В этом протоколе описан метод изоляции мурин-опустительных и трансплантации в подкожную белую жировую ткань. Изолированные сингенные островки мурин пересаживаются в реципиент мурин с помощью гидрогеля мембраны в подвале. Контролируется уровень глюкозы в крови реципиентов, проводится гистологический анализ пересадок на аклетис.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ингинезальная подкожная белая жировая ткань (ISWAT) Модель трансплантации островков Мурин
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трансплантация поджелудочной железы является устоявшимся терапевтическим лечением диабета типа 1. Капсула почки является наиболее часто используемым местом для пересадки на газиотвую инфекцию моделям грызунов. Тем не менее, плотная капсула почки ограничивает трансплантацию достаточноостровов у крупных животных и людей. Было установлено, что подкожная подкожная белая жировая ткань (ISWAT), новое подкожное пространство, является потенциально ценным местом для трансплантации на воздушном шаре. Этот сайт имеет лучшее кровоснабжение, чем другие подкожные пространства. Кроме того, ISWAT вмещает большую массу на ище, чем капсула почки, и трансплантация в нее проста. Данная рукопись описывает процедуру изоляции и трансплантации мышей на сайте ISWAT сингенных получателей диабетической мыши. Используя этот протокол, мурин поджелудочной железы островки были выделены стандартным перевариванием коллагеназа и подвал мембранной матрицы гидрогель был использован для фиксации очищенных островков в ISWAT сайте. Уровни глюкозы в крови мышей-реципиентов отслеживались более 100 дней. На васильевке трансплантаты были извлечены в день 100 после трансплантации для гистологического анализа. Протокол для пересадки на месте ISWAT, описанный в данной рукописи, прост и эффективен.
Введение
По данным Международной федерации диабета (IDF)1,заболеваемость и распространенность сахарного диабета 1 типа (T1DM) быстро растет. Трансплантация на ислете является одним из наиболее перспективных подходов для лечения T1DM4. Так как большой прорыв, достигнутый в клинической трансплантации на аклетов с использованием протокола Эдмонтон2 было сообщено, функционирование выживаемости трансплантата на пути в T1DM получателей после 5 лет в настоящее время достигает около 50%3.
В прошлом, несколько мест трансплантации, таких как печень, почечная капсула, селезенка, внутримышечная область, подкожное пространство, костный мозг, и оментальный мешок были исследованы для экспериментальной трансплантации островка5,6,7. Некоторые из вышеперечисленных сайтов были протестированы в клинических условиях8. Хотя трансплантация на айсе в печень остается наиболее широко используемым методом в клиническом применении в настоящее время9,Есть несколько важных проблем для решения при использовании этого сайта. Например, как уменьшить раннюю потерю пересаженных островков, вызванных мгновенной опосредованной воспалительной реакцией крови (IBMIR) и плохой подачей оксигенации10,11 и как получить островк и при необходимости, потому что они диффузно локализуются в печени. Почечная капсула может быть идеальным местом для реципиентов грызунов. Тем не менее, плотная капсула почки ограничивает трансплантацию достаточного аллогенных островков у человека, хотя это может быть лучше подходит для ксенотрансплантации островка из-за высокоочищенных препаратов островка свиньи, используемых клинически5,12. Поэтому ведется поиск более подходящего места для пересадки на территории на это.
Подкожное пространство может быть использовано в качестве клинически применимого места для трансплантации на воздушном котле из-за его доступности. Однако эффективность пересадки островка в подкожное пространство крайне низка, что требует относительно большого количества островков для обращения вспять гипергликемии13. Недавно японская исследовательская группа обнаружила ISWAT, новый подкожный сайт превосходит для трансплантации на аймин в модели мурина по сравнению с печенью14. ISWAT содержит эпигастральную артерию и вену, поэтому богатое кровоснабжение может обеспечить реваскуляризацию переускулярия газографа. В этой рукописи мы предлагаем простой метод имплантации с использованием гидрогеля матрицы мембраны в подвале для фиксации сингенных островков мурин в ISWAT. Этот протокол оказывается эффективным для трансплантации на илиаке.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры в этом протоколе следовали принципам благополучия животных Комитета по этике Второй народной больницы Шэньчжэня. Получателями и донорами на исданных на излому были мыши C57BL/6, купленные у Медицинского центра животных провинции Гуандун, были от 8 до 10 недель. Процедура сбора урожая, изоляции, культуры или введения собранных клеток проводилась в асептических условиях.
1. Подготовка к выходу на из ею
- Подготовьте коллагенеза типа V рабочего решения. Взвесить коллагенеза типа V и растворить с буфером D-Hank до конечной концентрации 1 мг/мл, фильтр с помощью 0,22 мкм шприц-фильтр а также 60 мл шприца и precool во льду. Для каждого донора требуется объем 5 мл.
- Эвтаназия 10-недельный C57BL/6 мужской мыши (23 и 2 г) путем вывиха шейки матки и распылить внешнюю часть мыши с 75% этанола в течение нескольких секунд. Между тем, заполнить 5 мл шприц с раствором коллагеназа и изменить шприц иглы с изгибом тупой указал перфузионной иглы (32 G).
- Положите донорскую мышь в положение на спине на ледяной мешок под рассекающим прицелом, вырежьте поперечное отверстие с помощью прямых остроконечных офтальмологических ножниц в коже лобковой области и полностью разрежьте кожу к голове. Затем полностью открыть живот через V-разрез от лобковой области к процессу xiphoid.
- Разоблачить желчный пузырь и всю длину общего желчного протока путем перепозиционирования печени. Затем зажимдвенадцате двенадцатиперстное отверстие общего желчного протока сосудистым зажимом и вырежьте небольшое отверстие в желчном пузыре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное размещение иглы важно для предотвращения притока в печень и желчный пузырь. - Каннативной общий желчный проток из желчного пузыря открытия с помощью перфузионной иглы в шаге 1.2, а затем ввести 2 мл раствора коллагеназы в поджелудочной железе. После этого отделите пронзительную поджелудочную железу от кишечника, желудка и селезенки с помощью двух пар неинвазивных микротизеров и положите ее в коническую трубку 50 мл на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите процесс для всех мышей-доноров. Три последовательно пронизанных поджелудочной железы (не более 40 мин друг от друга) могут быть объединены в 50 мл конической трубки предварительно заполнены 3 мл раствора коллагеназы для каждой поджелудочной железы. - Добавьте 100 кЛ DNase I (10 мг/мл) на поджелудочную железу в конические трубки 50 мл и переваривайте поджелудочную железу в водяной бане при 37 градусах Цельсия, встряхивая конические трубки в течение 3-5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните трубки энергично 40x в 10 с интервалами, чтобы отмежевать ткани до пищеварения в водяной бане, а затем умеренно встряхнуть трубки во время пищеварения. - Добавьте стоп-раствор (2,5 мг/мл раствор BSA-HBSS) до конечного объема 50 мл, чтобы заблокировать пищеварение, и пульс центрифуги труб со скоростью 750 х г при 4 градусах Цельсия и быстро остановиться.
- Слейте супернатант и промойте гранулы 2x, аккуратно resuspending в 15-25 мл BSA-HBSS. Импульс центрифуги трубки с теми же условиями скорости, как описано в шаге 1.7 за 1 мин.
- Слейте супернатант и объедините гранулы трех конических труб в коническую трубку 50 мл. Отразите гранулы в общей объеме 10 мл еготопак-1119. Смешайте однородно, и последовательно добавить 5 мл еготопак-1077 и 5 мл HBSS путем труба медленно вдоль стороны трубки.
- Спин образцы в центрифуге на 750 х г при 4 кв кв 10 минут без тормозов.
- Аспирировать островки из интерфейса HBSS/histopaque-1077 в коническую трубку 50 мл с использованием одноразовой трубы Pasteur 5 мл, добавить BSA-HBSS до конечного объема 50 мл и пульс центрифуги при 750 х г при 4 градусах по Цельсию.
- Слейте супернатант и промойте островки с помощью 30 мл BSA-HBSS. Центрифуга в течение 1 мин при 750 х г при 4 градусах по Цельсию.
- Приостанавливайте работу островков с использованием 30 мл культуры среднего (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) на трубку и влейте светоплотную культурную тарелку диаметром 10 см. Под стереомикроскопом, используя 200 гель-загрузки трубы советы, handpick островки из раствора на основе их морфологии (т.е., сфероидальной, белой). Положите в необработанную тарелку культуры клеток с 10 мл культуры среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая подборка может быть выполнена, если чистота первоочищенных островков не является оптимальной после первого сбора. - Проверьте чистоту подобранных островков путем окрашивания дитизона под легким микроскопом и обнаружить жизнеспособность островков по флуоресцеину диацетата (FDA)-propidium йодида (PI) окрашивания под флуоресцентным микроскопом.
- Культура изолированных островков в среде культуры (как в шаге 1.13) в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, 95% воздух-5% CO2 до трансплантации.
2. Трансплантация на исхоте на пересадке на пересадке
- Индуцировать диабет у 8-недельного самца C57BL/6 мышей (22 и 2 г) путем одной инъекции стрептозотоцина (СТЗ). В день -4, быстро мышей для 4-6 ч, а затем подготовить 2% ST-раствор с помощью 0,1 М цитрат буфера (pH 4.4). Взвешивание, resuspend в буфере, и вводить мышей интраперитоневого в дозе 180 мг/кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение ST'а должно быть свежеподготовлено перед использованием и покрыто алюминиевой фольгой из-за его светочувствительности. Его следует использовать немедленно, потому что он потеряет активность в течение 15-20 мин. - Проколить каудальные вены мышей, вводимых скатами, чтобы собрать кровь примерно в 10 часов дня -1 и 0 и измерить уровень глюкозы в крови, не утихая, используя тест-полоску и базовый инструмент мониторинга глюкозы в крови. Мыши будут использоваться в качестве реципиентов трансплантации на газе, если уровень глюкозы в крови в течение 2 последовательных тестовых дней составляет не менее 20 ммоль/л.
- На день 0, взвесьте и отметьте всех мышей-получателей. Анестезия каждого получателя путем введения 60 мг/ кг пентобарбитального натрия интраперитонена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Администрирование щепотку ног, чтобы проверить глубину анестезии. Если мышь-реципиент не имеет абстинентного рефлекса, уровень анестезии довешсят для операции. Если нет, вводят дополнительные 10 мг/кг пентобарбитального натрия. Используемый пентобарбитал натрий разбавлялся в стерильных физиологических солизных растворах при концентрации 2% (м/в). - Выньте гидрогель из морозильной камеры -20 градусов и держите его на льду, чтобы позволить оттаивать. Гидрогель жидкости при температуре 4-10 градусов и затвердевается при более высокой температуре.
- Выберите эквиваленты газолетов (IE) для каждого получателя в стерильную 1,5 мл центрифуги под стереомикроскопом (как в шаге 1.13) с 200 qL культуры среды и держать на льду до готовности к трансплантации.
- Swab левой паховой области получателя с использованием 75% этанола. Поместите его в положение на спине и исправить четыре конечности с помощью хирургической ленты. Сбрить волосы вокруг хирургического сайта с электрическими клиперами и тампон области с Iodophor.
- Сделайте вертикальный разрез кожи в этой области с помощью офтальмологических ножниц и неинвазивных микротверизаторов, определите нижнюю эпигастральную артерию и вену в ISWAT, и создайте небольшой карман над сосудами.
- Спин островки трубки для 30 с на 200 х г и удалить супернатант как можно больше. Аспир 20 л полностью размороженного гидрогеля и загрузите его в трубку с островками. Отрежь островки осторожно, избегая пузырьков.
- Доставьте всю смесь из-под гидрогеля в трубку в карман (шаг 2.7) получателя с наконечником пипетки мощностью 200 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс требует двух техников, один для собирания края кармана с помощью неинвазивных микротвизеров, а другой для доставки смеси на клетвив в карман. - Добавьте 20 зЛ цефалоспорина (5-10 мг) в место трансплантации после полного затвердевания смеси островков-гидрогеля, затем используйте 5-0 хирургический шов, чтобы закрыть мышцы и кожу методом непрерывного шва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель нуждается около 3 мин, чтобы укрепить из-за температуры тела. - Поместите получателя в чистую клетку и согреться с помощью тепловой площадки. Продолжайте мониторинг до тех пор, пока получатель полностью не восстановится и не начнет двигаться автономно. Затем вводят 0,03 мг/мл бупренорфин с стерильным физиологическим солизным раствором интраперитоневом, в соответствии с дозой 0,1 мг/кг.
- Повторите шаги 2.3-2.11 для каждой мыши получателя.
- Измерьте небыстрый уровень глюкозы в крови мышей-реципиентов (как в шаге 2.2) 3-4x в неделю в течение первого месяца, и 1x в неделю после этого.
- В конце наблюдения (100 дней после трансплантации), под наркозом (осуществляется как в шаге 2.3) акциз ISWAT проведения трансплантата от получателей после стерильных шагов, описанных в шаге 2.6. Исправьте ткани в формалине и параформальдегиде в соответствии с гистологическими протоколами для гематоксилина и эозина (Н И Е) окрашивания и иммунофлуоресценции инсулина и глюкагона.
- Добавить цефалоспорин и закрыть разрез получателей, как в шаге 2.10, а затем подготовиться к восстановлению, как в шаге 2.11.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе вводятся две процедуры: подготовка моринского дейстета и пересадка на место проведения ISWAT. В первой процедуре, после перфуляции и переваривания с типом V коллагеназного раствора, очистка с Histopaque-1119 и Histopaque-1077 и дополнительный шаг ручной подбор, изолированные островки морин будет достаточно чистым для трансплантации (как показано на рисунке 1) и изолированных островков, которые имеют высокую жизнеспособность будет использоваться для трансплантации (как показа...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Трансплантация поджелудочной железы является перспективной терапией для лечения T1DM. Эффект этой терапии зависит от многих факторов, и выбор оптимального места для имплантации на кисти является чрезвычайно важным. Идеальное анатомическое место для трансплантации газа должно иметь следующие характеристики: доступность для простых трансплантаций, биопсии и процедур ы истечения трансплантата; снижение осложнений; высокий уровень успеха контроля глюкозы в крови; и долгосрочное выживание пересадок на каком-то пересадке
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не сообщают о конфликте интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Национальной программы никульных НИОКР Китая (2017YFC1103704)Специальные фонды для строительства больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019), Sanming проект медицины в Шэньчжэне (SSM201412020), Фонд высокого уровня Медицинская дисциплина Строительство Шэньчжэня (2016031638), Шэньчжэнь фонд науки и техники (JCJY20160229204849975, GJH'2017031417171733555), Шэньчжэнь Фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии (S'XJ20170210210211021X Научно-исследовательский фонд китайской провинции Гуандун (A2019218), Китайский фонд постдокторской науки (2018M633218).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m Фильтрующий блок с приводом от шприца | Merck | Millipore SLHV033RB | |
| 1,5 мл центрифужная трубка | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 мл пипетка Пастера | JingAn Biological, Китай | J00085 | |
| шприц 5 мл | Szboon, Китай | 20170829 | |
| 50 мл коническая трубка | Corning | 430829 | |
| 5-0 хирургический шов | sh-Jinhuan, Китай | CR537 | |
| шприц 60 мл | Szboon, Китай | 20170623 | |
| 75% этанол | LIRCON, Китай | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 ослик против мыши IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Разведение (1:200) |
| антитело против мышиного глюкагона | Abcam | ab10988 | Разведение (1:100) |
| антитело к мышиному инсулину | Cell Технология передачи сигналов | 3014s | Dilution (1:100) |
| перфузионная игла с тупым концом | Oloey, Китай | 005 | 32G, желтая |
| BSA | Meilune, Китай | MB4219 | |
| C57BL/6 мышей | Центр медицинских животных провинции Гуандун | 8 ~ 10 недель | |
| чашка для культивирования клеток | BIOFIL, Китай | TCD000100 | Общий, Необработанный, диаметр 87,8 мм |
| центрифуга | Thermo Scientific | ST16R | |
| цефалоспорин | Lukang medical, Китай | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, Китай | CP-8000 | |
| коллагеназа типа V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Буфер D-hank's | Coolaber, Китай | PM5140-10 | |
| дитизон | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Эозин окрашивающий сред | Beyotime Biotech, | Китай C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| флуоресцеина диацетат (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| флуоресцентный микроскоп | Leica | DMIL | |
| геле-нагружающие наконечники пипеток | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, Китай | PM5150-10 | |
| гематоксилин окрашивающая среда | Клеточная сигнализация технология | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| гидрогель | BD Biosciences | 356234 | матрица базальной мембраны |
| Iodophor | LIRCON, Китай | 5190313 | |
| светонепроницаемая чашка для культуры | DVS, Китай | AN-5058548 | самодельная, стеклянная чашка распыленная черной краской |
| Медицинская клейкая лента | Cofoe, Китай | K12001 | |
| неинвазивный микропинцет | RWD Life Science | F11033-11 и F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Базовая система мониторинга уровня глюкозы в крови | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| офтальмологические ножницы | RWD Life | Science S12012-12 и S11001-08 | |
| P/S (пенициллин / стрептомицин) | Gibco | 15140-122 | |
| пентобарбитал натрия | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| пропидиум йодид | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (стрептозотоцин) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Тест-полоска | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-конъюгированная козья анти-кроличья IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Разбавление (1:200) |
| сосудистый зажим | RWD Life Science | R31006-04 |
Ссылки
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823(2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521(2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202(2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160(2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374(2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096(2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
