Характеристика Exon Пропуск эффективность в DMD пациент образцов в клинических испытаниях антисенс олигонуклеотидов

Краткое содержание

Здесь мы представляем молекулярную характеристику экспрессии дистрофина 38 с помощью секвенирования Сэнгера, RT-PCR и западного блата в клинических испытаниях.

Аннотация

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является дегенеративным заболеванием мышц, которое вызывает прогрессирующую потерю мышечной массы, что приводит к преждевременной смерти. Мутации часто вызывают искаженную рамку чтения и преждевременные остановки кодонов, что приводит к почти полному отсутствию белка дистрофина. Рама чтения может быть исправлена с помощью антисенс-олигонуклеотидов (AONs), которые вызывают отшелушивание пропуска. Морфолино AON viltolarsen (кодовое название: NS-065/NCNP-01) было показано, чтобы вызвать exon 53 пропуск, восстановление читальный каркас для пациентов с exon 52 удаления. Недавно мы ввели NS-065/NCNP-01 внутривенно пациентам DMD в исследовательском следователе, инициированном, первом в человеке испытании NS-065/NCNP-01. В этой статье методов, мы представляем молекулярную характеристику экспрессии дистрофина с помощью Сэнгера секвенирования, RT-PCR, и западные blotting в клинических испытаниях. Характеристика экспрессии дистрофина была основополагающей в исследовании для демонстрации эффективности, так как не были проведены функциональные тесты результатов.

Введение

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является дегенеративным заболеванием мышц, вызывая прогрессирующую потерю мышечной массы, дыхательной недостаточности и кардиомиопатии, и это приводит к^{преждевременной смерти 1}. Заболевание вызвано отсутствием большого структурного дистрофина мышечного белка^2. Мутации в DMD-гене на Х-хромосоме рецессивны, и болезнь поражает 1 из 3500-5000^{новорожденных самцов 3,,4,,5.} Мутации часто большие удаления в области горячих точек между экзонами 44 и 55, которые приводят к искаженной раме чтения и преждевременной остановки кодонов, вызывая нонсенс-опосредованного распада и почти полное отсутствие белка дистрофина^6,7,8. Рама чтения может быть исправлена с помощью антисенс олигонуклеотидов (AONs), которые вызывают отшелушивание пропуская и восстановить считывания кадра, частично восстанавливая экспрессию дистрофина и задержки^{прогрессирования болезни 9,10,11}. Морфолино AON eteplirsen, который недавно был одобрен Федеральным агентством по лекарственным наркотикам (FDA), вызывает пропуск exon 51 и может восстановить чтение кадра у пациентов с exon 52 удаления^12,13. Тем не менее, exon 53 пропуск восстанавливает читальный каркас для пациентов с exon 52 удаления, и это потенциально может лечить около 10% пациентов DMD¹⁴. Морфолино АОН препарат NS-065/NCNP-01 было показано, чтобы вызвать exon 53 пропуская в клетках человека, и мы недавно ввели NS-065/NCNP-01 пациентам DMD в фазе 1 открытой этикетки доза эскалации клинических испытаний (hereinafter, называется "исследование") (зарегистрирован как UMIN: 000010964 и ClinicalTrials.gov: NCT02081625)¹⁴. Исследование показало, доза зависит увеличение exon 53 пропуск на основе RT-PCR и дистрофин белковых уровней на основе западной blotting, и никаких серьезных неблагоприятных событий наркотиков или отсева^{не наблюдалось 14}.

Во всех клинических испытаниях анализ результатов имеет первостепенное значение. Для dmD клинических испытаний, дискуссия по-прежнему продолжается в отношении наилучшего метода, чтобы показать пользу лечения. Клинические тесты, такие как 6-минутный тест ходьбы имеют определенные недостатки. Молекулярная характеристика экспрессии дистрофина может быть выполнена с помощью нескольких методов, таких как RT-PCR, qPCR, digital-PCR, западная blotting, и иммуногистохимия. Тем не менее, степень восстановления экспрессии белка, которая необходима для придание клинической пользы остается неясным. В этой статье методов, мы описываем подробно RT-PCR и западные методы blotting, используемые для определения exon пропуская и уровни белка, соответственно, в фазе 1 испытания AON пропуская сна снадобья NS-065/NCNP-01¹⁴.

Протокол

Оперативная процедура судебного разбирательства по инициативе следователя утверждена комитетом по этике НКНП (утверждение ID: A2013-019).

1. Подготовка образцов мышц

ПРИМЕЧАНИЕ: Бицепс brachii или четырехглавые мышцы часто выбираются в качестве места биопсии. Тем не менее, голени передней был использован в клинических испытаниях.

1. Биопсия мышц у пациентов
   1. Отметь место разреза перед приготовлением кожи.
   2. Подготовка солевой марли для образца биопсии. Сожмите марлю хорошо.
   3. Вводят местную анестезию в кожу и подкожные ткани, но не в мышцы. Убедитесь в глубине анестезии при отсутствии карежной боли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая анестезия обычно используется у педиатрических пациентов в возрасте до 15 лет.
   4. Сделайте разрез от кожи до подкожной ткани. Используйте небольшие ретракторы, чтобы открыть разрез и отделить подкожный жир.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, часть кожи может быть сокращена для фибробластовой культуры.
   5. Сделайте еще один небольшой разрез в фасции и сократить фасции дальше. Зажим края с помощью комаров тиски подвергать мышцы.
   6. Используйте шов, чтобы подтянуть выбранную часть мышцы. Сделать небольшой туннель с помощью ножниц Iris и вставить комаров тиски в туннель.
   7. Разделите мышечный пучок с помощью типсов и вырежьте оба конца целевой части.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы мышечной биопсии должны быть размером с карандаш для взрослых пациентов (длина 1,0-1,5 см, диаметр 0,8-1,0 см). Образец должен быть около 1 см в длину и 5 мм в диаметре у педиатрических пациентов.
   8. Оберните образец в солевой марли и транспортируют свежую мышцу при комнатной температуре (RT) немедленно на объект, где образец может быть подготовлен для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны перевозиться при 4 градусах Цельсия, если продолжительность транспортировки превышает 1 час.

2. Подготовка образцов мышц

1. Смешайте равные объемы трагакантовой резинки и воды до тех пор, пока жвачка не станет мягкой и липкой. Загрузите смесь в 25 мл шприцев. Шприцы можно хранить в холодильнике.
2. Поместите примерно от 0,5 до 1 см трагакантовой резинки на пробковые диски. Этикетка дисков на противоположной стороне.
3. Поместите контейнер изопентан в жидкий азот до тех пор, пока часть жидкости не замерзнет.
4. Поместите образец в трагакантовую резинку. Продольная ось каждой мышцы должна быть перпендикулярной пробке. Поместите резинку вокруг нижней части каждой мышцы, чтобы помочь надлежащему размещению.
5. Используя пинцет, поместите образец мышц/пробки в холодный изопентан, подготовленный в шаге 2.3, чтобы заморозить. Перемещение образца постоянно в течение 1 мин или до полного замораживания, и место на сухой лед временно.
6. Поместите образец в стеклянные флаконы и храните при -80 градусов по Цельсию.

3. Секция мышц

1. Настройка криостата для секционования с рабочей температурой -25 градусов по Цельсию.
2. Намонтайте пробку/мышечный блок и обрежьте до тех пор, пока не будут достигнуты плоские секции.
3. Используйте секцию толщиной 10 мкм для RT-PCR и западной blotting. Используйте толщину 6-8 мкм и 10-12 мкм для иммуногистохимии или гематоксилина и эозина окрашивания, соответственно. Положите нарезанные секции в 2,0 мл труб и хранить при -80 градусов по Цельсию для RT-PCR и западной blotting.

4. Извлечение РНК и обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (RT-PCR)

1. Извлекайте приблизительно 10 ломтиков толщиной 10 мкм из замороженных мышц криостата. Соберите очищенную общую РНК с помощью комплекта очистки общей РНК в соответствии с инструкциями производителя.
2. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
3. Объедините необходимые реагенты для реакции RT-PCR в трубках ПЦР в соответствии с таблицей 1. Смотрите таблицу 2 для грунтовки последовательностей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вперед грунтовка была 44F для пациента NS-03 и 46F для пациента NS-07. Обратный грунт был 54/55R по умолчанию. Если неспецифические продукты были очевидны, 54R был использован в качестве альтернативы.
4. Поместите ПЦР-трубки, содержащие смесь, в термо-циклер. Запустите термо-циклер в соответствии с таблицей 3.
5. Храните продукт PCR при 4 градусах Цельсия для кратковременного хранения или -20 градусов по Цельсию для длительного хранения.

5. Микрочип электрофорез и exon пропуск расчета

ПРИМЕЧАНИЕ: Система электрофореза микрочипа (MCE) часто отбирается для анализа эффективности пропуска. В этом протоколе мы описываем шаги, необходимые для анализа эффективности пропуска exon с использованием системы MCE производителем A, а также от производителя B, далее называемого системой A и B. В ходе клинических испытаний эффективность эксонного пропуска была проанализирована на системе А. Тем не менее, система А больше не продается, и мы рекомендуем системе B анализировать эффективность пропуска exon. Мы включили протоколы для обеих систем (см. раздел 5.1 для системы A и 5.2 для системы B). См Таблица материалов для получения информации о системе A и B. Кроме того, этот шаг также может быть выполнен с нормальным электрофорезом агарозного геля, но чувствительность заметно снижается.

1. Электрофорез микрочипа с помощью системы А
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система А имеет два типа фишек. Здесь мы описываем шаги для чипа ДНК.
   1. Эквилибррат комплект реагентов (пятно буфера, загрузка буфера, лестницы и гель буфера) к RT, вихрь, и спина вниз.
   2. Чтобы подготовить гель-пятно буфера (GS), добавить 12,5 МКЛ пятно буфера до 250 йл буфера геля и вихря в течение 10 с. Переместите раствор в спиновую фильтровальную трубку и центрифугу на 2400 х г в течение 15 мин. Откажитесь от фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтрованная GS может храниться при 4 кк в течение 1 месяца.
   3. Если образцы высококонцентрированы, разбавляют примерно 50 нг/ОЛ буфером TE или без dNase водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пробы находятся в концентрации соли 200 мМ ККл (или NaCl) и/или 15 мМ_{МгКл 2,}обменяй буфер.
   4. Добавьте 12 йл раствора GS к хорошо грунтовки геля (выделены и помечены GS) чипа ДНК и поместите чип в грунтовки станции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать пузырьков воздуха, вставьте наконечник пипетки вертикально и на дно колодец при раздаче. Обойтись медленно до первой остановки на пипетку, и не изгонять воздух в конце трубы шаг.
   5. Выберите режим C3 и нажмите кнопку «Пуск». После завершения грунтовки удалите чип.
   6. Визуально осмотрите микроканалы на захваченные пузырьки воздуха или неполное грунтовку.
   7. Загрузите подготовленные образцы и лестницу на чип, как унизу.
      1. Pipette 9 йл раствора GS в других 3 скважин GS.
      2. Pipette 5 йл погрузочного буфера в L хорошо, и каждый образец хорошо (1-11).
      3. Pipette 1 йл лестницы в L хорошо.
      4. Pipette 1 йл образца ДНК в каждой из 11 скважин образца.
      5. Pipette 1 йл te или DNase-свободной воды в любых неиспользованных скважин. Комплект краткое руководство показывает фигуру чип макет.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите все скважины на пузырьки воздуха, удерживая чип над слегка окрашенным фоном. Выбить любые захваченные пузырьки воздуха в нижней части колодец с чистой наконечником пипетки или путем удаления и перезагрузки раствора.
   8. Поместите чип в вихревой станции и нажмите Mix. Вихревая станция автоматически останавливается через 1 мин.
   9. Запустите чип на станции электрофорез в течение 5 минут после погрузки.
   10. Выберите New Run в панели программных инструментов. На экране New Run выберите ДНК и ДНК 1K из списка выдвижных анализов.
   11. Либо выберите папку проекта для запуска из списка выдвижного вниз проекта, либо создайте новую папку проекта, введя имя в поле проекта.
   12. Введите имя для запуска в поле Run Prefix и нажмите Кнопку Запуска.
   13. Инструмент звуковой сигнал, когда анализ завершен, и окно открывается с указанием конца запуска. Выберите OK и удалите чип с платформы чипов.
   14. Выберите Файл Данные об экспорте для экспорта данных. Выберите нужные варианты в диалоге по экспорту.
   15. Чтобы очистить электроды, заполните чип очистки с 800 йл деионизированной воды и поместите его на чип платформы, закрыть крышку, и оставить его закрытым в течение 1 мин. Через 1 мин, откройте крышку, удалите чип очистки, и дайте электродам высохнуть в течение 1 мин.
2. Микрочип электрофорез с помощью системы B
   1. Откройте операционное программное обеспечение и введите выборку информации. После ввода информации программное обеспечение автоматически вычисляет количество отделяющих буферных и маркерных решений.
   2. Подготовь необходимое количество разделения буфера, рассчитанного программным обеспечением. Во-первых, подготовить 100x нуклеиновой кислоты гель пятно раствора путем разбавления 10000x раствор с соответствующим количеством буфера TE. 100x раствор может храниться при -20 градусов по Цельсию.
   3. Смешайте подходящее количество 100x нуклеиновой кислоты гель пятно withseparation буфера в конкретной трубке, предоставляемой компанией для подготовки 1x раствор. Вихрь решения.
   4. Подготовь необходимое количество маркерного раствора в трубке.
   5. Запустите программу промывки зонда.
   6. Запустите программу мытья микрочипов, когда закончите.
   7. Одновременно, пипетки образцов ПЦР мультиплита (96-хорошо, ясно) и разбавить 4 раза с деионизированной водой. Минимальный объем, который может обрабатывать машина, составляет 6 мкл, а максимальный – 30 мкл. Мы предлагаем общий объем 10 йл (2,5 МЛ образца и 7,5 мл воды/TE-буфера).
   8. Обложка пластин с клеем ПЦР уплотнения фольги листов и спин-вниз образцов.
   9. Установите пластину, маркерное решение и 1x, разделяющий буфер в машине в соответствии с размещением, показанным машиной. Нажмите кнопку "Пуск".
   10. Когда запуск закончен, экспорт полученных данных в качестве файла .csv из программного обеспечения и вычислить exon пропуская эффективность с использованием концентрации моляров следующим образом:
       Exon пропуская эффективность (%) - (Пропущенная полоса / (Пропущенная полоса ) X 100

6. Дополнительное секвенирование ДНК (cDNA)

1. Агароза гель подготовки
   1. Измерьте 1,5 г порошка агарозы и смешайте порошок со 100 мл 1x буфера TAE в микроволновой колбе (в результате чего гель агарозы 1,5%).
   2. Микроволновая печь в течение 1-3 мин, пока агароза полностью не растворит.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегрузать решение, так как некоторые из буфера будет испаряться и изменить окончательный процент агарозы геля.
   3. Пусть раствор агарозы остынет примерно до 50 градусов по Цельсию.
   4. Добавьте в раствор агарозы 10 000x красителя флуоресцентной нуклеиновой кислоты.
   5. Налейте агарозу в гель лоток с хорошо гребень на месте. Оставьте на RT на 20-30 мин, пока он полностью не затвердеть.
2. Последовательности
   1. Смешайте 5 МКЛ продукта RT-PCR (из шага 4.4) и 1 МКЛ буфера загрузки 6x. Загрузите их в скважины 1,5% агарозового геля.
   2. Вы запустите гель на 135 V в течение 5 минут и 120 V в течение 20 минут.
   3. Визуализуйте полосы с помощью трансиллюминатора в соответствии с протоколом производителя.
   4. Акцизные полосы, представляющие интерес из геля и использовать гель и ПЦР очистки комплект для получения RT-PCR продукции.
   5. Измерьте концентрацию с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенная полоса может быть отправлена для секвенирования в компании или секвенирования объекта, если нет Sanger секвенирования оборудования имеется в доме.
   6. Подготовь необходимые реагенты для комплекта последовательности цикла и пипетки в многоплатливную пластину ПЦР в соответствии с таблицей 4. Смотрите таблицу 2 для грунтовки последовательностей.
   7. Печать пластины с ясной клейкой пленкой.
   8. Вихрь пластины для 2 до 3 с. Центрифуга кратко в размахивая центрифуге ведра так, что содержимое поселиться на дне скважин (5 до 10 с) на 1000 х г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушные пузыри могут присутствовать в скважинах, но они не оказывают негативного влияния на реакцию.
   9. Поместите смесь в термо-цикла и запустить в соответствии с таблицей 5.
   10. Очистить реакции секвенирования пластинами в соответствии с инструкциями производителя.
   11. Используйте анализатор ДНК для определения последовательностей в соответствии с протоколом производителя.
   12. Сравните полученную последовательность с ожидаемой последовательностью пациента.

7. Западный blotting

1. Подготовка образца
   1. Подготовка буфера образца SDS (4% SDS, 4 M мочевина, 10% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерол, 70 мМ Трис-HCl рН 6,4, 0,001% бромофенол синий, и ингибитор протеазы).
   2. Поместите около 100 ломтиков 10 мкм мышечных секций, собранных из крио-секции в 150 МКЛ буфера SDS.
   3. Кратко гомогенизировать образцы белка на льду в течение 30 с использованием удобного микро гомогенизатора.
   4. Центрифуга при 16500 х г в течение 15 мин, и передать супернатант в свежую трубку. Продолжить анализ или хранить при -80 градусов по Цельсию.
2. SDS-PAGE для измерения концентрации белка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентное пятно геля было использовано для определения концентрации белка.
   1. Определите нормальный здоровый вес образца управления и концентрацию с помощью комплекта анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя.
   2. Подготовь образцы для гель-электрофорез. Pipette 10 мкг общего белка здорового контроля и 5 МКЛ образцов пациента, 5 МКЛ буфера образца 4x, 2 хл 10x образца уменьшая агента. После того, как они были смешаны, добавить деионизированной воды в окончательный объем 20 КЛ в каждом образце.
   3. Нагрейте пробы при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
   4. Подготовка 2000 мл 1x SDS работает буфер с использованием 50 мл 40x SDS работает буфер. Разбавить 1 950 мл деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент достаточно 1000 мл бегущего буфера. Оставшийся буфер 1000 мл используется на шаге 7.3.1.
   5. Тщательно смешайте и отложите 800 мл 1x SDS бегущего буфера для использования в нижней (внешней) буферной камере гелеобразной коробки.
   6. Непосредственно перед электрофорезом добавьте 500 МКЛ антиоксидантного буфера в 200 мл 1x SDS бегущего буфера для использования в верхней (внутренней) буферной камере гелеобразной коробки.
   7. Подготовка к гель электрофорез, установив 3-8% Трис-ацетат гель в соответствии с протоколом производителя. Загрузите 20 мкл каждого образца на гель.
   8. Выполните электрофорез при 150 V в течение 75 мин.
   9. После электрофорез, поместите гель непосредственно в чистый лоток, содержащий 50 мл флуоресцентного раствора пятна геля.
   10. Накройте лоток, поместите на шейкер и агитизировать, не брызгая жидкостью и не повреждая гель в течение 90 минут.
   11. Передача геля в воду перед визуализацией в системе флуоресценции при освещении 312 нм с фильтром выбросов бромистого этидия для обнаружения флуоресценции.
   12. Измерьте концентрации образцов пациента на основе аналитической кривой, построенной с использованием нормального контроля лисата с известной концентрацией.
3. SDS-PAGE для западного blotting
   1. Подготовка гель поле в соответствии с шагами 7.2.4-7.2.6.
   2. На основе измерения концентрации, полученного в шаге 7.2.11, нагрузка 100 мкг на полосу здорового контроля лизировать и 300 мкг на полосу пациента образца. Электрофорез, используя те же настройки, что и шаг 7.2.7.
4. Передача белка
   1. Подготовь буфер передачи. Замочите мембрану PVDF на 20 с в метаноле. Переместите его в буфер B до использования.
   2. Замочите экстра-толстую бумагу в буфере A, B и C в течение по крайней мере 30 минут за буфер.
   3. После электрофорез, замочить гель в blotting буфера B в течение 5 минут.
   4. Поместите blotting бумаги, мембраны PVDF, и гель на полусухой машине передачи в соответствии с рисунком на рисунке 1. Раскатать пузырьки воздуха между гелем и мембраной с роликом.
   5. Передача при 2 мА/см² мембраны на 1 ч на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После передачи, рекомендуется выполнить общее пятно белка похож на Ponceau окрашивания, чтобы подтвердить успешную передачу больших молекулярных белков веса.
5. Блокирование и окрашивание антител
   1. Промыть мембрану дважды с ПОМОЩЬю PBST (1x PBS с 0,1% Tween 20).
   2. Поместите мембрану в 1% блокирующий агент, и рок осторожно в течение 1 ч на RT, чтобы заблокировать.
   3. Инкубировать мембрану антидистрофиным антителом в блокирующий раствор (1:125) и анти-спектрин антитела (1:25,000) в течение 1 ч на RT или на ночь при 4 градусов по Цельсию.
   4. Вымойте мембрану три раза в течение 10 минут каждый с PBST на RT.
   5. Инкубировать мембрану с пероксидасом хрена (HRP)-конъюгированных вторичных анти-мышь / кролик антитела в PBST (1:100) в течение 40 мин на RT.
   6. Вымойте мембрану снова три раза в течение 10 минут с PBST на RT.
6. Обнаружения
   1. Смешайте решения для обнаружения A и B в соотношении 1:1. Окончательный объем требуемого реагента обнаружения составляет 0,1 мл/см^{2 мембраны.}
   2. Удалите избыток PBST из промытой мембраны и поместите его с белковой стороной вверх на лист полиэтиленовой пленке или других подходящих чистых поверхностей. Добавьте реагент смешанного обнаружения на мембрану и инкубировать в течение 5 минут на RT.
   3. Удалите реагент избыточного обнаружения, осторожно удерживая мембрану в миппсах и касаясь края от ткани.
   4. Поместите помарку белка сторону на подносе образца. Эксплуатация флуоресцентной системы в соответствии с пользовательской документацией. Установите машину следующим образом. Тип экспозиции: Приращение, Интервал времени: 10 с, Чувствительность/Разрешение: высокое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренные области были в коробке с синим прямоугольником(рисунок 4a-b): BG: фон; D: дистрофин 427 kDa, SL: спектрен бета длинная изоформа (274 kDa); СС: короткая изоформа (253 кДа). Коэффициент сигнала дистрофина/спектрина был рассчитан как (D-BG)/(SL-BG) Соотношение нормального контроля было установлено как 100%.

Результаты

Для использования RT-PCR для обнаружения exon пропуска, грунтовки по обе стороны от exon, которые будут пропущены были разработаны и оценены, чтобы дать только конкретные полосы (см. рисунок 2 для схематической диаграммы exon пропуска и грунтовки позиции). Праймеры должны генерировать продукты, которые можно легко отличить по размеру на системе MCE или нормальный электрофорез агароза гель, если MCE не доступен. Рисунок 3показывает MCE системы гель изображения RT-PCR реакций и секвенирования результатов пропущенной полосы от пациентов NS-03 и NS-07 до и после лечения NS-065/NCNP-01 в дозе эскалации фазы 1 суда. NS-03 и NS-07 гавани удаления, которые охватывают exons 45-52 и 48-52, соответственно. NS-03 получал 5 мг/кг и НС-07 20 мг/кг НС-065/НКНП-01 еженедельно в течение 12 недель. Как и ожидалось до лечения, оба пациента не показали пропуск, и только не пропустил полосу можно визуализировать. После 12 недель лечения, четкая пропущенная нижняя полоса была визуализирована для NS-07. Тем не менее, по-прежнему трудно обнаружить какой-либо пропущенный продукт для пациента NS-03. Результаты секвенирования показали конкатенацию экзонов 47 и 54 для НС-07, а также экзонов 44 и 54 для НС-03. Согласно последовательности, они теоретически могут производить функциональный, но укороченный дистрофин изоформ. Для расчета процентного пропуска, показанного на рисунке 3b,концентрация моляров для пропущенной полосы была разделена пропущенной и не пропущенной полосой. Для пациента NS-07 процент после лечения составил 72%, а для НС-03 – 3,4%. Западные данные помарки (в тройном) от пациентов NS-03, NS-07, и здоровый контроль показаны на рисунке 4a. Ожидается, что до начала лечения не было обнаружено ни одной полосы дистрофина. После лечения была обнаружена полоса от пациента NS-07 с более низким молекулярным весом по сравнению со здоровым контролем (дистрофин дикого типа имеет молекулярный вес 427 кДа, а дистрофин NS-07 имеет молекулярный вес 389 кДа). Из-за удаления экзона и пропуска, дистрофин из-за пациента NS-07 не хватало нескольких экзонов, и он должен был иметь более низкий молекулярный вес. Пациент NS-03 не показал обнаруживаемых уровней дистрофина после лечения. На рисунке 4bпоказано количество дистрофина по сравнению со здоровым контролем для пациента NS-07. Место, где были измерены интенсивности сигнала для расчета восстановления дистрофина, обозначено синими квадратами. Соотношение дистрофин спектрин был использован для расчета количества дистрофина по сравнению с здоровым контролем. С этой целью сигнал от дистрофина минус фон был разделен на сумму двух спектральных изоформ (длинных и коротких) минус фона (см. шаг 8.6.5). Соотношение для здорового контроля было установлено до 100%. Количество дистрофина по сравнению со здоровым контролем у пациента NS-07 после лечения составило 9,1%. Тем не менее, процент не может быть рассчитан для пациента NS-03 из-за слабой полосы дистрофина, который похож на те, которые получены для предварительного лечения образцов для обоих пациентов.

Рисунок 1: Схематическая диаграмма стека передачи для анализа западной помарки. Сборка западного стека передачи пятно с блоттинг бумаги пропитанной в blotting буфера в нижней части следуют blotting бумаги пропитанной blotting буфер B, PVDF мембраны, 3-8% Трис-Ацетат гель и на верхней 2 blotting документы пропитанной blotting буфер C показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Схематический рисунок exon пропуска exon 53 у пациента с удалением exon 45-52 в гене DMD. Например, пациент NS-03 в дозе эскалации клинических испытаний было это удаление. Если exon 53 сохраняется, мРНК будет из кадра, так как exon-exon соединение между exon 44 и 53 нарушает чтение кадра, в результате чего остановить кодон в exon 53. Рама чтения восстанавливается при пропущении exon 53 и производится более короткая изоформа дистрофина. Для обнаружения exon 53-пропуск RT-PCR, грунтовки в exon 44 и 54 используются так, что ПЦР-продукт между пропущенным и ООН-пропущенных мРНК можно легко обнаружить. FWD: вперед грунтовка, REV: обратный грунт, PMO: фосфородиамидат морфолино олигомер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Пропуск эффективности для пациентов NS-03 и NS-07 из передних образцов биопсии мышц голени. a)Гель-изображение, генерируемое системой электрофореза А образцов RT-PCR необработанных и обработанных образцов у пациентов NS-03 и NS-07. Верхняя панель показывает NS-03 и нижнюю панель NS-07 в тройном. Для NS-03, НЕ-пропущенная полоса 422 bp, и пропущенная полоса 212 bp. Для NS-07 диапазоны 836 bp и 624 bp, соответственно. Анализ последовательности показал конкатенацию exon 44 и exon 54 для NS-03 и exon 47 к exon 54 для NS-07. б)Пропуск эффективности до и после лечения показан для пациентов NS-03 и NS-07, рассчитанный из моларной концентрации двух полос, предоставляемых системой A как пропущенная полоса/(пропущенная полоса и непровереная полоса) x 100. Эффективность пропуска NS-03 была очень низкой после лечения; для NS-07 эффективность пропуска составила более 70%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Белковая количественная оценка дистрофина изоформов до и после экзон пропуска терапии. а)Белковая количественная оценка дистрофиных изоформ до и после экзон-терапии. Западная помарка биопсии мышц от tibialis передней от пациентов NS-03 и NS-07 перед и после обработки и от здорового управления в тройном. Дистрофин можно увидеть на 427 kDa для здорового контроля и на 389 kDa для NS-07 после лечения. Дистрофин не может быть обнаружен ни для пациента до лечения, ни один из них не может быть обнаружен после лечения пациента NS-03. Область в черном ящике показана на рисунке 4b. Слева в каждой помарке отображается маркер. б)Количество дистрофина восстановлено после лечения пациента НС-07. Восстановление дистрофина было рассчитано на основе интенсивности полос для дистрофина, фона, а также длинной и короткой изоформы спектрина по формуле: (дистрофин - фон)/(спектррин L-фон) - (спектрин S - фон), где соотношение для здорового контроля установлено до 100%. Интенсивность каждой полосы измерялась внутри синих коробок, показанных на рисунке. Восстановление дистрофина для NS-07 составило 9,1% после лечения. Сигнал дистрофина был слишком слаб, чтобы измерять в необработанных образцах. Размеры маркеров показаны в килодальтонах. Дис: Дистрофин, BG: фон, SL: Спектрин длинный изоформ, СС: Спектрин короткий изоформ, Мой: Миозин типа 1. Размеры маркеров показаны в килодальтонах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Решение	Объем/Реакция (ол)	Окончательная концентрация
Вода без RNase (предоставлена)	Переменной	-
5x ЗИАГЕН OneStep RT-PCR буфер	5.0	1x
dNTP Mix (содержащий 10 мМ каждого dNTP)	1.0	400 МКМ каждого dNTP
Форвард Праймер (10 МКМ)	1.5	0,6 МКМ
Обратный праймер (10 МКМ)	1.5	0,6 МКМ
ЗИАГЕН Онстеп RT-PCR Фермент микс	1.0	-
Ингибитор RNase (необязательно)	Переменной	5-10 единиц/реакция
Шаблон РНК	50 нг
Общая	25

Таблица 1: Реагенты RT-PCR. Необходимые соединения для одной реакции RT-PCR.

Грунтовка	Последовательности
44F	5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'
48F	5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R	5'-TCTCGCTCCACCCTTTT-3'
54R	5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

Таблица 2: Список праймеров. Последовательности для грунтовки, используемые в этом исследовании. Ф: Вперед, Р: Обратно.

1 цикл	Обратная транскрипция	30 мин.	50 КК
1 цикл	Первоначальный шаг активации ПЦР	15 мин.	95 КК
35 циклов	Денатурация	1 мин.	94 КК
	Отжига	1 мин.	60 КК
	Расширение	1 мин.	72 КК
1 цикл	Окончательное продление	7 мин.	72 КК
Держать		∞	4 КК

Таблица 3: PCR условный используется. Показать условия ПЦР для реакции RT-PCR.

Решение	Объем/Реакция (ол)
Вода без RNase	Переменной
BigDye Терминатор 3.1 Готовый микс реакции	3.5
Форвард Праймер/Обратный Праймер (3,2 МКМ)	2.0
Шаблон РНК	20 нг
Общая	20

Таблица 4: Реагенты, необходимые для секвенирования реакции. Используйте либо вперед или обратный грунтовка в установке, а не оба в то же время.

1 цикл	1 мин.	96 КК
25 циклов	10 с	96 КК
	5 с	50 КК
	4 мин.	60 КК
Держать	∞	4 КК

Таблица 5: Условия ПЦР для последовательности Sanger.

Обсуждение

Клинические испытания DMD дали как успехи, так и неудачи в последние несколько лет. Как RT-PCR, так и западные blotting являются общими методами для оценки эффективности пропуска порожденных экзон-пропуск соединений, вводимых пациентам. Тем не менее, RT-PCR, как сообщается, чрезмерно оценить эффективность пропуска по сравнению с цифровым ПЦР¹⁵. Хотя это связано с рядом причин, это в первую очередь вызвано более эффективным усилением меньших пропущенных фрагментов во время циклов ПЦР. Похоже, что RT-PCR, используемый в этом клиническом испытании, также вызвал более высокую эффективность пропуска по сравнению с выражением белка, оцененного западным blotting. По данным FDA, это более надежный способ количественного восстановления дистрофина¹². Таким образом, следует проявлять осторожность при интерпретации результатов пропуска RT-PCR; однако образцы все еще можно сравнить. Образцы, показывающие более высокую эффективность пропуска на основе результатов RT-PCR, обычно эксбит более высокие уровни экспрессии белка в западных анализах помарки.

Поскольку все пациенты в клинических испытаниях DMD не имеют той же модели удаления, это может быть трудно разработать грунтовки и зонды, которые являются адекватно конкретными для выполнения цифровых или qPCR на всех образцах. Таким образом, RT-PCR по-прежнему является хорошей альтернативой для первой оценки эффективности пропуска. До начала клинических испытаний NS-065/NCNP-01 было утомительно оценивать эффективность пропуска каждого пациента в пробирке, так как биопсия мышц или кожи была обязательной для генерации специфических миобластов пациента. Тем не менее, мы недавно опубликовали новый метод для создания конкретных пациентов MYOD1 преобразованы, мочи полученных клеток (UDCs) в качестве нового DMD мышечной^{клеточной модели 16}. Таким образом, только моча, собранная у пациента, необходима для генерации миобластов, и никакой инвазивной процедуры не требуется. Мы считаем, что этот метод может быть использован для проверки различных AONs в конкретных клеток пациента. Кроме того, различные грунтовки и зонды могут быть проверены до того, как пациент начнет какие-либо клинические испытания. Это может облегчить использование qPCR или цифрового ПЦР для пропуска измерений в клинических испытаниях DMD в будущем.

Для выполнения западного анализа помарки в этом клиническом испытании, одно антитело против дистрофина было использовано, и только один здоровый контроль был использован в качестве эталонного образца. Таким образом, специфичность антитела не была подтверждена надлежащим образом. Это, наряду с тем, что антитела распознает только C-терминальный домен дистрофина, является ограничением протокола. Более здоровые элементы управления и антитела, направленные против различных областей молекулы дистрофина, являются целесообразными в будущем.

Здесь мы обобщили протоколы, которые были использованы в недавнем исследовательском следователе, начатом, первом в человеке судебном разбирательстве NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 потенциально применим к 10,1% пациентов с ДМД.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100.н. DNA Ladder	Takara	3407A	маркерный раствор для MultiNA
1 моль/л-трис-HCl буферный раствор (pH 7,6)	Nacalai	35436-01
2-меркаптоэтанол	Nacalai	21418-42
2-метилбутан (изопентан)	Sigma-Aldrich	15-2220
5 мл полистирольная пробирка с круглым дном	Falcon	352235
6 раз; Загрузочный буфер	Takara	9156
Agarose ME	Iwai chemical	50013R
Applied Biosystems 3730 Анализатор ДНК	Applied Biosystems	A41046
BD Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 Набор для секвенирования цикла	Applied Biosystems	4337455
Бычья сыворотка Альбумин раствор	Sigma-Aldrich	A8412
Бромофенол синий	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96-Well Plates	Applied Biosystems	4367819
cOmplete Ингибитор протеазы Коктейль	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
ECL Prime Blocking Reagent	GE здравоохранение	RPN418
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE healthcare	RPN2232
Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion Автоматизированная станция электрофореза	Bio-Rad	7007010	система электрофореза Microchip Набор
анализа ДНК Experion 1K для 10 чипов	Bio-Rad	7007107JA
Experion Грунтовочная станция	Bio-Rad	7007030
Experion Vortex Station II	Bio-Rad	7007043
фильтровальная бумага повышенной толщины	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003
стеклянный флакон	Iwaki	1880 SV20
Глицерин	Nacalai	17045-65
Histofine Simple Stain MAX PO	Nichirei	424151
Сыворотка для лошадей	Gibco	16050122
Immobilon-P Передаточная мембрана	Millipore	IPVH304F0
ITS Жидкая Медиа Добавка	Sigma-Aldrich	I3146
Метанол	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp Прозрачная клейкая пленка	Прикладные биосистемы	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Система электрофореза MicroChip
Multiplate 96-луночные ПЦР-планшеты	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр с Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM Лиофилизированное мышиное моноклональное антитело Дистрофин (C-конец)	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM Лиофилизированное мышиное моноклональное антитело Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% трис-ацетатные белковые гели	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE Антиоксидант	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS Образец Буфер	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Восстановитель проб	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Трис-ацетат SDS Беговой буфер	Invitrogen	LA0041
Иволга Флуоресцентный гель Краситель	Bio-Rad	1610496
PBS	Gibco	10010023
раствор пенициллин-стрептомицина стабилизированный	Sigma-Aldrich	P4458
Physcotron Handy микрогомогенизатор	MICROTEC	NS-310E3
Набор для анализа белка BCA Pierce	Thermo Scientific	23227
Полибреновый реагент для инфекции / трансфекции	Sigma-Aldrich	TR-1003
Раствор для окрашивания йодида пропидиума	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep Набор для ОТ-ПЦР	Qiagen	210212
RNeasy Мини-набор для волокнистой ткани	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
Полусухая машина для переноса	Bio Craft	41-1293
SYBR Гель для нуклеиновых кислот	Stain Invitrogen	S11494	для MultiNA
TAE Buffer	Nacalai	35430-61
Tragacanth Gum	Wako	200-02245
Tris-EDTA Buffer	Nippon Gene	316-90025	для MultiNA
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Мочевина	Nacalai	35907-15
Wizard SV Гель и система для очистки ПЦР	Promega	A9281
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001