Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60606

⸱

28 декабря 2019 г.

 ,  ,  , 
1Sino-French Hoffmann Institute, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, 2The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 3The State Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Представлены здесь подробные методы для вскрытия и липидных капель окрашивания эноцитов в личинки Drosophila с использованием BODIPY 493/503, липидные капли конкретных флуоресцентных красителей.

Аннотация

Липиды имеют важное значение для развития животных и физиологического гомеостаза. Дисрегуляция липидного обмена приводит к различным дефектам развития и заболеваниям, таким как ожирение и жировая печень. Как правило, липиды хранятся в липидных каплях, которые являются многофункциональными органеллами хранения липидов в клетках. Липидные капли различаются по размеру и количеству в разных тканях и при разных условиях. Сообщалось, что липидные капли жестко контролируются путем регулирования его биогенеза и деградации. В Drosophila melanogaster, эноцит является важной тканью для метаболизма липидов и недавно был определен в качестве аналога печени человека в отношении липидной мобилизации в ответ на стресс. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе регулирования метаболизма липидных капель в эноцитах остаются неуловимыми. Для решения этой проблемы крайне важно разработать надежный и чувствительный метод для непосредственной визуализации липидных капель динамических изменений в эноцитах во время разработки и в стрессовых условиях. Воспользовавшись липофильной BODIPY 493/503, липидные капли конкретных флуоресцентных красителей, описанный здесь подробный протокол для вскрытия и последующего липидных капель окрашивания в эноциты личинки Дрозофилы в ответ на голод. Это позволяет качественно анализировать динамику липидных капель в различных условиях с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, этот быстрый и высоко воспроизводимый метод может также быть использован в генетических экранах для инидентификации новых генетических факторов, связанных с метаболизмом липидных капель в эноцитах и других тканях.

Введение

Липиды имеют важное значение для выживания клеток. В дополнение к своей традиционной роли в качестве интегральных компонентов клеточных мембранных систем, липиды также играют важнейшие функции в энергоснабжении и сигнализации трансдукции на протяжении всего жизненного цикла отдельных животных1. Таким образом, метаболизм липидов должен соответствовать строгим правилам для поддержания физиологического гемостаза в клетках. Известно, что дисрегуляция липидного обмена приводит к различным заболеваниям, таким как диабет и жировая печень. Несмотря на большое значение метаболизма липидов в здоровье животных, механизмы, лежащие в основе регулирования метаболизма липидов, остаются в значительной степени неизвестными.

Дрозофила широко используется в течение многих лет, так как профессор Томас Х. Морган начал использовать их в исследованиях, связанных с генетикой и другими основными биологическими вопросами2. В последние несколько десятилетий, новые данные показали, что Drosophila является отличной моделью организма в изучении многих липидных метаболизма связанных заболеваний, таких как ожирение1,3. В частности, Drosophila делит высоки сохраненные метаболически гены с людьми и обладают подобными уместными тканями/органами и типами клетки для метаболизма липидов.

Например, жировое тело Дрозофилы,которое отвечает за хранение триацилглицерида, функционирует аналогично жировой ткани человека. В последнее время, кластер специализированных гепатоцитов, как клетки (т.е., эноциты), которые, как сообщается, функциональный аналог печени человека, было показано, что участвует в жирных кислот и углеводородного метаболизма у плодовых мушек4,5. Как и в случае с печенью млекопитающих, эноциты реагируют на голод, активируя образование липидных капель как у личинок, так и у взрослых дрозофил,что приводит к накоплению липидных капель в эноцитах4,6,8. Анатомически, эноциты плотно прикреплены к базальной внутренней поверхности боковой эпидермиса в кластерах примерно шесть клеток на гемиссегмент брюшной полости, что делает его невыполнимым, чтобы изолировать ээноциты кластеров от эпидермиса. Таким образом, эноциты должны быть прикреплены к эпидермису во время вскрытия и окрашивания.

Липиды хранятся в виде липидных капель, которые являются органеллами с однослойными мембранами в клетках9. Липидные капли существуют почти во всех типах клеток различных видов10. Динамика капель Липид, включая ее размер и количество, меняется в ответ на экологические стрессы. Это рассматривается как отражение метаболического статуса в ответ на стресс, такие как старение и голод7,8. Поэтому очень важно разработать осуществимый и надежный метод для качественного определения динамики липидных капель в эноцитах во время разработки и в стрессовых условиях. В частности, в третьем instar личинок, эноциты содержат мало или нет обнаруживаемых липидных капель при кормах, но они содержат многочисленные большие липидные капли после лишения питания4. Для проверки эффективности этого метода, предлагается для выполнения липидных капель окрашивания в эноциты в голодных условиях.

В настоящее время несколько липофильных красителей доступны для липидных капель окрашивания, таких как нефторные красители Судан Черный и Масло Красный O и флуоресцентные красители Нила Красный и BODIPY 493/50311. Судан Черный и Масло Красный O обычно используются для ткани холестерина эстеры и triacylglycerols и могут быть легко обнаружены с помощью световой микроскопии. Тем не менее, относительно высокое окрашивание фона и относительно низкое разрешение являются двумя ограничивающими факторами для его применения в качественном анализе динамики липидных капель. Для преодоления ограничений нефлуоресцентных красителей, Нил Красный и BODIPY 493/503 используются в качестве идеальной замены для липидных капель окрашивания. Было сообщено, что Нил Красный может также обнаружить некоторые unesterified холестерина, что делает BODIPY 493/503 более специфический краситель для клеточных капель липидов, в некоторой степени12,13,14.

Прежде всего, для выполнения необходимости быстрого и чувствительного анализа липидных капель в эноцитах, этот протокол представляет собой осуществимый и высоко воспроизводимый метод фиксаторской основе липидных капель конкретных окрашивания с помощью BODIPY 493/503 как пятно красителя. В этом отчете, эноциты вскрыты, и BODIPY 493/503 используется для липидных капель окрашивания в эноциты, в которых липидные капли обнаруживаются с помощью конфокальной микроскопии. Простота и доступность этой процедуры делают ее идеальной для модификации и дальнейшего использования в других приложениях, таких как цитометрия потока.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Укладка яиц

  1. Приготовьте стандартную пищу из кукурузной муки для откладки яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для рецепта и процедуры приготовления стандартных продуктов кукурузноймуки, используемой здесь, см.
  2. Подготовка свежих дрожжей пасты, добавив 6 мл дистиллированной воды до 4 г активных сушеных дрожжей в 50 мл центробежной трубки. Используйте шпатель, чтобы смешать и сделать пасту.
  3. Сделать яйцекладка бутылки, заполнив кукурузную муку пищи в бутылки и распространение примерно 1 г дрожжевой пасты на поверхность кукурузной муки пищи с помощью шпателя.
  4. Поместите мухи желаемых генотипов в яйцекладут бутылку и поместите его в инкубатор с постоянной температурой 25 градусов по Цельсию и влажностью 60%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные кресты обычно состоят из 150 девственных мух и не менее 75 самцов. Ведение мух в темноте, поместив светонепроницаемый ящик над яйцекладкой бутылки увеличит скорость воспроизведения.
  5. Перед сбором яиц, пусть мухи откладывают яйца на 1 ч, чтобы удалить все старые яйца, которые остаются храниться в женских яйцеклетки.
  6. Пусть мухи откладывают яйца в новой яйцекладке бутылку на 1 ч и удалить взрослых из бутылки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте время откладки яиц, чтобы свести к минимуму диапазон развития, чтобы получить личинки в точно контролируемой стадии развития.
  7. Разрешить яйца развиваться для 84 ч в третий instar личинок в инкубаторе на 25 градусов по Цельсию с 12 ч / 12 ч свет / темный цикл.

2. Голодное лечение для лирван

ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось выше, в третьем instar личинок, Есть несколько или нет обнаруживаемых липидных капель в эноцитах в нормальных условиях кормления, но многочисленные большие липидные капли могут быть вызваны в эноциты в условиях стресса, таких как голод. Для дальнейшей проверки этого метода, необходимо предварительно обработать эти личинки, чтобы вызвать биогенеза липидных капель в эноцитах. Здесь, время голода12h, 24 h, и 36 h было выбрано как парадигма. В частности, достаточно короткого периода голодания (например, 3 ч), чтобы вызвать обнаруживаемые липидные капли в эноцитах. Продолжительность голода может варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных целей и параметров.

  1. Сделать камеры для голода и контроля лечения.
    1. Для обработки голодания камеры: поместите фильтровальную бумагу соответствующего размера в 6 см Петри блюдо и пипетка 1 мл PBS на фильтровальную бумагу.
    2. Для контрольной обработки камер: поместите 5 мл стандартной кукурузной муки Блумингтона в чашку Петри.
  2. Используйте шпатель, чтобы аккуратно выкопать верхний слой пищи, содержащей личинки, которые все еще роются в пище и передать их в чашку Петри заполнены 5 мл PBS. Аккуратно перемешать личинки в PBS, чтобы удалить любое загрязнение пищевых продуктов из личинок и сделать его как можно более чистым.
  3. Используйте небольшую кисть, чтобы собрать 40 третьих личинок instar того же приблизительного размера. Сортировать их случайным образом в голод или контрольной камеры, с 20 личинок каждый.
  4. Поместите камеры в инкубатор при 25 градусах Цельсия с 60% влажностью и дайте развиваться 12 ч, 24 ч и 36 ч лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для личинок в камере голодания, добавить 1 мл PBS каждые 12 ч, чтобы избежать обезвоживания личинок.

3. Рассечение эноцитов

  1. Используйте небольшую кисть, чтобы выбрать личинки соответствующего возраста (12 ч, 24 ч, или 36 ч после лечения), а затем передать их в новое блюдо Петри заполнены 5 мл ледяной PBS для мытья.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 2.2 при работе с личинками в камере управления, чтобы удалить любое загрязнение пищевых продуктов.
  2. Заполните пластину вскрытия с ледяной PBS и использовать щипцы, чтобы мягко передать личинки в вскрытие пластины. Положите пластину вскрытия под стерео микроскопом для следующего шага вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура льда поможет замедлить движения личинок и облегчить рассечение.
  3. Включите личинки вентральной стороны вверх и дорсальный стороны вниз и осторожно удерживайте на месте с помощью щипцы. Закрепите личинки к пластине вскрытия, поместив рассечение штифт, хотя глотки на передней части и другой контактный через спиракль на задней части.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее легко определить дорсальную сторону по наличию торцев трахеи.
  4. Используйте весенние ножницы Vannas, чтобы резцы (продольный) через эпидермис от передней до заднего конца.
  5. Удалите внутреннюю ткань эпидермиса с помощью щипц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении ветвей трахеи необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать повреждения эноцитов, которые локализуются на внутренней поверхности эпидермиса.
  6. С щипками, получить рассечение булавки и передать эпидермиса в 1,5 мл микроцентрифуг трубки заполнены PBS на льду.
  7. Продолжайте вскрывать других личинок после описанной выше процедуры.

4. Липид капли окрашивания

  1. Инкубация вскрытого эпидермиса в фиксированном буфере30 мин при комнатной температуре (RT) на ротаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер фиксации содержит 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
  2. Удалите буфер фиксации, а затем быстро промыть. Для быстрой стирки добавьте 1 мл PBS на RT в трубку после удаления PFA, аккуратно перенапрягит ткани и отбросьте PBS.
    ПРЕДЕКТО: Буфер фиксации содержит PFA, который вреден для здоровья человека. Важно правильно утилизировать буфер фиксации в качестве опасных отходов.
  3. Вымойте образцы 3x в течение 5 минут каждый с PBS, чтобы вымыть все возможные остатки PFA.
  4. Инкубировать эпидермис с BODIPY 493/503 (1 мкг/мл; см. Таблица материалов) в течение 30 минут на RT на ротаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага вперед, оберните микроцентрифугтрубки с куском алюминиевой фольги, чтобы защитить образцы от света и свести к минимуму возможное фото-отбеливание.
  5. Удалите раствор окрашивания BODIPY 493/503 и вымойте образцы по 3x в течение 10 минут каждый с помощью PBS, чтобы полностью удалить остаточные красители.

5. Монтаж и визуализация

  1. Поместите 6 зл и земли на чистый слайд микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная среда используется в течение более длительного времени обнаружения на основе его антифадейных свойств.
  2. Используйте щипцы, чтобы забрать один эпидермис и осторожно удалить остаточные PBS с салфеткой.
  3. Поместите эпидермис в монтажную среду и отрегулируйте его ориентацию так, чтобы его внутренняя поверхность, содержащая эноциты, находилась на дне, а ее внешняя поверхность находилась на верхней части.
  4. Аккуратно поместите крышку на эпидермис.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите любой дополнительный монтаж среды утечки из-под крышки с салфеткой, если это необходимо. Чтобы облегчить визуализацию, аккуратно нажимайте на крышку с помощью щипц, чтобы при наблюдении за слайдом через микроскоп, эноцитное скопление можно легко собразить в одной плоскости. Кроме того, это практически возможно, чтобы сократить эпидермис в два полуэпидермиса через среднюю линию, чтобы избежать свертывания всего эпидермиса при монтаже тканей.
  5. Нанесите четкий лак для ногтей по краям крышки для уплотнения.
  6. Положите слайды в светонепроницаемый образец коробки и дайте лак для ногтей, чтобы высохнуть на RT, который может занять 5-10 минут.
  7. Продолжить микроскопический анализ. Возьмите изображения с помощью конфокального микроскопа (увеличение 63x с оптимизированными настройками фильтра GFP или FITC, возбуждение 488 нм, эмиссия 503 нм) для получения чистых и чувствительных сигналов с минимизированным фоном.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное выполнение этой процедуры должно привести к четкой липидных капель окрашивания, что показывает количество и размер липидных капель в эноциты. Рисунок 1A,A',''' показывает, что Есть несколько обнаруживаемых липидных капель (зеленых точек) в эноцитах нормального кормления личинок на различных стадиях развития. Рисунок 1B,B','B'' показывает увеличение липидных капель (зеленых точек) количес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Среди тех, изложенных выше, Есть несколько важных шагов в этом протоколе, с яйцом отложить период времени является одним из них. Как липид-мобилизационная ткань, эноцит очень чувствителен к состоянию питания6,8. Длительные периоды откладки яиц могут привести к тому, что воронившиеся личинки и усиление пищевой конкуренции приводят к неточным результатам. 1 ч яйцекладка период времени, используемого в этом протоколе позволяет личинки развиваться без питания конкуре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31671422, 31529004 и 31601112), проектом 111 (D18010), местным проектом инновационных и исследовательских групп программы Гуандун-Перл-Ривер Таланты (2017BT01S155), а также Китайский фонд постдокторской науки (2018M640767).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужная пробирка 50 млCorning43082950 мл
6 см Чашка ПетриThermo Fisher1503266 см
АгарДля еды от мух
Алюминиевая фольган/д Н/дЗащитите шмапл от света
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Краситель для окрашивания липидными каплями
Конфокальный микроскопLeicaLeica TSC SP5Конфокальная визуализация
Кукурузный сиропДля корма от мух
КукурузнаяДля корма от мух
Покровное стеклоCitoglas10212424C20 × 20 мм, толщина 0,13-0,17
Штифт для вскрытияН/Д
Пластина для препарированияН/Д/Д
Фильтровальная бумагаН/ДН/ДДиаметр: 11 см
Фиксирующий буферН/ДН/Д4% параформальдегид (PFA) в 1x
PBS ЩипецDumont11252-30#5
ИнкубаторJiangnanSPX-380Для культивирования мух
Микроцентрифужная пробиркаAxygenMCT-150-C1,5 мл Предметное
стекло для микроскопииCitoglas10127105P-G
Монтажный материалVECTASHIELDАнтифаде Монтажный материалH-1000Антивыцветающий монтажный материал
Лак для ногтейPanEraAAPR419Уплотнить покровное стекло
КистьН/ДН/Д
ПБСН/Д1x PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4, pH 7,4)
РотаторKylin-Bell Lab InstrumentsWH-986
НожницыSmartdata MedicalSR81Vannas пружинные ножницы
Соевая мукаДля еды от мух
ШпательН/Д/Д
Стандартный корм из кукурузной мукиН/Д/ДКодирование в Блумингтоне Стандартный рецепт еды из кукурузной муки
Стерео микроскопLeicaLeica S6EДля вскрытия тканей
Бумага для салфетокН/д/д
ДрожжиДля мух пищевой
ywХранится как лабораторный запасН/ДДрозофила
мука Инсекционная пластина Н/Д Н Н Н Н

Ссылки

  1. Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
  2. Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
  3. Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
  4. Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
  5. Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
  6. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
  7. Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
  8. Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
  9. Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
  10. Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
  11. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  12. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
  13. Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
  14. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
  15. BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
  16. Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
  17. Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

BODIPY 493 503
Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.