Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo инфекции с Лейшмания amazonensis для оценки паразитов virulence у мышей

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60617

⸱

20 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем составленный протокол для оценки кожной инфекции мышей с Leishmania amazonensis. Это надежный метод изучения паразитной вирулентности, позволяющий системно смотреть на реакцию позвоночных хозяев на инфекцию.

Аннотация

Лейшмания spp. являются простейшие паразиты, которые вызывают лейшманиозы, заболевания, которые представляют широкий спектр клинических проявлений от кожных до висцеральных поражений. В настоящее время 12 миллионов человек, по оценкам, инфицированы лейшманией во всем мире и более 1 миллиарда человек живут в опасности заражения. Leishmania amazonensis является эндемическим заболеванием в Центральной и южной Америке и обычно приводит к кожной форме заболевания, которая может быть непосредственно визуализирована в животной модели. Таким образом, штаммы L. amazonensis являются хорошими моделями для кожных исследований лейшманиоза, потому что они также легко культивируются в пробирке. C57BL/6 мышей имитировать L. amazonensis-управляемыйпрогрессирования болезни наблюдается у людей и считаются одним из лучших мышей штаммов модель кожного лейшманиоза. В позвоночных хозяина, эти паразиты населяют макрофаги, несмотря на защитные механизмы этих клеток. Несколько исследований используют in vitro макрофаговые анализы инфекции для оценки инфекционной паразита в различных условиях. Однако подход in vitro ограничивается изолированной клеточной системой, которая игнорирует реакцию организма. Здесь мы компилировать in vivo murine инфекции метод, который обеспечивает системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита. Подробный протокол для инфекции in vivo мышей C57BL/6 с L. amazonensis включает дифференциацию паразитов в инфекционные амастиготы, мышей подножки кожной прививки, развитие поражения, и определение нагрузки паразита. Мы предлагаем этот устоявшийся метод как наиболее адекватный метод физиологических исследований иммунной и метаболической реакции хозяина на кожный лейшманиоз.

Введение

Лейшманиозы являются во всем мире распространенными паразитарными инфекционными заболеваниями, представляющими важные проблемы в развивающихся странах и признаны одним из наиболее важных забытых тропических заболеваний Всемирной организацией здравоохранения1,2. Лейшманиазы характеризуются кожными, слизистыми и/или висцеральными проявлениями. Кожный лейшманиоз, как правило, вызвано L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica и L. aethiopica3. Эта форма заболевания часто самовосстановления у людей из-за индукции защитного клеточного иммунного ответа. Тем не менее, клеточный иммунный ответ может потерпеть неудачу, и болезнь может прогрессировать до распространения кожного лейшманиоза4,5. Существует нет доступной вакцины из-за разнообразия среди видов Лейшмании и принимающей генетического происхождения6,7. Варианты лечения также ограничены, поскольку большинство имеющихся в настоящее время лекарств являются либо дорогими, токсичными, и / или может потребовать длительного лечения8,9. Кроме того, были сообщения о лекарственной устойчивости против доступных методов лечения10,11.

Возбудитель лейшманиозов является простейший паразит Лейшмания. Паразит представляет две различные морфологические формы в своем жизненном цикле: промастиготы, флагеллированная форма, встречающаяся в мухах; и amastigotes, внутриклеточная форма, найденная в паразитофорных вакуолах млекопитающих хозяина макрофагов12,13. Способность Amastigotes вторгаться, выживать и размножаться, несмотря на защитные механизмы макрофагов позвоночных хозяина подлежат многим исследованиям14,15,16,17. Следовательно, несколько исследовательских групп были описания в пробирке макрофагов инфекции анализы для оценки воздействия конкретных факторов окружающей среды, а также паразитов и генов-хозяев на инфекционность паразитов. Этот ассс и сойд представляет собой ряд преимуществ, таких как способность адаптировать исследования к формату высокой пропускной способности, относительно более короткий период времени для получения результатов, и сокращение числа лабораторных животных, принесено в жертву18. Тем не менее, результаты in vitro анализы ограничены, потому что они не всегда реплицируются в vivo исследования14,19,20,21. In vivo анализы обеспечивают системный физиологический обзор взаимодействия хозяина-паразита, который не может быть полностью имитирован in vitro анализы. Например, иммунологические исследования могут быть выполнены с помощью иммуногистохимических анализов из собранных участков ткани разделов или даже из popliteal лимфатических узлов для анализа восстановленных иммунных клеток22.

Звери часто используются в качестве модели для заболеваний человека в биологических и биомедицинских исследований, чтобы лучше понять основные физиологические механизмы заболеваний23. В случае лейшманиоза, маршрут, участок, или доза прививки влияют на исход заболевания24,25,26,27. Кроме того, восприимчивость и устойчивость к инфекции у людей и мышей строго регулируются генетическим фоном хозяина и паразита4,5,22,28,29,30,31. BALB/c мышей очень восприимчивы к L. amazonensis кожной инфекции, показывая быстрое прогрессирование заболевания с распространением паразитов в лимфатических узлов, селезенки и печени32. Как болезнь может прогрессировать до кожных метастазов, инфекция может быть фатальным. В отличие от этого, C57BL/6 мышей часто развиваются хронические поражения с стойкими паразитами нагрузки в L. amazonensis инфекциианализы 33. Таким образом, L. amazonensis инфекции с этой конкретной мыши видов считается отличной моделью для изучения хронических форм кожного лейшманиоза у людей, потому что он имитирует прогрессирование болезни лучше, чем BALB / c мышей модель5,34.

Таким образом, мы предлагаем, что мурин in vivo инфекции является полезным методом для Лейшмании вирулентности физиологических исследований, применимых к болезни человека, что позволяет системное представление о принимающей паразит взаимодействия. Пересмотр устоявшихся анализов22, мы представляем здесь составленный пошагонный протокол in vivo инфекции C57BL/6 мышей с L. amazonensis, которая включает в себя дифференциацию паразитов в топорные amastigotes, мышей подножки кожной прививки, развитие поражения, и определение нагрузки паразитов. Этот протокол может быть адаптирован к другим штаммам мышей и видам лейшмании, которые вызывают кожные лейшманиазы. В заключение, метод, представленный здесь имеет решающее значение в выявлении новых целей противлейшмании наркотиков и вакцин, а также в физиологических исследованиях принимающей иммунной и метаболических реакций на инфекции Лейшмании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию в Институте бионауки Университета Сан-Паулу (CEUA 342/2019), и были проведены в соответствии с рекомендациями и политикой по уходу и использованию лабораторных животных штата Сан-Паулу (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) и бразильское правительство (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Все шаги, описанные в разделах 1-5, должны выполняться асептически внутри ламинарных шкафов. Личные защитные средства должны быть использованы при обработке живых паразитов Лейшмания.

1. В пробирке Дифференциация L. amazonensis Promastigotes в Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

ПРИМЕЧАНИЕ: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) паразит был использован в этом рассее. В зависимости от цели исследования, форма инфекционного паразита может быть получена либо путем очищения метациклической формы с использованием градиента плотности, как ранее описано14, или путем дифференциации промастиготов в амастиготы, в соответствии со следующим протоколом.

  1. Выращивайте La promastigotes в 25 см2-клеточной культуры колбу, содержащей 10 мл среднего для промастиготей (про-средний) (рН 7,0).
  2. Инкубировать при 25 градусах По Цельсию в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте promastigote культур, которые были проложены в пробирке менее 10x, чтобы избежать потери вирулентности и анеуплоидных изменений паразитов39,40,41,42,43,44.
  3. Пипетка 5 мл логарифмической фазы роста promastigote культуры в новый 25 см2 колбы.
  4. Добавьте 5 мл среднего для аксенанских амастигов (ама-средний) (рН 5,2).
  5. Инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение 3-4 дней.
  6. Разделите культуру, разбавляя ама-медиум в соотношении 1:3 в новую2-сантиметровую колбу.
  7. Инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение 3-5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать амастиготы axenic на срок до 5 дней, так как он представляет собой конец созревания37.

2. C57BL/6 Footpad Инфекция с L. amazonensis

ПРИМЕЧАНИЕ: Самки C57BL/6 мышей (6-8 недель) были получены и поддерживается в Центре животных Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу. Звери получали пищу и воду ad libitum.

  1. Подсчитайте культуру акетических амастиготов, переведя аликот суспензии паразита, разбавленного в PBS, в камеру Нойбауэра (т.е. гемоцитометр). Подсчитайте не-flagellated паразитов, которые представляют формы amastigotes.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, Трипан синий (1:1) может быть использован для подсчета числа жизнеспособных amastigotes (т.е., те, которые не окрашены Трипан синий).
  2. Разбавить апорические амастиготы в PBS в соответствии с желаемой дозой инокулума и количество инокулумов, предназначенных (1 х 106 апорных амастигот в 50 ЗЛ PBS рекомендуется).
  3. Загрузите туберкулин шприц с 27 G иглы с подготовленным паразитподвески.
  4. Анестезия C57BL/6 мыши с помощью 3-5% изолюран, как рекомендовано Университетом Джонса Хопкинса по уходу за животными и использования комитета45. Оцените глубину анестезии, испытав реакцию мыши на щепотку ног.
  5. Прививка 50 зл гомогенизированной подвески паразита (1 х 106 апорных амазиготов или желаемой дозы инокулума) в подплантарной ткани левой задней подножия, используя ранее загруженный шприц туберкулина (шаг 2.3).

3. Мышь Footpad развитие поражения

  1. Измерьте прогрессирование поражения один раз в неделю, измеряя толщину левой (инфицированных) и правых (неинфицированных) подножок с помощью калипера.
  2. Рассчитайте разницу толщины между левой и правой задними подножками еженедельно, чтобы оценить прогрессирование поражения.
  3. Участоте рассчитанные различия на оси Y и времени заражения на X-оси и вычислите статистическую значимость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с рекомендациями Комитетов по уходу за животными и использованию животные должны быть принесены в жертву до того, как инфицированное отделение становится язвено, поскольку язвы кожи могут привести к вторичной инфекции. Как показано на дополнительной рисунке 1, это занимает около 10 недель для поражений представить признаки язвы с дозой паразита (106 аксиготы) и принимающей штамм (C57BL/6), используемых в этом протоколе. Мышей следует принести в жертву для извлечения поражения до признаки язвы наблюдаются.

4. Мыши Footpad Извлечения и паразитов Ограничение разбавления

  1. Подготовьте 96 хорошо пластины (плоское дно) для ограничения разбавления асссе46,47, добавив 180 л про-средних для всех скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте четыре полосы пластины (половина пластины) для каждого животного, представляющих четырехсторонние анализы (т.е., животных 1 и полосы A-D; животных 2 и полосы E-H).
  2. Добавьте 1 мл про-медиума в трубку измельчителя стеклянной ткани на поражения и взвесьте трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка должна быть стерильной, поэтому используйте стерильную крышку и взвесьте трубку с закрытой крышкой, если они взвешивают за пределами ламинарного шкафа.
  3. Пожертвуйте животным в камере CO2, следуя рекомендациям Комитетов по уходу за животными и использованию. Дезинфекция животных путем распыления с 70% этанола.
  4. Акциз ноги животного на пятки, чтобы извлечь инфицированных подножки и спрей 70% этанола на подножку для дезинфекции. Убедитесь в стерилизации ножниц и щипцы, сохраняя их пропитанной в 70% этанола.
  5. Поместите зараженную подножку в стерильную чашку Петри и расчлените с помощью стерильных щипц и скальпеля, чтобы собрать все мягкие ткани. Отбросьте кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Единообразие в рассечении шаг рекомендуется, чтобы избежать предвзятого восстановления тканей.
  6. Перенесите собранные ткани в трубку измельчителя стеклянной ткани с про-средой, затем взвесьте трубку еще раз, чтобы определить вес поражения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения щипцы и скальпеля непосредственно в среду, так как небольшие объемы могут быть удалены, в результате чего недооцененный вес ткани. Вес поражения рассчитывается путем вычитания веса трубки, содержащей про-средний с собранной тканью из веса трубки, содержащей только про-средний.
  7. Гомогенизировать ткань 10x с помощью мясорубки для полного нарушения тканей.
  8. Разрешить смесь в отложения в течение 10 минут, а затем собрать 20 зл супернатанта.
  9. Нагрузка 20 зл и супернатант в1-й колонне1-й полосы 96 хорошо плиты подготовлены в шаге 4.1. Повторите это для следующих трех полос, чтобы иметь четыре раза для каждого животного (т.е. для животных 1 добавить 20 зл к каждой скважине и этикетки A1, B1, C1, и D1).
  10. Гомогенизировать каждую скважину в1-й колонке 10x с помощью многоканального пипетки. Затем перенесите 20 л разбавленных образцов из1-й колонки в2-ю колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно гомогензировать каждый колодец 10x от одного столбца к другому.
  11. Повторите шаг 4.10 для всех оставшихся столбцов до последней колонки (12тыс.)и отбросьте окончательные 20 л разбавленного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение советы после каждого разбавления, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  12. Печать пластин с пленкой и инкубировать при 25 градусов по Цельсию в течение 7 дней во влажной камере.

5. Определение нагрузки на паразитов

  1. Проанализируйте пластины после 7 дней инкубации с помощью перевернутого микроскопа, чтобы определить последний паразит-содержащих хорошо для каждой полосы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также возможно иметь представление о росте паразитов, или плотность клеток, путем визуального анализа изменения цвета и мутности среды.
  2. Рассчитайте нагрузку ткани паразита для каждой полосы, разделив коэффициент разбавления на вес поражения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В определенной полосе, если паразиты присутствуют только в столбцах 1-5 (т.е. скважины А1-А5 являются положительными для роста паразитов), это означает, что столбец 5 содержал только 1 паразита, столбец 4 содержал 10 паразитов и так далее, в кратных десяти. Колонка 1 будет содержать 104 паразитов, что представляет собой количество паразитов в первоначальном 20 Зл супернатанта (неразбавленный образец в шаге 4.7). Поскольку этот 20 л был разбавлен 180 л про-средних, начальная трубка содержала 5 х 105 паразитов: (1 х 104) / (0,02 мл) 5 х 105 паразитов /1 мл. Затем, паразит нагрузки в том, что поражения могут быть рассчитаны путем деления первоначальной концентрации паразита на вес поражения: (5 х 105) / вес поражения (см. шаг 4.6).
  3. Участок средний четырехкратный результат для каждого животного с журналом Y-масштаб.

6. Статистический анализ

  1. Представляем данные в качестве среднего стандартного отклонения, используя по крайней мере пять животных на экспериментальную группу в качестве репликаций.
  2. Выполняйте статистический анализ с помощью неспаренного двуххвостого теста, учитывая значение p slt; 0,05 как значительное.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Лейшмания простейшие паразиты существуют в двух формах развития во время их жизненного цикла в беспозвоночных и позвоночных хостов: promastigotes, размножающихся форм, найденных в прозме женского sandfly; и amastigotes, пролиферативные формы, найденные в паразитофорных вакуол из клеток-хозяев млекопитающих. Promastigotes имеют удлиненный корпус примерно 1,5 мкм в ширину и 20 мкм в длину, с flagellum обычно выходит из передней конечности. Amastigotes имеют округлые или яйцевидное ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ инфекции in vivo, описанный в этом протоколе, позволяет любому исследователю оценить in vivo кожный лейшманиоз, рассматривая взаимодействие хозяина-паразита в системном сценарии. Эти анализы были использованы многими группами22,24,27,29,31,32,34,49 и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Нильса Олсена Сарайву Камара из Центра животных Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу за поддержку и профессора д-ра Сильвию Рени Ульяну за предоставление мясорубки из стеклянной ткани. Эта работа была поддержана Сан-Паулу научно-исследовательский фонд (FAPESP - MFLS ' грант 2017/23933-3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночная пластинаGreiner bio-ne655180Плоскодонная пластина для ограничения разведения
анализа аденинаSigmaA8626Добавка добавлена в среду M199 для клеточных культур
Mitutoyo700-118-20Штангенциркуль для измерения толщины подушечки лапы
колбы для клеточной культурыCorning353014
Eppendorf5804RОборудование, используемое для разделения образцов на основе их плотности
CO2 инкубатор 34 ° CThermo Scientific3110Инкубатор для дифференцировки амастиготов
этанолMerckK50237083820Дезинфицирующее средство для общих продуктов
фетальной бычьей сывороткиGibco12657-029Добавка, добавленная в среду для культивирования клеток M199
стеклянная ткань Трубка для измельчения стеклянной тканиThomas Scientific3431 E04Трубка для сбора и разрушения инфицированной ткани
подушечки ногиглюкозаSynthG1008.01.AHДобавка добавлена в среду для клеточных культур M199
Программное обеспечение GraphPad PrismGraphPadПрограммное обеспечение, используемое для построения графиков данных и расчета статистической значимости
heminSigmaH-2250Добавка добавлена в среду для клеточных культур M199
HEPESPromegaH5303Добавка добавлена в инкубатор для клеточных культур M199
25 ° CFanem347CDИнкубатор для культивирования промастигот
инвертированный микроскопNikonTMSОборудование для визуального анализа культур промастиготы и амастиготы
изофлуранИнгаляционные анестетики для мышей (3-5%)
ламинарный шкафVecoVLFS-09Шкаф биобезопасности для асептической рабочей зоны
M199 питательные средыGibco31100-035Питательная среда для клеточных культур для микроцентрифужной пробирки для культивирования Leishmania
AxygenMCT150CМикротрубка, используемая для сбора, обработки и хранения образцов
многоканальная пипеткаLabsystemsF61978Многоканальная пипетка, используемая для анализа ограничения разведения
NaHCO3Merck6329Добавка добавлена в среду для клеточных культур M199
NaOHSigmaS8045Добавка добавлена в среду для клеточных культур M199
Камера НейбауэраHBG2266Гемоцитометр для подсчета паразитов суспензия
оптического микроскопаNikonE200Оптическое оборудование, используемое для подсчета паразитов
парапленкиBemis349Гибкий и прочный пластик для герметизации пластина
пенициллин/стрептомицинGibco15140122Добавка, добавляемая в среду для культивирования клеток M199
чашки ПетриTPP93100Стерильная чашка для препарирования ткани подушечки ноги
Набор пипетокGilsonF167360Набор микропипеток, содержащий четыре пипетки (P2 P20 P200 P1000)
весыQuimisBG2000Оборудование, используемое для взвешивания собранной подушечки ноги
скальпельСолидор10237580026Скальпель для разрезания и сбора ткани подушечки ноги
Серологическая пипетка 10 млГнездо327001Стерильная пипетка, используемая для переноса наконечников миллитерных объемов
AxygenНаконечник пипетки, используемый для переноса микролитровых объемов
Trypan blueGibco15250-061Краситель, используемый для подсчета жизнеспособных паразитов
триптиказ пептонMerckSupplement добавлен в среду M199 для клеточной культуры
туберкулинового шприцаBD305945шприц с иглой 27G для инокуляции суспензии паразита
для поражений

Ссылки

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296(2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13(2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300(2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052(2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594(2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165(2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140(2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025(2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22(2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108(2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486(2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022(2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238(2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144(2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80(2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266(2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340(2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279(2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764(2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842(2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980(2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554(2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026(2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Подушечка лапы мышикожный лейшманиозпрогрессирование пораженияопределение паразитарной нагрузкиаксенические амастиготыподподошвенная инокуляцияметод лимитирующего разведения
В Vivo инфекции с Лейшмания amazonensis для оценки паразитов virulence у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.