Методическая статья

Выявление ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1 с помощью системы сплит-люциферазы

DOI:

10.3791/60652

⸱

21 декабря 2019 г.

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод скрининга вирусных агентов против гепатита В, которые подавляют взаимодействие HBx-DDB1 с помощью разделенной системы анализов люциферазы. Эта система позволяет легко обнаруживать белково-белковые взаимодействия и подходит для выявления ингибиторов таких взаимодействий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует настоятельная необходимость в новых терапевтических агентах при инфекции, инфицированной вирусом гепатита В (HBV). Хотя в настоящее время доступнынущие нуклеосы (т)ide аналоги мощно подавляют репликацию вируса, они не имеют прямого влияния на выражение вирусных белков, транскрибированных из вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA). Поскольку высокая вирусная нагрузка антигена может играть определенную роль в этом хроническом и HBV-связанных канцерогенеза, цель лечения HBV является искоренение вирусных белков. HBV регулятивного белка X (HBx) связывается с хозяином ДНК-связывающего белка 1 (DDB1) белка для деградации структурного поддержания хромосом 5/6 (Smc5/6), в результате активации вирусной транскрипции от cccDNA. Здесь, используя систему проверки дополнения разделенной люциферазы, мы представляем комплексную комплексную систему скрининга для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1. Наш протокол позволяет легко обнаруживать динамику взаимодействия в режиме реального времени в живых клетках. Этот метод может стать ключевым ассеем, чтобы обнаружить новые терапевтические агенты для лечения HBV инфекции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекция вируса гепатита В (HBV) является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, с ежегодными оценками 240 миллионов человек, хронически инфицированных HBV и 90000 смертей из-за осложнений от инфекции, в том числе цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1. Хотя нынешние анти-HBV терапевтические агенты, нуклеосы (т) аналоги, достаточно подавляют вирусную обратную транскрипцию, они редко достигают ликвидации вирусных белков, что является долгосрочной клинической целью. Их плохое влияние на устранение вирусного белка из-за их отсутствия прямого влияния на вирусную транскрипцию от эпизомальной вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA) минимомосомы в ядре гепатоцитов2.

Транскрипция HBV активируется HBV регулятивным X (HBx) белком3. Недавние исследования показали, что HBx деградирует структурное обслуживание хромосом 5/6 (Smc5/6), фактор ограничения хозяина, который блокирует Транскрипцию HBV от cccDNA, через угон DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin лигазе комплекс4,5,6. Таким образом, решающим шагом в продвижении вирусной транскрипции от cccDNA считается взаимодействие HBx-DDB1. Соединения, способные ингибировать связывание между HBx и DDB1 может блокировать вирусную транскрипцию, и действительно нитазоксанид был определен в качестве ингибитора взаимодействия HBx-DDB1 через систему скрининга, разработанную в нашей лаборатории7.

Здесь мы представляем нашу удобную систему скрининга, используемую для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1, которая использует разделенный люциферазы комплементарный анализ7,8. Сплит luciferase субъединиц сливается с HBx и DDB1, и взаимодействие HBx-DDB1 приносит подразделения в непосредственной близости к форме функционального фермента, который генерирует яркий люминесцентный сигнал. Поскольку взаимодействие между подразделениями обратимо, эта система может обнаруживать быстро диссоциирующие белки HBx-DDB1(рисунок 1). С помощью этой системы можно легко проверить большую библиотеку соединений, что может привести к открытию новых соединений, способных эффективно ингибировать взаимодействие HBx-DDB1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление сплит-люциферазы асссея показано на рисунке 1A,и процесс проверки изложен на рисунке 1B. Динамика взаимодействия может измеряться в режиме реального времени без клеточного лиза.

1. Подготовка клеток

  1. Поддержание культивированных клеток HEK293T в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнены 10% v/v сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1x пенициллина/стрептомицина при 37 КК в 20% O2 и 5% CO2.
  2. Семя 5 х 106 ячеек в 100 мм блюдо с 10 мл DMEM и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
  3. Переходно пресловуто 1 мкг HBx и DDB1 с разделенными люциферасами в клетки в соответствии со следующим методом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество плазмидной ДНК трансфицируется может зависеть от трансфекционного регента используется. Оптимальное положение сплит-люциферазы, сросанного с целевым белком, должно быть определено заранее. В этом случае HBx, слитый с LgBit на C-терминах HBx (HBx-LgBit) и DDB1, слитый с SmBit на N-термине DDB1 (SmBit-DDB1), обеспечил наилучшие результаты (т.е. самые яркие сигналы люциферазы). Этот процесс был сообщен ранее подробно7.
    1. Разбавить 1 мкг HBx-LgBit, выражающий плазмид ДНК и 1 мкг SmBit-DDB1, выражающий плазмид ДНК(Таблица материалов)в буфере конденсации ДНК(Таблица материалов) в общей объеме 300 зл.
    2. Добавьте 16 зл усилитель раствора(Таблица материалов)и перемешайте путем вихря в течение 1 с.
    3. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 3 мин.
    4. Добавьте 60 кЛ трансфекционного реагента(Таблица материалов)в образец и смешайте путем вихря в течение 10 с.
    5. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 8 мин.
    6. Во время инкубации, аспирируют культурную среду из тарелки (подготовленной в шаге 1.2) и мыть клетки с 5 мл фосфат-буферизированного соления (PBS). Удалить PBS по аспирации и добавить 7 мл DMEM.
    7. Добавьте 3 мл DMEM в трубку, содержащую трансфекционные комплексы. Смешайте путем пипетки и добавьте трансфекционные комплексы на клетку в тарелке 10 см.
  4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе под 5% CO2 на 10 ч.
  5. Пересить клетки в белый 96 хорошо пластины на 5 х 104 клетки / хорошо в 50 Л л среднего / хорошо в соответствии со следующим методом.
    1. Удалите отработанные среды культуры клеток и мыть клетки с 5 мл PBS.
    2. Удалить PBS по аспирации, добавить 1 мл 0,25% трипсин-EDTA, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы отделить клетки.
    3. Добавьте 4 мл DMEM и разогнать среду, несколько раз протянив по поверхности слоя клетки. Перенесите суспензию клетки в трубку.
    4. Центрифуги клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Откажитесь от супернатанта и отрепримите клеточные гранулы в 1 мл PBS.
    6. Центрифуги яточной подвески на 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отбросить супернатант.
    7. Разбавить клеточные гранулы с буферизированной средой культуры клеток(Таблица Материалов)дополнены 10% FBS к плотности посева 1,0 х 106 клеток/мл.
    8. Пипетка 50 зл клеточной подвески в каждой скважине 96 хорошо пластины и вернуть клетки в инкубатор.
  6. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия под 5% CO2 на 10 ч.

2. Комплексный скрининг

  1. Во время инкубации разбавить скрининговые соединения(Таблица материалов)и растворитель (диметилсульфоксид (DMSO) при концентрации 13,5x. Например, если запас составляет 10 мМ, а концентрация скрининга составляет 10 мкм, добавьте 1 кЛ стокового раствора к 73,1 л буферизированной среды культуры клеток.
  2. Добавьте 12,5 л люминесцентного субстрата(Таблица материалов)к каждой скважине и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как отрицательный контроль, скважины на обоих концах пластины (т.е. колонны 1 и 12) не должны содержать люминесцентный субстрат.
  3. Измерьте светимость исходного состава с помощью люминометра(Таблица материалов).
  4. Сразу же после первоначального измерения добавьте 5 зЛ соединений и контролируйте DMSO, разбавленное в шаге 2.1 к каждой скважине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация будет 10 мкм.
  5. Измерьте значения люминесценции каждые 30 минут в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть инкубирована в темноте при комнатной температуре.
  6. Рассчитайте ингибирующие эффекты по сравнению с контролем лечения ДМСО после нормализации к исходным сигналам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг каждого соединения в дублировать или тройной может уменьшить вариации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные результаты после использования этого протокола показаны на рисунке 2A,B. Соотношение сигнала к фону превышало 80, а коэффициент9 (индекс качества золотого стандарта для скрининга с высокой пропускной стоимостью) превышал 0,5, что свидетельствует о том, что эта система анализов является приемлемой для скрининга с высокой пропускной стоимостью. С пороговым набором для ингибирования в размере

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали удобный метод скрининга с использованием разделенной люциферазы, чтобы найти ингибиторы связывания HBx-DDB1. Динамика взаимодействия может быть обнаружена в режиме реального времени в живых клетках без необходимости в клеточном лизах. Ингибирование взаимодействия HBx-DDB1 приводит к восстановлению Smc5/6, что приводит к подавлению вирусной транскрипции, экспрессии белка и выработке cccDNA7. Этот новый механизм противовирусного действия может преодолеть недостатки текущей терапии HBV...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Гранты в помощь от Министерства образования, Культура, спорт, наука и технологии, Япония (#19H03430 и #17K09405 до M.O., и #19J11829 к K.S.), грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям (#18H05024 к M.O.), по исследовательской программе по гепатиту от Японского агентства медицинских исследований и разработок, AMED (до M.O., #JP19fk021005), по программе по инновационному развитию и применению новых препаратов для борьбы с гепатитом B (#JP19fk0310102 к К.) грантов от AM Японский фонд прикладной энзимологии и от Фонда Кобаяси по онкологическим исследованиям (М.О.), GSK Japan Research Grant 2018 (к К.С.), а также грантом Мемориального исследовательского фонда Миякавы (К.С.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микропланшет для клеточных культур, 96 лунок, ПС, F-BOTTOMGreiner-Bio-One GmbH655098
DMEMSigma AldrichD6046
DMSOTocris Bioscience3176
Effectene реагент для трансфекцииQiagen301425Включает в себя буфер для конденсации ДНК, раствор энхансера и реагент для трансфекции
FBSNichirei
GloMax 96 микропланшетный люминометрPromegaE6521
HBx– LgBit экспрессирует ДНК-плазмидуНаша лабораторияДоступна по запросу
HEK293T клетокАмериканская коллекция типовых культурCRL-11268
NanoBiT PPI стартовые системыPromegaN2015Включает реагент Nano-Glo Live Cell
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021Описан в рукописи как «буферизованная среда для культивирования клеток»
PBSTakaraT900
Пенициллин-стрептомицинSigma AldrichP0781
Screen-Well одобренная FDA библиотека лекарств V2 версия 1.0Enzo Life SciencesBML-2841Здесь использовались следующие соединения: мехинол, гидрат меркаптопурин, месна, мештрунол, метапротеренол гемисульфат, метараминола битартрат, метатакзолон, метахолина хлорид, метазоламид, метенамина гиппурат, Метокарбамол, метотрексат, метоксален, метскополамин бромид, метсуксимид, метилклотиазид, метиламинолевулинат и миддот; HCl, метилэргоновина малеат, метолазон, метирапон, мексилетин и миддот; HCl, микафунгин, миконазол, мидодрин и миддот; HCl, миглитол, милнаципран и миддот; HCl, миртазапин, митотан, моэксиприл и миддот; HCl, мометазона фуроат, мупироцин, надолол, нафциллин· Na, naftifine· HCl, наратриптан и миддот; HCl, натамицин, небиволол и миддот; HCl, неларабин, непафенак, невирапин, ниацин, никотин, нилотиниб, нилутамид, нитазоксанид, нитизинон, нитрофурантоин, низатидин, нортриптилин и миддот; HCl, олсалазин и миддот; Na, орлистат, оксапрозин, окстрифиллин, оксибутинин хлорид, окситетрациклин&миддот; HCl, палиперидон, палоносетрон и миддот; HCl, паромомицина сульфат, пазопаниб и миддот; HCl, пеметрексед динатрий, пемироласт калия, пеницилламин, пенициллин G калия, пентамидин изетионат, пентостатин, периндоприл эрбумин, перметрин, перфеназин, фенелзин сульфат, фенилэфрин, фитонадион, пимекролимус, питавастатин кальция и подофилокс
SmBit– DDB1 экспрессирующая ДНК плазмидаНаша лабораторияДоступна по запросу
Trypsin-EDTASigma AldrichT4049
175012

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
  2. Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
  3. Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).
  4. Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
  5. Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
  6. Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648(2017).
  7. Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
  8. Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  10. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).
  11. Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
  12. Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
  13. de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115(2014).
  14. Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HBx DDB1 InteractionSplit Luciferase AssayCompound ScreeningProtein Protein InteractionHBV Therapeutic AgentsHEK293T Cell TransfectionLuminescence MeasurementZ Prime ScoreNitazoxanide InhibitionReal Time Detection

Похожие статьи