипы, когда необработанный сигнал пересекает пороговый уровень. Выровнять захваченные шипы на первом положительном или отрицательном пике. Используйте программное обеспечение для обнаружения шипов из разных ячеек.
  2. Установите два курсора: один для положительного, а другой для отрицательного отклонения. Установите шаблон спайка(рисунок 2A). Установите область шаблона к тому с наиболее значительным изменением между различными типами шипов.
  3. Используйте анализ основных компонентов, чтобы разделить их на кластеры. Методы кластеризации могут варьироваться в зависимости от различных лабораторий.
  4. Классифицировать пик границы с помощью алгоритма K-средств.
  5. Соотнесите ориентацию с скоростью стрельбы шипа и начастоте кривые настройки ориентации для ипсилатерального и контралатерального глаза.
  6. Рассчитайте индекс OD для одной единицы, который представляет соотношение силы контралатерального/ипсилатерального ответа:
    figure-protocol-1
    где Rcontra и Ripsi являются оптимальным ответом клетки для контралатерального и ипсилатерального глаза, соответственно, иR-spon является спонтанной активностью клетки.
  7. Присвоить OD баллы 1-7 следующим образом: от 1 до 0,75 евро и 1; от 0,75 до 0,45 евро 2; от 0,45 до 0,15 евро 3; от 0,15 до 0,15 евро 4; от 0,15 до 0,45 х 5; от 0,45 до 0,75 - 6; и от 0,75 до 1 и 7.
  8. Рассчитайте контрлатеральный индекс смещения (CBI):
    figure-protocol-2
    где N является номером ячейки, и nx равняется номеру ячейки с od оценки равны х.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальные результаты, описанные здесь, позволяют успешно измерять пластичность MD и OD из обездоленной и нелишенной мыши в критический период (P19-P32). На рисунке 1 показано, как выполнять записи одного блока в слое 4 из V1 бинокль зоны для сравнения ответов в ipsilateral и контралатерального глаза 4 дней после MD. На рисунке 2 показаны измерения сортировки шипов и настройки ориентации для стимуляции ипсилатеральных и контралатеральных глаз. Для сортиро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем подробный протокол для MD и измерения пластичности OD с помощью записи одного блока. Этот протокол широко используется в зрительной нейронауке. Хотя протокол MD не является сложным, Есть некоторые критические хирургические процедуры, которые должны соблюдаться тщательно. Во-первых, есть две важные детали, обеспечивающие качество сшивания. Шов достаточно стабилен, если стежки сосредоточены в медиальной части века. Кроме того, 3 л клея наносится на головку узла, чтобы повысить стабильность узла, чтобы предо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81571770, 81771925, 81861128001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
502 клейM& G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Приобретательная картаNational InstumentPCI-6250
AgaroseBiowestG-10
AmprA-M системаМодель 1800
АтропинAladdin Bio-Chem Technology Co., LtdA135946-5
Brain Stereotaxic ApparatusRWD Life Science Co., Ltd68001
Весенние ножницы Cohan-VannasFine Science Tools15000-02
Решения для контактных линз BeijingDr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.
Ватные палочкиHenan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd
Тонкий иглодержательSuZhou Stronger Medical Instruments Co., LtdCZQ1370
Forcep66 Vision Tech Co., Ltd.53320A
Зажим66 Vision Tech Co., Ltd.53072
Зажим66 Vision Tech Co., Ltd.#5
ГрелкаStrykerTP 700 T
IlluminatorMotic China Group Co., Ltd.MLC-150C
ИзофлуранRWD Life Science Co., LtdR510-22
ЖК-мониторPhilips (Китай) Investment Co., Ltd.39PHF3251/T3
МикроскопSOPTOPSZMT1
Неинвазивный монитор жизненно важных показателейMouseox
Oil гидравлический микроманипуляторNARISHIGE International Ltd.PC-5N06022
Вазелинный гель для глазDezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.17C801
Spike2Cambridge Electronic Design, Кембридж, ВеликобританияSpike2 Version 9
Хирургические ножницы66 Vision Tech Co., Ltd.54010
Хирургические ножницы66 Vision Tech Co., Ltd.54002
Игла для швовNingbo Medical Co., Ltd3/8 дуга 2,5 * 8
вольфрамовый электродFHC, IncL504-01B
КсилокаинХуацин
AWG97028GM17064

Ссылки

  1. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Effects of monocular deprivation in kittens. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).
  2. Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. Critical period for monocular deprivation in the cat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 67 (1), 197-202 (1992).
  3. Guire, E. S., Lickey, M. E., Gordon, B. Critical period for the monocular deprivation effect in rats: assessment with sweep visually evoked potentials. Journal of Neurophysiology. 81 (1), 121-128 (1999).
  4. Wang, L., Sarnaik, R., Rangarajan, K. V., Liu, X., Cang, J. Visual receptive field properties of neurons in the superficial superior colliculus of the mouse. Journal of Neuroscience. 30 (49), 16573-16584 (2010).
  5. Niell, C. M. Cell Types, circuits, and receptive fields in the mouse visual cortex. Annual Review of Neuroscience. 38 (1), 413-431 (2015).
  6. Lee, S. H., et al. Activation of specific interneurons improves V1 feature selectivity and visual perception. Nature. 488 (8), 379-383 (2012).
  7. Cossell, L., et al. Functional organization of excitatory synaptic strength in primary visual cortex. Nature. 518 (2), 399-403 (2015).
  8. Lacaruso, M. F., Gasler, L. T., Hofer, S. B. Synaptic organization of visual space in primary visual cortex. Nature. 547 (7), 449-452 (2017).
  9. Metin, C., Godement, P., Imbert, M. The primary visual cortex in the mouse: Receptive field properties and functional organization. Experimental Brain Research. 69 (3), 594-612 (1988).
  10. Marshel, J. H., Garrett, M. E., Nauhaus, I., Callaway, E. M. Functional specialization of seven mouse visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1040-1054 (2011).
  11. Gordon, J. A., Stryker, M. P. Experience-dependent plasticity of binocular responses in the primary visual cortex of the mouse. The Journal of Neuroscience. 16 (10), 3274-3286 (1996).
  12. McGee, A. W., Yang, Y., Fischer, Q. S., Daw, N. W., Strittmatter, S. M. Experience-driven plasticity of visual cortex limited by myelin and Nogo receptor. Science. 309 (5744), 2222-2226 (2005).
  13. Sawtell, N. B., et al. NMDA receptor-dependent ocular dominance plasticity in adult visual cortex. Neuron. 38 (6), 977-985 (2003).
  14. Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D., Bonhoeffer, T., Hubener, M. Prior experience enhances plasticity in adult visual cortex. Nature Neuroscience. 9 (12), 127-132 (2006).
  15. Crozier, R. A., Wang, Y., Liu, C., Bear, M. F. Deprivation-induced synaptic depression by distinct mechanisms in different layers of mouse visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (4), 1383-1388 (2007).
  16. Tagawa, Y., Kanold, P. O., Majdan, M., Shatz, C. J. Multiple periods of functional ocular dominance plasticity in mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 8 (3), 380-388 (2005).
  17. Lickey, M. E., Pham, T. A., Gordon, B. Swept contrast visual evoked potentials and their plasticity following monocular deprivation in mice. Vision Research. 44, 3381-3387 (2004).
  18. Cang, J., Kalatsky, V. A., Lowel, S., Stryker, M. P. Optical imaging of the intrinsic signal as a measure of cortical plasticity in the mouse. Vision Neuroscience. 22 (5), 685-691 (2005).
  19. Khan, I. U., et al. Evaluation of different suturing techniques for cystotomy closure in canines. Journal of Animal & Plant Sciences. 23 (4), 981-985 (2013).
  20. Weisman, D. L., Smeak, D. D., Birchard, S. J., Zweigart, S. L. Comparison of a continuous suture pattern with a simple interrupted pattern for enteric closure in dogs and cats: 83 cases (1991-1997). Journal of the American Veterinary Medical Association. 214 (10), 1507-1510 (1999).
  21. Heneghan, C. P. H., Thornton, C., Navaratnarajah, M., Jones, J. G. Effect of isoflurane on the auditory evoked response in man. BJA: British Journal of Anaesthesia. 59 (3), 277-282 (1987).
  22. Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomenal. Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

K
Монокулярный визуальный лишение и глазной доминирование Пластика Измерения в мыши первичной визуальной коры
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.