Здесь мы представляем протокол для обнаружения общего клеточного реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (DCFH-DA). Этот метод может визуализировать клеточной локализации ROS в адептовых клеток с флуоресценции микроскопа и количественно ROS интенсивности с флуоресценции пластины читателя. Этот протокол прост, эффективен и рентабельн.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение всего реактивного кислорода видов в клеток-приверженцев 2',7'-Dichlorodihydroflucescein Диацетат окрашивания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оксидационный стресс является важным событием как в физиологических, так и в патологических условиях. В этом исследовании мы демонстрируем, как количественно окислительного стресса путем измерения общего реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2'-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания в колоректальных раковых клеток линий в качестве примера. Этот протокол описывает подробные шаги, включая подготовку решения DCFH-DA, инкубацию клеток с раствором DCFH-DA и измерение нормализоваем интенсивности. Окрашивание DCFH-DA является простым и экономичный способ обнаружения ROS в клетках. Он может быть использован для измерения поколения ROS после химической обработки или генетических модификаций. Таким образом, это полезно для определения клеточного окислительного стресса на окружающую среду стресс, предоставляя ключи к механистических исследований.
Введение
Три основных реактивных видов кислорода (ROS), вырабатываемых клеточным метаболизмом, которые имеют физиологическое значение, являются супероксидной анионом, гидроксилом радикалом и перекисьюводорода 1. При низких концентрациях они участвуют в физиологических клеточных процессах, но при высоких концентрациях они оказывают неблагоприятное воздействие на клеточные сигнальные пути1. В нашем организме разработаны антиоксидантные системы, которые эффективны против чрезмерного РОС. Тем не менее, окислительный стресс может произойти, когда ROS переполняет детоксикационную способность нашего организма, что способствует многим патологическим состояниям, включая воспаление, рак и нейродегенеративные заболевания2,,3,,4. Цель этого метода заключается в определении общего клеточного РОС в адептовых клетках с помощью 2'-7'-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания. Обоснование заключается в том, что окисление DCFH-DA до 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) широко используется для общего обнаружения ROS, включая гидроксил-радикалы (ОГ) и диоксид азота (NO2). Механически, DCFH-DA занимает клетки, где клеточные эстеразы расщепляется от ацетиловых групп, в результате чего DCFH. Окисление DCFH ROS преобразует молекулу в DCF, который испускает зеленую флуоресценцию на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм. По сравнению с обнаружением флуоресценции с цитометрией потока и другими альтернативными методами5,преимущества этого метода с использованием флуоресценции микроскопа и плиты читателя в том, что он производит четко видимые флуоресцентные изображения, и легко выполнять, эффективным и экономически эффективным. Этот метод широко используется для обнаружения клеточного ROS для изучения различных условий6,,7,,8. Этот протокол используется для обнаружения общего ROS в клетках-адептах. Использование этого метода для обнаружения ROS в подвесных камерах может потребоваться некоторые изменения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Посев клеток
- Семя 2 х 105 ХКТ116 колоректальных раковых клеток на хорошо в 24-хорошо пластины и поддерживать клетки в модифицированной среде Eagle Dulbecco (DMEM) на ночь на 37 градусов по Цельсию.
- Замените культурную среду или без 100 сульфатов железа (FS) или 10 доксорубицина (DOX), содержащего средний и инкубировать в течение 24 ч.
2. Подготовка решения DCFH-DA
- Растворите 4,85 мг DCFH-DA в 1 мл диметил сульфоксида (DMSO), чтобы сделать 10 мМ фондовый раствор.
- Разбавить раствор запаса предварительно разогретым DMEM в 10 ММ рабочий раствор прямо перед добавлением его в скважины.
- Vortex - рабочее решение для 10 с.
3. Окрашивание DCFH-DA
- Удалите препарат, содержащий средний и мыть один раз с DMEM.
- Добавьте 500 мл рабочего решения DCFH-DA в каждый колодец и инкубировать при 37 градусах в течение 30 мин.
- Удалите рабочее решение DCFH-DA. Вымойте один раз с DMEM и 2x с 1x фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS).
- Добавьте 500 хл 1x PBS к каждому колодцу.
4. Измерение приобретения и интенсивности визуализации
- Возьмите репрезентативные флуоресцентные изображения для каждого колодца с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) канала на флуоресценции микроскопа.
- После съемки снимков удалите PBS и добавьте 200 МЛ буфера радиоиммунопреципионации (RIPA) к каждой скважине.
- Инкубировать на льду в течение 5 мин, затем собирать лисировать клетки в 1,5 мл труб.
- Центрифуга при 21 130 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите 100 мл супернатанта на черную пластину 96 скважин и измерьте интенсивность флуоресценции с помощью флуоресценции микроплиты читателя на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм.
- Передача 1 л супернатанта на четкую 96-ю хорошо пластину, содержащую 100 мл раствора протеина для измерения концентрации белка с помощью Брэдфордского анализа9.
- Нормализация интенсивности флуоресценции с концентрацией белка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клеток колоректального рака HCT116 лечили 100 м ФС или 10 МЛ DOX, чтобы вызвать окислительный стресс7. Как показано на рисунке 1,зеленая флуоресценция была резко увеличена как FS, так и DOX, как и ожидалось. Для количественной оценки изменения относительной интенсивности клетки были пролистины после получения изображений и нормализованы с концентрацией белка. Количественная интенсивность флуоресценции была значительно увеличена FS или DOX в клетках HCT116.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Экспериментальный протокол, описанный здесь, легко воспроизводится для измерения клеточного общего ROS. Критические шаги включают в себя создание решения DCFH-DA свежим и избегание воздействия света, минимизация нарушения состояния клеток и обширная стирка PBS перед съемкой изображений. Для приготовления рабочего решения DCFH-DA, фондовый раствор должен быть добавлен в предварительно разогретый DMEM прямо перед добавлением в 24 пластины скважины. Причина в том, что старые решения, которые генерируют высокий фон флуоресце...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (K01DK114390), научно-исследовательский грант Американского онкологического общества (RSG-18-050-01-NEC), экспериментальный исследовательский проект Грант из Университета Нью-Мексико экологического здоровья Подпись программы и Superfund (P42 ES025589), Общие ресурсы пилотный проект премии и научно-исследовательской программы поддержки экспериментального проекта премии от UNM всеобъемлющего онкологического центра (P30CA118100) , и новый следователь награду от выделенных фондов исследований в области здравоохранения в Университете Нью-Мексико школы медицины.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетат | Cayman Chemical, Анн-Арбор, Мичиган | 20656 | |
| Доксорубицина гидрохлорид | TCI America, Портленд, Орегон | D4193-25MG | |
| Модифицированный Eagle Medium Dulbecco's Miding | , Corning, NY | 45000-304 | |
| Гептагидрат сульфата железа | VWR, Раднор, Пенсильвания | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | или любой другой флуоресцентный микроскоп |
| Анализ белка Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | или любой другой флуоресцентный микропланшетный ридер |
Ссылки
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235(2018).
- Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
