Представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли побочных популяционных клеток в сплошных опухолевых клеточных линиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Раковые стволовые клетки (CSC) являются важной причиной роста опухоли, метастазирования и рецидива. Выделение и идентификация ЦСК имеют большое значение для исследования опухолей. В настоящее время для идентификации и очистки ЦСК из опухолевых тканей и опухолевых клеточных линий используется несколько методик. Разделение и анализ клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов. Методы основаны на способности CSC быстро вытеснять флуоресцентные красители, такие как Hoechst 33342. Отток красителя связан с транспортерами АТФ-связывающей кассеты (ABC) и может ингибироваться ингибиторами транспортера ABC. Описаны методы окрашивания культивируемых опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализа доли их SP-клеток методом проточной цитометрии. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Данные, полученные в этом анализе, могут способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволов опухолевых клеток.
Введение
Раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой подмножества клеток с способностью к самообновлению и множественным дифференцировыванием, которые играют жизненно важную роль в росте опухоли, метастазировании и рецидиве1,2. В настоящее время было идентифицировано, что CSC существуют при различных злокачественных опухолях, включая рак легких, головного мозга, поджелудочной железы, предстательной железы, молочной железы и печени3,4,5,6,7,<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Клеточная подготовка
- Переваривание и нейтрализация клеток
- Засейте опухолевые клетки (такие как клетки MDA-MB-231) в 6-колодежную пластину и культивированы в инкубаторе с 37 °C, снабженном 5% CO2.
- Собирают клетки, когда их плотность достигает около 90%. Тщательно аспирировать культурную среду и промыть клетки в 2 раза 3 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния ингибиторов сигнальных путей (например, ингибитора FRA1) или активаторов (например, активатора STAT3) на особенности стволовости опухолевых клеток опухолевые клетки засевают в пластину из 6 скважин и предварительно лечат ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
По этому методу были проведены четыре экспериментальных анализа СП. В первом мы обнаружили долю SP-клеток в MDA-MB-231, который является тройной отрицательной клеточной линией рака молочной железы человека, в нормальных условиях. После подсчета клеток Hoechst 33342 добавляли в одну трубку, содержащую 1х 10 6 клеток до конечной концентрации 3 мкг/мл. Резерпин и Hoechst 33342 добавляли в другую пробирку до конечных концентраций 40 мкМ и 3 мкг/мл соответственно. PI был добавлен в обе трубки. Точечный график FSC-A.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько ключевых моментов, которые следует иметь в виду для анализа SP. Во-первых, это выбор правильного блокиратора, такого как Верапамил или Резерпин, для каждой клеточной линии, потому что «затворное» расположение КЛЕТОК SP определяется в соответствии с положением, в котором большое количество SP-клеток исчезает после добавления блокатора. Для клеточной линии MDA-MB-231 reserpine работает хорошо. Однако для других клеточных линий различные блокаторы могут работать лучше.
Вторая — кон.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансировалась Фондом естественных наук Китая 81572599, 81773124 и 81972787; Фонд естественных наук города Тяньцзинь (Китай) 19JCYBJC27300; Тяньцзиньская народная больница и Грант на совместные исследования Университета Нанькай 2016rmnk005; Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов, Нанькайского университета 63191153.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-луночный планшет для культивирования клеток | CORNING | 3516 | 9,5 см2 (прибл.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Программное обеспечение для проточного цитометра | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Программное обеспечение для анализа проточной цитометрии | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 тригидрохлорид |
| Полистирол круглодонная пробирка | CORNING | 352054 | 12 x 75 мм, 5 мл |
| Пропидий йодид (ПИ) | Сигма-Олдрич | P4170 | 3,8-Диамино-5-[3-(диэтилметиламмонио)пропил]-6-фенилфенантридиния дииодид |
| Резерпин | Сигма-Олдрич | 83580 | (3&бета;, 16&бета;, 17&альфа;, 18&бета;, 20&альфа;)-11,17-диметокси-18-[(3,4,5-триметоксибензоил)окси]йохимбан-16-карбоновая кислота метиловый эфир |
| SKLB816 | предоставлено доктором Шэнъюн Янгом, Сычуаньский университет | ||
| Trypsin-EDTA (0,25%), феноловый красный | Gibco | 25200072 | |
| верапамила гидрохлорид | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-диметоксифенилэтил)метиламино] -2-(3,4-диметоксифенил)-2-изопропилвалеритрилгидрохлорид |
Ссылки
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
