Method Article

Эффективная транскрипционно контролируемая система выражения плазмида для исследования стабильности транскриптов мРНК в первичных альвеолярных эпителиальных клетках

DOI:

10.3791/60654

⸱

March 6th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 3Département de médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем инструмент, который может быть использован для изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в первичных альвеолярных эпителиальных клетках с помощью индуцируемой системы выражения в сочетании с техникой электропорации пипетты.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение посттранскриптона регулирования имеет основополагающее значение для понимания модуляции данной РНК-мессенджера (мРНК) и ее влияния на гомеостаз клеток и обмен веществ. Действительно, колебания в выражении стенограммы могут изменить эффективность перевода и, в конечном счете, клеточную активность стенограммы. Несколько экспериментальных подходов были разработаны для изучения период полураспада мРНК, хотя некоторые из этих методов имеют ограничения, которые препятствуют надлежащему изучению посттранскриптонной модуляции. Система индукции промотора может выразить ген интереса под управлением синтетического тетрациклина-регулируемого промоутера. Этот метод позволяет полураспада оценки данного мРНК при любом экспериментальном состоянии без нарушения гомеостаза клеток. Одним из основных недостатков этого метода является необходимость трансфектных клеток, что ограничивает использование этого метода в изолированных первичных клетках, которые очень устойчивы к обычным методам трансфекции. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре широко используются для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. Уникальные характеристики и фенотип первичных альвеолярных клеток делают необходимым изучение посттранскриптовых модуляций генов, представляющих интерес в этих клетках. Таким образом, наша цель состояла в разработке нового инструмента для изучения посттранскриптовых модуляций мРНК, представляющих интерес для альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре. Мы разработали быстрый и эффективный переходный протокол претворения для вставки транскрипционно контролируемой системы выражения плазмида в первичные альвеолярные эпителиальные клетки. Эта стратегия клонирования, используя вирусный эпитоп, чтобы пометить конструкцию, позволяет легко дискриминации построить выражение от эндогенных мРНК. Используя модифицированный метод количественного цикла (Cq), выражение стенограммы может быть количественно с разной временной интервалами для измерения его полураспада. Наши данные демонстрируют эффективность этого нового подхода при изучении посттранскриптонной регуляции в различных патофизиологических условиях в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения периодов полураспада мРНК было разработано несколько методов. Метод распада пульса-погони, который использует помеченные мРНК, позволяет одновременно оценить большой пул мРНК с минимальными клеточными нарушениями. Тем не менее, этот подход не позволяет прямой оценки период полураспада одного гена стенограммы и не может быть реализован для изучения посттранскриптовой модуляции мРНК после стимуляции с факторами роста, ROS, alarmins, или воспаление1.

Использование ингибиторов транскрипции, таких как актиномицин D и аманитин, является относительно простым методом измерения кинетики деградации мРНК с течением времени. Одним из основных преимуществ этого подхода по сравнению с предыдущими методами (т.е. пульс-погони) опирается на способность непосредственно оценить период полураспада данной стенограммы и сравнить, как различные методы лечения могут повлиять на его деградации кинетики. Однако значительное пагубное воздействие ингибиторов транскрипции на физиологию клеток представляет собой основной недостаток подхода2. Действительно, ингибирование всей транскриптома клеток этими препаратами имеет негативный побочный эффект возмущения синтеза ключевых элементов, участвующих в стабильности мРНК, таких как микроРНК (миРНК), а также экспрессии и синтеза РНК-связывающих белков, которые важны для деградации и стабильности мРНК. Тяжелые возмущения транскрипции генов этими препаратами может поэтому artefactually изменить деградации кривые транскриптов.

Система индукции промоутера представляет собой третий подход к измерению период ы полураспада конкретной мРНК. Этот метод измеряет деградацию конкретной мРНК так же, как методы, которые используют ингибиторы транскрипции. Часто используются два типа индукционных систем: сывороточный сывороточный сик-фос-промоутер3 и индуцируемая система Tet-Off4. С системой c-fos, использование ингибиторов транскрипции, которые могут быть токсичными для клетки не требуется. Однако этот метод требует синхронизации клеточного цикла, что препятствует оценке фактической стабильности транскрипта во время межфазы5. В отличие от этого, система Tet-Off позволяет сильное выражение гена интереса (GOI) под контролем синтетического тетрациклина регулируется промоутер. Эта система требует присутствия двух элементов, которые должны быть cotransfected в клетку, чтобы быть функциональным. Первый плазмид (pTet-Off) выражает регулятивный белок tTA-Adv, гибридный синтетический транскрипционный фактор, состоящий из прокариотического репрессора TetR (от Escherichia coli), слитого с тремя транскрипционными трансформаторными доменами из вирусного белка HSV VP16. GOI клонируется в pTRE-Tight плазмид под контролем синтетического промоутера (PTight),включающего минимальную последовательность цитомегаловируса (CMV) промоутер сливается с семью повторами тетро оператора последовательности. Транскрипция гена вниз по течению PTight зависит от взаимодействия TetR с тетро. При наличии тетрациклина или его производного, доксициклина, репрессор TetR теряет свою близость к оператору тетро, что приводит к прекращению транскрипции4. Характеристики системы Tet-Off делают ее идеальной моделью для изучения специфического выражения мРНК в эукариотических клетках, избегая при этом потенциальных плейотропных эффектов, которые являются вторичными по отношению к отсутствию прокариотических регуляторных последовательностей в эукариотических клетках6. Как правило, вдвойне стабильные линии клеток Tet-Off (HEK 293, HeLa и PC12) используются с этой системой для интеграции копий регулятора и плазмидов реагирования для удобного доступа к управляемому экспрессии генов7,8,9.

Несколько моделей альвеолярных эпителиальных клеток в культуре были использованы для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. В течение многих лет, исследователи широко использовали человека или грызунов первичных клеток10,11, а также увековеченные клеточные линии, такие как человека A549 или крысы RLE-6TN клетки12,13. Хотя они, как правило, менее пролиферативной и более трудной для культуры и трансфекта, альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре остаются золотым стандартом для изучения функции и дисфункции альвеолярного эпителия в физиологических и патологических условиях. Действительно, увековеченные клеточные линии, такие как клетки A549, не обладают сложными характеристиками и фенотипами первичных клеток, в то время как альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре переизгладируют основные свойства альвеолярного эпителия, в частности способность формировать поляризованный и плотный барьер14,15. К сожалению, эти клетки очень устойчивы к обычным методам трансфекции, таким как те, которые используют липосомы, что делает использование системы, индуцированной промоутером, такой как Tet-Off, очень трудно.

Посттранскриптовая модуляция мРНК является одним из наиболее эффективных методов быстрого модулирования экспрессии гена стенограммы16. Важную роль в этом механизме играет непереведенный регион mRNA 3'(3' UTR). Было показано, что, в отличие от 5' UTR, существует экспоненциальная корреляция между длиной 3' UTR и клеточной и морфологической сложности организма. Эта корреляция предполагает, что 3' UTR, как и мРНК кодирования регионов, был подвергнут естественному отбору, чтобы все более сложным посттранскриптонных модуляции на протяжении всей эволюции17. 3' UTR содержит несколько связывающих сайтов для белков и miRNAs, которые влияют на стабильность и перевод стенограммы.

В настоящей работе мы разработали инструмент для изучения роли высоко сохраненных доменов в 3' UTR GOI для контроля стабильности транскрипта. Мы сосредоточились на эпителиальном канале натрия, альфа-субъединице (ЗенаК), который играет ключевую роль в альвеолярной эпителиальной физиологии18. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре были успешно преходяще трансинфицированы двумя компонентами системы Tet-Off, что позволяет изучать роль 3' UTR в стабильности мРНК с системой, которая минимально влияет на физиологию и метаболизм клеток по сравнению с использованием ингибиторов транскрипции с другими протоколами. Была разработана стратегия клонирования, чтобы дифференцировать экспрессию ГОИ от эндогенного гена с использованием неэндогенно выраженного эпитопа (V5). Реакция и регулятивные плазмиды затем были перенесены в альвеолярные эпителиальные клетки с использованием техники электропорации пипетки. Впоследствии экспрессия транскрипта измерялась путем инкубации клеток доксициклином с разными интервалами времени. Период полураспада стенограммы был оценен RT-qPCR с помощью модифицированного метода Cq с использованием трансинфицированного продукта tTA-Ad mRNA для нормализации. В рамках нашего протокола мы предлагаем удобный способ изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в различных условиях и более подробного определения участия непереведенных регионов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры для животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными Исследовательского центра Hospitalier de l'Universit e Montr'al (CRCHUM).

1. Дизайн и генерация плазмиды ответа, выражающей ген интереса (GOI)

  1. Используйте индуцируемый вектор тетрациклина, такой как pTRE-Tight.
  2. Проанализируйте последовательность GOI и многократный сайт клонирования (MCS) вектора, чтобы определить места ограничения в MCS, которые не присутствуют внутри GOI.
  3. Изолировать первичные альвеолярные эпителиальные клетки из мужских легких Sprague-Dawley крысы, как описано ранее19,20.
  4. Очистите общую РНК из альвеолярных эпителиальных клеток с помощью стандартного метода, такого как экстракция фенола/хлороформа или использование рнковых колонок на основе кремнезема.
  5. Обратный транскрибировать мРНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием олиго (дТ) и высокой точности обратной транскриптазы.
  6. Используйте высокоточные полимеразы Taq и стандартные методы перекрытия ПЦР, чтобы обойти GOI с двумя выбранными местами распознавания ферментов ограничения с использованием разработанных грунтовок.
    1. Ите вперед грунтовка содержат Козак консенсус рибосомы связывания сайта21 для повышения уровня экспрессии для изучения экспрессии белка параллельно со стабильностью мРНК. Последовательность кодирования V5 эпитоп вверх по течению GOI должны быть включены, чтобы отличить выражение трансинфицированного GOI от эндогенного выражения (Таблица 1).
    2. Ите обратная грунтовка содержит сигнал пополицидениза после остановки кодона.
  7. Мутанты могут быть созданы путем последовательного удаления для изучения влияния различных 3' UTR регионов на стабильность мРНК GOI с помощью обратных грунтовок кодирования полиаденилации сайт, который постепенно удаляет 3' конец GOI 3' UTR (Рисунок 6). Кроме того, ПЦР-направленный мутагенез может быть использован для целевой конкретной области, представляющих интерес в 3' UTR22.
  8. Переварить индуцированный вектор и вставить с ранее выбранными ферментами ограничения при соответствующей температуре инкубации в течение 1 ч, а затем лечение фосфатазой во время векторной реакции в течение 30 мин, чтобы избежать самоперевязки.
  9. Разделите переваренный вектор и вставьте сегменты электрофорезом в 1-1,5% агарозный гель (концентрация в зависимости от размера вставки).
  10. Используя лезвие и ультрафиолетовый свет, соберите фрагменты ДНК, содержащие нужную вставку и вектор, который будет высвобована.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
  11. Очистите собранные сегменты от геля агарозы с помощью комплекта очистки на основе кремнезема и измерьте концентрацию спектрофотометрией на уровне 260 нм.
  12. Ligate GOI и индуцируемого вектора с Ligase ДНК T4 с использованием векторного:вставить молярное соотношение 1:3 для увеличения вероятности перевязки. Инкубировать реакцию при комнатной температуре (RT) в течение 3 ч.
  13. Преобразуйте реакцию перевязки в компетентную кишечную палочку (DH5).
    1. Добавьте 1-10 нг переносчика и гена в трубку, содержащую 100 зл компетентных клеток. Инкубировать клетки на льду в течение 30 мин, а затем тепло-шоковых клеток при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 45 с. Поместите трубку на лед в течение 2 мин и добавить 900 qL РТ LB среды. Инкубировать клетки в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия при 225 об/мин.
    2. Распространение 100 л реакции на пластине агара LB с подходящим антибиотиком (например, 100 мкг/мл ампициллин для pTRE-Tight вектор), чтобы выбрать преобразованные бактерии. Инкубировать тарелку на ночь при 37 градусах Цельсия.
    3. Выберите отдельные колонии, используя прививочную петлю или кончик 20 л и инкубировать на ночь в 5 мл LB среды, содержащей подходящий антибиотик при 37 градусов по Цельсию с тряской. Преобразованные бактерии могут храниться в запасах глицерола при -80 градусов по Цельсию в соотношении 400:600 среднего LB к глицеролу.
  14. Извлекайте плазмидную ДНК с помощью плазмидных колонн на основе кремнезема и измеряйте концентрацию спектрофотометрией на уровне 260 нм. Подтвердите включение ГОИ путем анализа ограничений и его ориентации и отсутствия мутаций, потенциально введенных во время РТ-ПЦР путем секвенирования.

2. Трансфекция реакции плазмиды, выражающей ген интереса (GOI) в первичные альвеолярные эпителиальные клетки

  1. Изолировать тип II альвеолярных эпителиальных клеток из крысиных легких.
  2. Семена клеток при плотности 1 х 106 клеток / см2 в 100 мм Петри блюда с полной минимальной существенной среде (полный MEM). Полный MEM meM дополняется 10% FBS, 0,08 мг/л тобрамицин, Septra (3 мкг/мл триметоприм и 17 мкг/мл сульфаметоксазол), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH 7.3), и 2 мМ L-глютамин. Культура клетки для 24 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO2 в увлажненный инкубатор.
  3. На следующий день поместите 500 qL полного MEM без антибиотика в каждом колодце новой 12 хорошо пластины и предварительно йодля пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Во время этого шага, важно использовать фетальную сыворотку крупного рогатого скота, свободную от загрязнения тетрациклинов или с слишком низким уровнем, чтобы помешать индуцируемости.
  4. Подготовьте 1,5 мл труб, содержащих плазмиду с индуцируемой GOI (GOI plasmid) и регулятивным вектором (например, pTet-Off), добавив 1 мкг плазмида GOI и 1 мкг регулятивного вектора на скважину на РТ. Для экспериментов по коэкспрессии с РНК-связывающими белками (RBP) к смеси ДНК добавляется 1 мкг составного вектора (например, pcDNA3), выражающий интерес RPB (рисунок 7).
  5. Аспирировать среды и осторожно промыть клетки с PBS (без кальция и магния) предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию.
  6. Добавьте 5 мл 0,05% трипсина, предварительно разогретую при 37 градусах Цельсия, и инкубировать клетки до тех пор, пока клетки не отсоединятся (2-4 мин). Нейтрализуем трипсин, добавляя 10 мл полного MEM без антибиотика.
  7. Соберите суспензию клетки в трубке 50 мл, вымойте чашку Петри с 4 мл среднего, чтобы собрать как можно больше оставшихся клеток, а затем центрифуги яточной подвески на 300 х г в течение 5 минут.
  8. Аккуратно аспирируйте и отбросьте супернатант и resuspend гранулы в 1 мл PBS. Подсчитайте и вычислите количество клеток с помощью гемоцитометра.
  9. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин. Аккуратно аспирации супернатанта и resuspend гранулы в резервации буфера в концентрации 4 х 107 клеток / мл. Добавьте клетки из трубки 1,5 мл, подготовленной в шаге 2.4 при концентрации 400 000 ячеек на скважину, и аккуратно перемешайте их, трубацируя вверх и вниз.
  10. Поместите трубку в электропорационное устройство и заполните ее 3,5 мл электролитического буфера.
  11. Вставьте позолоченный наконечник электрода в пипетку, полностью нажав поршень. Аккуратно перемешайте содержимое трубки 1,5 мл и тщательно аспирируйте клетки с помощью пипетки. Будьте осторожны, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха на кончик, так как это вызовет электрическую дугу во время электропорации и приведет к снижению эффективности трансфекции.
  12. Вставьте пипетку в электропорацию станции, пока не будет щелкающий звук.
  13. Выберите соответствующий протокол электропорации для альвеолярных эпителиальных клеток, соответствующий импульсному напряжению 1450 В и 2 импульсов шириной 20 мс, и нажмите «Старт» на сенсорный экран.
  14. Сразу же после трансфекции, удалить пипетку и передать клетки хорошо ранее заполнены полной MEM без антибиотика, который был предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию.
  15. Повторите шаги 2.11-2.14 для остальных образцов.
  16. Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить клетки по поверхности колодца. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 в увлажненный инкубатор. Через 2 дня замените среду полным МЕМ с помощью антибиотиков.
  17. Подтвердите успех трансфекции, наблюдая за выражением eGFP под флуоресценционным микроскопом или цитометрией потока с помощью контрольного вектора(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и требует дополнительного шага трансфекции с использованием различных плазмид, выражающих eGFP, таких как pcDNA3-EGFP.

3. Индукция транскрипции ингибирования ГОИ

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть предварительно обработаны с желаемым лечения до индукции доксициклина для оценки их воздействия на стабильность мРНК (Рисунок 5).

  1. Приготовьте раствор доксициклина в 1 мг/мл в деионизированной воде. Храните складраствор при -20 градусов по Цельсию, защищенных от света. Доксициклин, производное тетрациклин, используется вместо тетрациклина, потому что он имеет более длительный период полураспада (2x), чем тетрациклин. Кроме того, для полной инактивации тет-оперона 23требуется более низкая концентрация доксициклина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доксициклин может повлиять на выражение мРНК эндогенных GOI. Чтобы проверить это, эффект 24 ч лечения доксициклином на альвеолярных клеток должны быть проверены, чтобы подтвердить отсутствие каких-либо изменений в экспрессии GOI (Рисунок 2).
  2. Приготовьте свежий 1 мкг/мл доксициклина раствор в полном MEM 72 ч посттрансфекции и подогрейте его до 37 градусов по Цельсию.
  3. Замените среду 1 мл полного MEM, содержащего 1 мкг/мл доксициклина на скважину, чтобы ингибировать транскрипцию GOI.
  4. Инкубировать несколько скважин при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 для различных количеств времени от 15 мин-6 ч для оценки период полураспада мРНК GOI.
  5. В конце обработки, мыть клетки с ледяной PBS и лизовать их с коммерчески доступным фенол-хлороформ РНК комплект для извлечения РНК, добавив 500 л. буфера на хорошо и встряхивая пластины для гомогенизации клеток.
  6. Изолировать РНК в соответствии с протоколом производителя. Определите выход и чистоту РНК с помощью спектрофотометрии на уровне 230, 260 и 280 нм. Образцы РНК с соотношениями 260:230 и 260:280 1,8 и 2,0 соответственно считаются чистыми.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

4. Определение стабильности мРНК ГОИ

  1. Лечить 1 мкг общей РНК с РНАз-бесплатно DNAse I (оценка усиления), чтобы удалить любые следы плазмидной ДНК, которые могут помешать последующему усилению ДНК.
    1. В трубке ПЦР 0,2 мл объедините 1 мкг общей РНК, 1 кВ 10x dNase I буфер реакции, 1 КЛ DNAse I (1 U /L) и безРНЭ воды, чтобы получить общий объем 10 ЗЛ.
    2. Инкубировать реакцию на RT в течение 20 мин.
    3. Отключите DNAse I, добавив 1 qL 25 мМ EDTA в 10 qL реакционную смесь и инкубируя реакцию при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
  2. Обратный-транскрибировать ДНК-исчерпаны общей РНК в кДНК с помощью коммерчески доступных кДНК синтез комплект с сочетанием олиго (dT) и случайных грунтовки hexamer для улучшения обратной эффективности транскрипции.
    1. Кратко, добавьте 4 qL 5x реакционной смеси, 1 зл обратной транскриптазы, и 4 Л воды без РНАЗ до 11 Зл из днк-исчерпаны общей смеси РНК, чтобы получить общий объем реакции 20 Л. Смешайте реакцию хорошо, пипеткая его вверх и вниз.
    2. Инкубировать реакцию в течение 5 мин при 25 градусах Цельсия, затем 20 мин при 46 градусах Цельсия, а затем инактивировать реакцию, инкубируя ее при 95 градусах По Цельсию в течение 1 мин. Каждая реакция даст 50 нг /Л продукта кДНК.
    3. Разбавить реакцию кДНК на концентрацию 5 нг/Л, добавив 180 л молекулярной биологии класса воды в 20 юл реакционной смеси. Храните продукты кДНК при -80 градусах по Цельсию или немедленно приступайте к выполнению количественного ПЦР в реальном времени (qPCR).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
  3. Дизайн вперед и обратный qPCR грунтовки, характерные для GOI.
    1. Из-за эндогенного выражения GOI в клетках, грунтовки должны быть разработаны для усиления 100-150 bp ампликон овператов V5 в сочетании с GOI (Таблица 1).
    2. Внутренние эталонные праймеры генов также должны использоваться в качестве контроля за нормализацией. Как правило, в качестве эталонных генов используются гены домашнего хозяйства, такие как бета-актин и гипоксантин фосфорибозилтрансферазы 1 генов. Тем не менее, они не могут быть использованы с этой индукционной системой из-за изменения эффективности трансфекции. Вместо этого, выражение tTA-Ad стенограмма оценивается для целей нормализации, потому что его выражение является составной в клетках из-за активности цитомегаловируса промоутер. Любые изменения в его выражении измеряется qPCR будет представитель эффективности трансфекции (праймеры: вперед 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' и обратное 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) и позволит нормализации выражения трансинфицированных клонов(рисунок 3).
  4. Подготовьте каждую реакцию qPCR в тройном использовании мастер-микса SYBR Green красителя.
    1. Разбавить смесь кДНК 5 нг/Л до концентрации 1,25 нг/Л с использованием воды молекулярной биологии.
    2. Комбинат 5 зЛ SYBR Зеленый краситель мастер смеси (2x), 0,1 л молекулярной биологии класса воды, 0,45 л л вперед грунтовка, 0,45 мл Л 7,5 ММ реверсивной грунтовой, и 4 л 1,25 нг /Л цЛ, чтобы получить общий объем реакции 10 мл л. Используйте оптическую клейкую пленку, чтобы убедиться, что крышка пластины герметичен и предотвратить загрязнение и испарение.
    3. Спин вниз реакции смесь кратко центрифугации и поместите пластину в термоцикле qPCR.
  5. Усиль V5-tagged GOI и tTA-Ad амплеоны, используя следующие условия qPCR: 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут в качестве шага денатурации, а затем 40 циклов 95 градусов по Цельсию для 10 с, 58 градусов по Цельсию для 15 с, и 72 c для 20 s. Кривая плавления с высоким разрешением должна быть сформирована после цикла усиления для оценки конкретных температур плавления желаемых ампликонов и обеспечения отсутствия пиков шумовых ампликонов.
    1. Включите отрицательные элементы управления для qRT-PCR, выполняя qPCR с РНК в качестве шаблона без обратной транскриптазы, чтобы служить в качестве контроля для потенциального загрязнения плазмидной ДНК и qPCR без кДНК, добавленной в смесь qPCR, чтобы обеспечить отсутствие грунтовки димеров или Загрязнений.
    2. Оптимальная концентрация кДНК, эффективность грунта и концентрация должны быть оптимизированы в соответствии с GOI стандартным анализом кривой. Для этого выполните серийное разбавление с использованием кДНК из необработанных клеток (культурных без доксициклина). Стандартная кривая генерируется путем построения значений Cq на основе журнала фактора разбавления cDNA, а эффективность усиления (E) рассчитывается в соответствии с наклоном стандартной кривой с использованием следующей формулы:
      E No 10-1/склон
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность усиления должна быть примерно от 0,9 до 1,05. В противном случае грунтовки должны быть переработаны.
  6. Проанализируйте данные qPCR, используя сравнительный метод Cq, нормализуя значения выражения GOI к выражению tTA-Ad для получения относительных уровней выражения GOI и сообщить о его выражении в процентах от выражения мРНК GOI в клетках одного и того же животного в начальной точке (т no 0) (Рисунок 4).
  7. Период полураспада определяется из курса постоянной (K) кривой деградации GOI mRNA с использованием следующего уравнения:
    т1/2 и лн 2/K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был успешно использован для создания системы транскрипционно-управляемого плазмидного выражения Tet-Off для оценки важности различных частей UTR зЭНАК 3' в модуляции стабильности транскрипта в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.

Первым шагом в внедрении этой системы было создание быстрого, легкого и эффективного метода трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре, которые трудно тран...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Низкий уровень трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре был серьезным ограничением для использования системы Tet-Off для оценки стабильности мРНК в этих клетках. Тем не менее, это ограничение было преодолено электропорации пипетки, что позволило 25-30% эффективности трансфекции(рисунок 1 и рисунок 3)26.

Измерение стабильности транскрипта имеет основополагающее значение для понимания мо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фрэнсис Миньо был поддержан стипендией, предоставленной Квебекской сетью респираторного здоровья и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR), студентом из ФСКН и студентом из факультета по вопросам медицины и науки и Постдокторсал, Монреальский университет. Эта работа была поддержана председателем Госселин-Ламарре в области клинических исследований и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (YBMOP-79544).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Актиномицин DSigma-AldrichA9415
АмпициллинSigma-AldrichA1593
Bright-LineГемацитометрSigma-AldrichZ359629
хлороформ - Класс молекулярной биологииSigma-AldrichC2432
ClaINew England BiolabsR0197S
ЦиклогексимидSigma-AldrichC7698
DM IL LED инвертированный микроскоп с фазовым контрастом
I, класс амплификацииInvitrogen18068015
доксициклина гиклатомSigma-AldrichD9891-1G
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (D-PBS), без кальция и магнияWisent Bioproducts311-425-CL
Этанол - Класс молекулярной биологииFisher ScientificBP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShakerEppendorf1220G76
ГлицеринSigma-AldrichG5516
HEPES pH 7,3Sigma-AldrichH3784
Heracell 240iThermoFisher Scientific51026420
iScript набор для синтеза кДНКBio-Rad Laboratories1708890
Изопропанол - Молекулярная биология классаSigma-AldrichI9516
LB Бульон (Lennox)Sigma-AldrichL3022
LB Бульон с агаром (Lennox)Sigma-AldrichL2897
L-глутаминSigma-AldrichG7513
Липополисахариды из Pseudomonas aeruginosa10Sigma-AldrichL9143
MEM, порошокGibco61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmAppliedBiosystems 4360954
Шкафы биологической безопасности MSC-Advantage класса IIThermoFisher Scientific51025413
система электрофореза Mupid-exUTakaraBio AD140
NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000
Neon Transfection System 10 & микро; L KitInvitrogenMPK1025
Neon Transfection System Starter PackInvitrogenMPK5000S
NheINew England BiolabsR0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemally CompetentE. coliInvitrogenC854003
pcDNA3 векторThermoFisher ScientificV790-20
pcDNA3-EGFP плазмидаAddgene13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High FidelityInvitrogen11304011
pTet-Off Advanced vectorTakara Bio631070
pTRE-Tight vectorTakara Bio631059
Очищенные альвеолярные эпителиальные клетки
II Набор для экстракции геляQIAGEN20021
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QuantStudio 6 и 7 Flex Система для ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемыn.a.QuantStudio
6 Flex Система для ПЦР в реальном времени, 96-луночные быстроприменяемые биосистемы4485697
рекомбинантный белок TNF-альфа крысыR& ампер; D Systems510-RT-010
SeptraSigma-AldrichA2487
Щелочная фосфатаза креветок (rSAP)New England BiolabsM0371S
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725270
обратной транскриптазой SuperScript IVИнвитроген18090010
Т4 ДНК-лигазаThermoFisher ScientificEL0011
Tet System одобрена FBSTakara Bio631367
тобрамицинSigma-AldrichT4014
ТРИзол реагентInvitrogen15596018
трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красныйGibco25300054
Ультрачистый агарозныйинвитроген16500500
воде, класс молекулярной биологииWisent Bioproducts809-115-EL
Leica-DNase n.a.n.a.QIAEX

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  2. Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
  3. Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
  6. Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
  7. Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
  8. Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
  9. Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
  10. Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
  11. Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).
  12. Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
  13. Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
  14. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).
  15. Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
  16. Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
  17. Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
  18. Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
  19. Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
  20. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  21. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
  22. Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
  23. Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
  24. Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
  25. Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
  26. Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
  27. Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
  28. Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).
  29. Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
  30. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  31. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcriptionally Controlled PlasmidmRNA Half Life AnalysisPrimary Alveolar Epithelial CellsTransient Transfection ProtocolV5 Epitope TaggingDoxycycline Inducible SystemElectroporation TechniqueqPCR Quantification MethodRNA Stability AssessmentThree Prime UTR Deletion

Related Articles