Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60687

⸱

19 декабря 2019 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Описанный подход сочетает в себе экспериментальные метастазирование хвостовой вены с in vivo живой изображения животных, чтобы в режиме реального времени мониторинга образования метастазов рака молочной железы и роста в дополнение к количественной метастазировать число и размер в легких.

Аннотация

Метастаз является основной причиной смерти, связанной с раком, и существуют ограниченные терапевтические возможности для пациентов с метастатическими заболеваниями. Выявление и тестирование новых терапевтических целей, которые будут способствовать разработке более эффективных методов лечения метастатических заболеваний, требует доклинических моделей in vivo. Демонстрация здесь является сингенной мыши модели для оценки рака молочной железы метастатической колонизации и последующего роста. Метастатические раковые клетки стерливо трансумцируются с вирусными переносчиками, кодирующие светлячок люциферазы и белки SGreen. Кандидат генов затем стабилизированы в люциферазе / SGreen-выражение раковых клеток, а затем клетки вводятся в мышей через боковую вену хвоста, чтобы ассировать метастатическую колонизацию и рост. Устройство in vivo для визуализации используется для измерения биолюминесценции или флуоресценции опухолевых клеток у живых животных для количественной оценки изменений метастатического бремени с течением времени. Выражение флуоресцентного белка позволяет количественно определить количество и размер метастазов в легких в конце эксперимента без необходимости секционирования или гистологического окрашивания. Этот подход предлагает относительно быстрый и простой способ проверить роль генов-кандидатов в метастатической колонизации и роста, и предоставляет гораздо больше информации, чем традиционные анализы метастазов хвостовых вен. Используя этот подход, мы показываем, что одновременное снижение ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного коактиватора с связывающим мотивом PD ' (ТАЗ) в раковых клетках молочной железы приводит к снижению метастатического бремени в легких и что это снижение нагрузки является результатом значительно йогтерированной метастатизации и снижения роста метастазов.

Введение

Рак остается второй ведущей причиной смерти во всем мире1 и метастаз является причиной большинства из этих смертей2,3. Однако ограниченное понимание молекулярных механизмов, регулирующих метастатическую колонизацию и последующий рост, препятствует разработке эффективных методов лечения метастатических заболеваний. Идентификация новых терапевтических целей требует анализа, чтобы проверить, как возмущенное выражение или функция гена кандидата влияет на формирование метастаз и рост метастаза. В то время как автохтонусные модели мыши имеют свои преимущества, они отнимают много времени и дорого генерировать, что делает их более подходящими для целевой проверки, а не целевого обнаружения. Системы модели трансплантации, в которых ген кандидата возмущен в раковых клетках in vitro, а затем воздействие на метастатический потенциал оцениваются in vivo, являются менее дорогостоящими и более высокой пропускной способностью, чем автохтоновые модели. Кроме того, вирусные векторы для стабильной доставки РНК, CRISPR/CAS9 и трансгенов широко доступны, что делает его относительно легко возмущать практически любой ген или гены, представляющие интерес в раковых клеток линий. Этот подход также может быть использован для оценки роли генов-кандидатов в метастатической колонизации и росте раковых клеток человека путем пересадки клеток на ослабленных иммунитетом или гуманизированных мышей.

Два типа анализов, используемых для проверки образования метастазов пересаженные раковые клетки in vivo являются спонтанными метастазами анализы и экспериментальные метастазовые анализы. При спонтанных метастазах анализы4,5, раковые клетки вводятся в мышей, позволило сформировать первичную опухоль, а затем спонтанное образование метастазов и последующего роста анализируются. Сила этой модели заключается в том, что клетки должны завершить все этапы метастатического процесса, чтобы сформировать метастатические опухоли. Тем не менее, многие линии раковых клеток не метастазируют эффективно в спонтанных моделях метастаз, и любые манипуляции клеток, которые влияют на первичный рост опухоли может смутить результаты метастазировать анализ. Экспериментальные метастазные анализы, в которых раковые клетки вводятся непосредственно в обращение, используются, чтобы избежать этих ловушек. Общие экспериментальные метастазовые анализы включают инъекции хвостовойвены 6,7,8 (и продемонстрировали здесь), интракардиальная инъекция9,и портальная инъекциявены 10.

Цель протокола, представленного здесь, заключается в том, чтобы обеспечить экспериментальный метастазный ассса in vivo, который позволяет исследователю отслеживать образование метастазов и рост в режиме реального времени, а также количественно определить количество метастазов и размер ы в легких одной и той же мыши. Для достижения этой цели, традиционные экспериментальные метастазовые хвостовые вены анализы6,7,8 сочетаются с живой изображения животных, используя in vivo изображений устройства9,11,12,13,14. Опухолевые клетки, устойчиво выражающие как люциферазу, так и флуоресцентный белок, вводятся мышам через боковую хвостовую вену, а затем устройство in vivo imaging используется для измерения изменений метастатического бремени в легких с течением времени(рисунок 1). Тем не менее, устройство in vivo live animal image не может различать или измерять размер отдельных метастазов. Таким образом, в конце эксперимента, флуоресцентный стереомикроскоп используется для подсчета числа и измерения размера флуоресцентных метастаз в легких без необходимости секционирования и гистологии или иммуногистохимии (Рисунок 1). Этот протокол может быть использован для проверки того, как изменение экспрессии или функции гена кандидата влияет на формирование метастазирования и рост. Потенциальные терапевтические соединения, такие как небольшие молекулы или функции блокирующие антитела также могут быть проверены.

Чтобы продемонстрировать этот подход, мы впервые выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором основной фактор репликации, репликации белка A3 (RPA3) сбит в метастатических клеток рака молочной железы мыши. Мы показываем, что мыши, вводимые клетками RPA3, имеют значительно меньше метастатического бремени в каждый момент времени по сравнению с мышами, вводимыми контрольными клетками. Анализ метастазов, содержащих легкие, показывает, что это снижение метастатического бремени является результатом значительного снижения метастатического колонизации и нарушения роста метастазов, которые образуются. Чтобы еще больше продемонстрировать этот метод, мы проверили ли одновременно сбить Да связанных белка (YAP) и транскрипционного со-активатора с PD - связывающий мотив (ТАЗ) ухудшает метастатическую колонизацию или последующий рост. YAP и ТАЗ являются двумя связанными транскрипционными со-активаторами, которые являются критическими эффекторами вниз по течению Пути Гиппо. Мы15,16 и другие причастны YAP и ТАЗ в метастазирование (рассмотрено в17,18,19), предполагая, что эти белки являются хорошими терапевтическими целями. Последовательно, мы обнаружили, что мыши, введенные с YAP / TA ' нокдаун клетки значительно снизили метастатическое бремя. Анализ легких показал, что клетки яп/ТАЗ образуют гораздо меньше метастазов и что метастазовые метастаза, которые действительно образуются, были меньше. Эти эксперименты демонстрируют, как экспериментальные метастазные анализы позволяют исследователю быстро и недорого проверить роль гена-кандидата в формировании метастазов и росте. Они также показывают, как комбинированное использование живой визуализации животных и флуоресцентная количественная оценка метастазов в целых легких позволяет исследователю лучше понять шаги во время метастатичной колонизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол предусматривает использование мышей и биоопасных материалов и требует одобрения соответствующих институциональных комитетов по безопасности. Все описанные работы in vivo здесь одобрены Олбани медицинский колледж институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обзора протокола см.

1. Упаковка всех необходимых ретровирусов и лентивирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол использует лецивирные или ретровирусные векторы, чтобы заглушить фермент люциферазы и флуоресцентный белок, а также манипулировать экспрессией гена-кандидата. Эти вирусы упакованы в HEK-293FT клеток, как описано ниже.

  1. День 1: Плита HEK-293FT клетки на 6-ну хорошо пластин в 2 мл полного роста средств (10% FBS в DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамамин), так что они 40-60% сливов на второй день. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за ночь.
  2. День 2: Для каждого вирусного вектора, который будет упакован, трансфектировать 40-60% сольется хорошо HEK-293FT клеток с ретровирусным или лентивирусным вектором и соответствующими векторами, кодирующими вирусную шерсть и упаковочные белки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует VSVG как белок пальто, psPAX2 для лентивирусной упаковки, и кляп-пол для ретровирусной упаковки (см. Дополнительную таблицу 1 для списка переносчиков).
  3. Сделать смесь совместного трансфекции для каждого хорошо следующим образом:
    1. Смешайте 4 зллип липидного раствора для трансфекций (см. Таблицу Материалов)и 96 л трансфекционного буфера и инкубируйте в течение 5 минут.
    2. Добавьте 1 мкг вирусного вектора, 0,5 мкг переносителя белка пальто (VSVG) и 0,5 мкг вектора белка упаковки (psPAX2 или gag-pol) и инкубировать в течение 20 минут.
    3. Аккуратно добавьте смесь со-трансфекции от шага 1.3.2 до клеток HEK-293FT, покрытых шагом 1.1, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за одну ночь.
  4. День 3: Удалите трансфекционные носители из каждого колодца и аккуратно добавьте 2 мл полного роста носителя к каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение примерно 24 часов.
  5. День 4: Соберите вирусный супернатант из каждого колодца с помощью 3 мл шприца и процедите через фильтр 0,45 мкм в микроцентрифугную трубку 2 мл.
  6. Необязательно: Если сбор второй партии вируса желательно, аккуратно добавьте 2 мл полного роста носителя к каждой скважине и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение приблизительно 24 часов.
  7. День 5 (необязательно): Соберите второй раунд вирусного супернатанта, как в шаге 1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлено путем замораживания вирусного супернатанта.

2. Поколение раковых клеток, устойчиво выражающих люциферазу и флуоресцентный белок

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает, как сначала заболонь 4T1 клетки с светлячковой люциферазы и флуоресцентного белка (SGreen) с использованием двух векторов с уникальными генами отбора. Затем3-й вирусный вектор используется для манипулирования экспрессией гена-кандидата. Однако вирусные векторы, которые одновременно обеспечивают флуоресцентный белок и генетические манипуляции, также могут быть использованы в качестве альтернативы (как в репрезентативных экспериментах ниже). Другие раковые клетки могут быть использованы, но номера клеток должны быть оптимизированы для шагов 2.1 и 2.7.1.

  1. Плита 4T1 клетки на 1,5 х 105 клеток / хорошо в 12-хорошо пластины в полном росте средств (10% FBS в DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамин) и инкубировать при 37 кС, 5% CO2 ночь.
  2. Заразить 4T1 клетки с вирусной супернатант генерируется в шаге 1 следующим образом.
    1. Аспирировать рост средств массовой информации из клеток и добавить 500 л люциферазы вирусного супернатанта и 500 л флуоресцентного белка вирусного супернатанта одновременно заразить клетки как люциферазы и флуоресцентные протеин вирусных супернатантов.
    2. Добавьте 1 л из 8 мг/мл бромистого гексадимертрина (см. Таблицу Материалов).
    3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% до 75-90% сплава (обычно 24-48 часов).
  3. Трипсинизуйте 4T1 клетки с 500 зл и трипсина в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в 6-сантиметровое блюдо в 4 мл подбора носителей (полный рост носителя, содержащего соответствующие антибиотики), тем самым закачивая трипсин. Плита 6 см блюдо неинфицированных контрольных клеток в том же средств отбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующая концентрация антибиотиков должна быть определена заранее путем тестирования нескольких доз. Кроме того, флуоресцентная сортировка клеток также может быть использована для выбора флуоресцентно маркированных клеток вместо выбора препарата.
  4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в подборе носителей и разделить клетки, когда это необходимо, пока все неинфицированные контрольные клетки не умертвятся (зависит от гена отбора и клеточной линии).
  5. Подтвердите, что инфицированные 4T1 клетки выражают флуоресцентный белок SGreen с помощью зеленого возбуждения (450-490 нм)/выброс (500-550 нм) фильтра, установленного на перевернутом флуоресцентном микроскопе при 50-100-x увеличении.
  6. Подтвердите, что инфицированные 4T1 клетки выражают люциферазу, используя коммерчески доступный набор активности люциферазы следующим образом.
    1. Используйте минимальный объем 1x пассивный буфер лиза для лиза люциферазы-выражения 4T1 клеток и контролировать 4T1 клетки, которые не выражают люциферазу, мягко тряски в течение 30 минут.
    2. Добавьте 20 зЛ клеточного лисата в белоднюю 96-пуговую пластину, а затем 50 ЗЛ реагента прослеживого вещества из набора активности люциферазы.
    3. Используйте считыватель пластин для измерения люминесценции из клеток на всех длинах волн в спектре с помощью настройки люминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания вниз застойно-трансудированных клеток.
  7. Манипулируйте экспрессией гена кандидата следующим образом:
    1. Плита 6 х 105 помечены 4T1 клетки от шага 2,6 на 60 мм блюдо в 4 мл полного роста средств массовой информации и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 ночь.
    2. Аспирировать рост средств массовой информации от каждой скважины и добавить 2 мл полного роста средств, содержащих 4 л 8 мг/мл гексадиметрина бромида.
    3. Добавьте 2 мл вирусного супернатанта со шага 1 в клетки, покрытые шагом 2.7.2, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за одну ночь.
    4. Трипсинизуйте 4T1 клетки с 500 зл и трипсина в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в 10 см блюдо в 10 мл средств отбора (полный рост средств массовой информации, содержащие соответствующие антибиотики), тем самым затушевывая трипсин. Плита некоторых неинфицированных контроля помечены 4T1 клеток в том же средств отбора.
    5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в подборе носителей и разделить клетки, когда это необходимо, пока все неинфицированные клетки мертвы.
    6. Подтвердите, что экспрессия гена кандидата изменяется с помощью стандартного подхода, такого как западная подательная20 или qPCR21.
    7. Ассаи люминесценции и флуоресценции, как в шагах 2.5-2.6, чтобы определить, насколько похожи они находятся в контроле и нокдаун клетки, так как это может измениться (см. Обсуждение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания вниз застойно-трансудированных клеток.

3. Оптимизация экспериментального дизайна in vivo

  1. Оптимизируйте соответствующее количество клеток и продолжительность эксперимента для желаемого метастатического бремени следующим образом.
    1. Расширьте флуоресцентные и биолюминесцентные 4T1 клетки со ступени 2.6 в носителях полного роста, чтобы лишние клетки были доступны в нужный день инъекции.
    2. Подготовьте клетки для инъекций хвостовой вены, как описано в шаге 4.2. Чтобы определить оптимальное число клеток для инъекций, повторно приостановить клетки в нескольких различных концентрациях в 100 зл и 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем тестировать диапазон номеров/мышей от 25 000 до 500 000.
    3. Держите клеточные подвески на льду до инъекций.
    4. Впрысните каждое разбавление 4T1 клеток со ступени 3.1.2 в 3-4 мышей через боковую хвостовую вену, описанную в шаге 4.3 (см. ниже).
    5. Верните мышь в клетку и монитор в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мыши должны быть проверены на наличие признаков боли или бедствия 3x еженедельно.
    6. Мониторинг мышей для образования метастазов и роста в течение 3-6 недель (клеточная линия и мышь деформации зависит) с помощью in vivo живого устройства изображения животных (см. шаги 5 и 6).
      1. Эвтаназия мышей 3-6 недель после инъекции хвостовой вены в соответствии со стандартными институциональными руководящими принципами.
      2. Подготовьте легкие и оцените размер метастазиса и количество, описанные в шаге 7.
      3. Выберите подходящий промежуток времени для роста метастаза для желаемого метастатического бремени (см. обсуждение).

4. Инъекция хвостовой вены помеченных раковых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4.2.4 был оптимизирован для 4T1 клеток, растущих в сингенных мышах BALB/c. Если используются другие линии раковых клеток и штаммы мыши, количество вводимых клеток и длина ассса сначала должны быть оптимизированы.

  1. Расширьте 4T1 клеточные линии, генерируемые в шаге 2 на двух 15 см блюд в полном росте средств массовой информации, так что избыточные клетки доступны в день инъекции.
  2. Подготовьте клетки для инъекции хвостовой вены следующим образом:
    1. Аспирировать средства массовой информации и промыть пластины клеток с 1x PBS.
    2. Трипсинизуйте клетки 5 мл трипсина на 15 см пластины в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в коническую трубку. Вымойте оставшиеся клетки из ткани культуры блюдо с достаточно полным иском роста, чтобы утолить трипсин и добавить мыть в той же конической трубки.
    3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячейки, чтобы определить общее число ячеек.
    4. Центрифуги клетки на 122 х г в течение 3 минут, аспирируется супернатант, и resuspend клетки в 1x PBS при нужной концентрации. Здесь, 2,5 х 104 клетки вводятся в каждую мышь в 100 л PBS, так что повторноя клетки на 2,5 х 105 клеток / мл. Держите клеточные подвески на льду до инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: важно ограничить время между трипсинизацию клеток и инъекцией хвостовой вены примерно 1 часом.
  3. Впрысните 4T1 клетки от шага 4.2.5 в мышей через боковую вену хвоста следующим образом:
    1. Работая в капюшоне на животном объекте, осторожно, но тщательно смешать клетки, инвертируя трубку или с помощью шприца 1 мл, чтобы убедиться, что они равномерно повторно. Всегда убедитесь, что ячейки переосвязны перед загрузкой шприца.
    2. Загрузите 1 мл Шприца Luer-lock с клеточной подвеской и изгоняют излишки пузырьков воздуха. Поместите 1/2 дюйма, 30-калиберной иглы на шприц с скотом и изгнать пузырьки воздуха.
    3. Аккуратно поместите мышь в удерживающим средством грызунов.
    4. Боковые хвостовые вены должны быть видны и расширены. Если нет, осторожно щепотку основания хвоста и окунуть хвост в теплую воду из-под крана, чтобы утилизно вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диляция вен также может быть достигнута путем размещения клетки мыши под нагревательной лампой и / или на верхней части грелки.
    5. Используйте алкоголь протрите, чтобы очистить хвост. Вставьте иглу в хвостовую вену, сковеди вверх и введите 100 злиц клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла вставляется должным образом в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, и не должно быть сопротивления, когда поршень толкается. Успешные инъекции также должны привести к "флеш", в котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции.
  4. Медленно удалите иглу и с помощью стерильной марли, применить давление на место инъекции, чтобы остановить любое кровотечение.
  5. Верните мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мыши должны быть проверены на наличие признаков боли или бедствия 3x еженедельно.
  6. Мониторинг мышей для образования метастазов и роста в течение 3-6 недель (клеточная линия и мышь деформации зависит) с помощью in vivo живого устройства изображения животных (см. шаги 5 и 6).

5. Мониторинг метастатического бремени с помощью флуоресценции с помощью устройства визуализации живого изображения животных in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Не изображение животного для флуоресценции с активным люминесцентным сигналом.

  1. Если только визуализация биолюминесценции, перейдите к шагу 6.
  2. Включите устройство in vivo live animal imaging.
  3. Настройка in vivo живой системы визуализации животных в соответствии с руководящими принципами производителя, чтобы доставить между 1,5% и 2% изолюран в анестезии камеры и камеры изображения.
  4. Анестезируйте мышей с флуоресцентно помеченными метастазами со 4-го шага, поместив их в анестезионную камеру и доставляя 1,5-2,5% изофлуран.
  5. Откройте программное обеспечение для изображений (см. Таблицу Материалов)и войти.
  6. Нажмите кнопку Инициализация и ждать, пока машина инициализируется.
  7. Измените Поле зрения на D.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поле View C также может быть использовано, если требуется более близкий вид мыши, но это ограничивает количество мышей, которые могут быть изображены одновременно.
  8. После того, как программное обеспечение показало, что камера достигла соответствующей температуры, нажмите кнопку Imaging Wizard, выберите Fluorescence, а затем выберите соответствующую пару фильтров из выпадающего меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фторофор используется не вариант, выберите вход EX / EM и типа возбуждения и выбросов требуется.
  9. Поместите мышь в камеру, как описано в шаге 3.2.4.
  10. Нажмите Приобрести Последовательность.
  11. После получения изображения верните мышь в клетку и проследите в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное выздоровление.
  12. Повторите шаг 5.2 и шаги 5.7-5.9 с по крайней мере одной мышью, которая не содержит метастаз. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта мышь будет использоваться для количественной оценки и вычитания фонового сигнала во время анализа (шаг 8).
  13. Изображение 2-3 раза в неделю в течение всего эксперимента.

6. Мониторинг метастатического бремени с помощью биолюминесценции с помощью устройства визуализации живого изображения животных in vivo

  1. Включите устройство in vivo live animal imaging и установите программу следующим образом.
    1. Откройте программное обеспечение для изображений (см. Таблицу Материалов)и войти. Нажмите кнопку Инициализация и ждать, пока машина инициализируется. Измените Поле зрения на D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поле view C может быть использовано для более близкого представления к изображению полного тела мыши; однако, это ограничивает количество мышей, которые могут быть изображены сразу.
    2. Для использования в первый раз, отодевайте настройки экспозиции следующим образом: нажмите «Оторите» Предпочтения Приобретение (приобретение) Автоматическая экспозиция и изменить максимальное время экспозиции от по умолчанию 60 секунд до 300 секунд и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте никаких других параметров во вкладке автоматической экспозиции.
  2. Настройка системы анестезии в соответствии с руководящими принципами производителя, чтобы доставить от 1,5% до 2% изолюран в анестезии камеры и камеры изображения.
  3. Убедитесь, что камера достигла соответствующей температуры, прежде чем приступить к шагу 6.4.
  4. Обезболивающее метастазно-содержащее метастазирование мышей со 4-го шага, поместив их в анестезионную камеру и доставляя 1,5-2,5% изолюран.
  5. Подготовка мышей для биолюминесценции изображения следующим образом.
    1. Загрузите 1 мл шприца с D-люциферином (30 мг/мл в D-PBS), а затем добавьте 1'2 дюйма 30-калийной иглы шприц и изгнать пузырьки воздуха.
    2. Измерьте и запишите массу анестезируевской мыши.
    3. Сдержать мышь, щипать потертости шеи с помощью большого пальца и указательных пальцев и схватив хвост между мизинец палец и основание руки. Переворачивать мышь под углом 45 градусов, с головой, направленной вниз.
    4. Вставьте иглу, сковадину вверх, в левую сторону мыши интраперитонеального (IP) пространства. Подтвердите вход в пространство IP, отодвивая небольшой объем. Не должно быть цвета в основании иглы при оттягивании в пространстве IP.
    5. Вводят соответствующий объем D-люциферина в дозе 150 мг/кг.
    6. Сразу же после D-люциферина администрации, начать таймер и поместить мышь плашмя на спину в устройстве визуализации с носом в нос конуса и убедитесь, что 1,5-2,5% изофлуран вводится. Поместите разделители между каждой мышью при визуализации нескольких мышей. Убедитесь, что мыши расположены как можно более плоские (т.е. не склоняются в одну сторону).
    7. Нажмите Luminescent и фотографии коробки, а затем нажмите Приобрести в панели управления приобретением.
  6. Непрерывно приобретать биолюминесцентные изображения до тех пор, пока пик сигнала достигается и использовать изображение с пиковым биолюминесцентным сигналом для анализа.
  7. После получения изображения верните мышь в клетку и проследите в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное выздоровление.
  8. Изображение 2-3 раза в неделю в течение всего эксперимента.

7. Количества и размер метастаз

ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени метастазами разрешено расти должна быть определена для каждой линии клеток и мыши штамма, и будет зависеть от количества клеток вводили.

  1. Эвтаназия мышей в соответствии со стандартными институциональными руководящими принципами.
  2. Изолировать и удалить легкие из каждой мыши и промыть в 1x PBS, чтобы удалить избыток крови.
  3. Аккуратно разделите легкие на доли.
  4. Приобретайте изображения метастазов sGreen в доле в 10x в ярком поле и флуоресценции с помощью флуоресцентного стереоскопа с широкодиапазонным фильтром GFP (возбуждение 470/40x).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте одинаковое увеличение и яркость для всех образцов. Используемое увеличение может варьироваться в зависимости от размера, количества и яркости метастаз, а также поля зрения для используемого микроскопа.
  5. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки размера и количества метастазизмов изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для анализа изображений зависит от программного обеспечения и может быть оптимизирован с опухолями от step3. Кроме того, подсчитайте количество метастаз в каждом легком вручную с помощью флуоресцентного стереоскопа. Протокол может быть приостановлен здесь и шаг 8 может быть сделано в любой момент после того, как все изображения in vivo были собраны.

8. Обработка и анализ данных с изображений, полученных с помощью устройства визуализации живых животных in vivo

  1. Откройте все файлы изображений для каждой мыши в программном обеспечении изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изображение с пиковым биолюминесцентным сигналом для анализа
  2. Убедитесь, что единицы находятся в Radiance для биолюминесцентных данных и эффективности для флуоресцентных данных, нажав на стрелку в левом верхнем верхнем отоке изображения и изменив ее на соответствующую единицу.
  3. Используйте изображение с последней точки времени для создания региона интереса (ROI) следующим образом.
    1. Нажмите ROI Tools в окне палитры инструментов. Вставьте одну рентабельность инвестиций, нажав на стрелку и выбрав 1.
    2. Нажмите на границу рентабельности инвестиций и переместите ее через грудь мыши. Отрегулируйте размер рентабельности инвестиций таким образом, чтобы она покрывала грудь мыши и не исключала сигнал.
  4. Нажмите измерить ROIs и скопировать или введите сырой номер в лист Excel.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для биолюминесцентных данных выберите общий поток (фотоны в секунду), который является суммой всего сияния в рентабельности инвестиций. Поскольку метастаза не обязательно растут равномерно, общий поток предпочтительнее среднего сияния, поскольку он измеряет сумму метастатического бремени. Аналогичным образом, для флуоресцентных данных вместо средней эффективности следует использовать % общей эффективности (свет выбросов (фотон/второй)/возбуждательный свет (фотоны/секунда)..
  5. Нажмите в файле изображения, чтобы скопировать рентабельность инвестиций, используемых в шаге 8.3, и вставить ее в каждый файл изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При количественной оценке флуоресцентных изображений, количественно той же области на мыши, которая была изображена без метастаз. Используйте этот сигнал в качестве фонового сигнала и вычесть его из каждого флуоресцентного метастазя, содержащего изображение мыши приобрел.
  6. Перемещение вставки ROIs над той же областью, выбранной в шаге 8.3.4 для каждого изображения и повторите шаг 8.4.
  7. Участок и анализ необработанных данных следующим образом (см. Дополнительную таблицу 2).
    1. Сделайте преобразованиежурнала 10 необработанных данных для каждой мыши с помощью указанной формулы(Дополнительная таблица 2)и участок, как на рисунке 2D и рисунок 4F. Преобразование журнала10 линейно линейно кривой роста, которая имеет тенденцию быть геометрической и сводит к минимуму гетероскедастичность.
    2. Используя линейную регрессию, вычислите наклон установленной линии в журнал10 преобразованных данных для каждой мыши, начертанных в шаге 8.7.1(Дополнительная таблица 2). Обратитесь к формуле в дополнительной таблице 2, чтобы соответствовать линии и рассчитать наклон в один шаг.
    3. Участок численные значения склонов, как на рисунке 2E и Рисунок 4G. Для определения статистической значимости используйте T-test или one-way ANOVA (более 2 групп).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать вышеподход, мы выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором критический фактор репликации, RPA3 был сбит в метастатической линии клеток карциномы мыши (4T122). В то время как протокол описывает маркировку клеток как люциферазы и флуоресцентные белки до генетических манипуляций, мы использовали модифицированный подход, потому что векторы РНК также доставить SGreen (Рисунок 2A). Во-первых, 4T1 клетки были зас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги метода
Очень важно оптимизировать количество впрыскиваемых клеток (шаг 3) для данной клеточной линии и деформации мыши, поскольку это может значительно повлиять на количество метастаз, которые образуются, и продолжительность эксперимента. Если слишком много клеток вводят или метастаза растут слишком долго, метастаза может быть трудно подсчитать, что делает последствия генетических манипуляций трудно оценить. Однако, если слишком мало клеток вводят, мало или нет метастаз может образовы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Эмили Нортон за помощь в борьбе с вирусными инфекциями и критическое чтение рукописи. Мы также благодарим Райана Канаи за помощь в получении изображений легких и Кейт Э. Таббесинг за помощь в анализе изображений зеленых метастазов в легких. Мы благодарим сотрудников научно-исследовательского центра по животноводству за поддержку и помощь в подготовке этого видео. Эта работа была поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присудил JML (#CCR17477184).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% SDS-PAGE ГельДля вестерн-блоттинга
2,5% ТрипсинGibco15090-046Трипсин для культуры тканей
96 луночный белый аналитический планшет с плоским дномCorning3922Для измерения сигнала люциферазы и почечники в культивируемых клетках
Спиртовые салфеткиДля стерилизации места инъекции перед инжецитоном хвостовой вены
BALB/C мыши ( самка, 6 недель)TaconicBALB-FДля метастатической колонизации хвостовых вен и анализов нагрузки
BSA regularVWR Ameresco97061-416Для вестерн-блоттинга
Буфер для лизиса клетокКлеточная сигнализацияДля сбора образцов протиена
Celltreat Шприцевые фильтры, PES 30 мм, 0,45 μ mCelltreat40-229749-CSДля фильтрации вирусной надосадочной жидкости
CO2 и камерыДля эвтаназии мышей
Набор для анализа двойной люциферазыPromegaE1960Для измерения сигнала люциферазы и рениллы в культивируемых клетках
Dulbecco& 39; s фосфатный буферный растворHimediaTS1006Для PBS
EDTAVWR97061-406Используется для разбавления трипсина для культуры тканей
FBS 100% американского происхожденияVWR97068-085Компонент полной питательной среды
Fujifilm LAS-3000 гель имиджерFujifilmДля вестерн-блоттинга
GAPDH (14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118Для вестерн-блот
Козий антикроличий IgG (H+L) Вторичное антитело, конъюгат HRPThermo Scientific31460Для вестерн-блоттинга
Клетки эмбриональных почек человека, HEK-293FTInvitrogenR70007Клеточная линия, используемая для упаковки вируса
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare медико-биологические наукиSH30243.01Компонент полной питательной среды
Гигромицин B, ультрачистый сортVWR Ameresco97064-810Для отбора антибиотиков инфицированных клеток
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesДля измерения сигнала люциферазы и рениллы в культивируемых клетках
ImagejИспользуется для анализа изображений метастазов в легких: порог установлен на 25 и 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177Для вестерн-блоттинга
Изофлурандля анестезии мышей
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (устройство для визуализации живых животных in vivo)PerkinElmerCLS136340Для визуализации метастатической нагрузки in vivo
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP и фильтры светлого поля)Leica MicrosystemsМикроскоп и камера для визуализации, подсчета и снятия отпечатков метастазов в легких; 10-кратное увеличение, 3,5 сек экспозиция, 1,4 усиления
L-глутаминGibco25030-081Компонент полной питательной среды
Липофектамин 3000Life technologiesL3000008для репортера
YAP/TAZ-TEAD репортерLiving Image 3.2 (программа для обработки изображений)PerkinElmerПрограммное обеспечение для
клеток рака молочной железы мыши IVIS, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Метастатическая клеточная линия молочной железы мыши
Multi-Gauge version 3.0FujifilmПрограммное обеспечение для количественной оценки интенсивности полосы вестерн-блоттинг
Opti-MEM (буфер для трансфекции)Gibco31985-062Для упаковки вируса и трансфекции
Пенициллин стрептомицинGibco15140-122Компонент полной питательной среды
Набор для анализа белка Pierce BCAThermo Scientific23225Для количественной оценки концентрации белка
Ингибитор фосфатазы Пирс Мини таблеткиThermo ScientificA32957Добавлен в буфер для лизиса клеток
Ингибитор протеазы Пирс Мини таблеткиThermo ScientificA32953Добавлен в буфер для лизиса клеток
Полибрен (гексадиметрина бромид)Sigma-Aldrich45-H9268При инфекции
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255Для отбора антибиотиков инфицированных клеток
Грызуны RestrainerДля удержания мышей во время работы буфера
SDS-PAGEДля вестерн-блоттинга
TAZ (V3886) АнтителаCell Signaling4883Для западного блоттинга
TBST буферДля западного блоттинга
TC20 автоматический счетчик клетокBio-RadДля подсчета клеток
ВекторыПолный список векторов см. в таблице 1
VWR Инвертированный флуоресцентный микроскопVWR89404-464Для визуализации флуоресценции в ZSGreen меченые клетки
Западный трансферный буферДля вестерн-блоттинга
XenoLight D-люциферин K+ СольPerkinElmer122799Субстрат вводится мышам для биолюминесцентных изображений IVIS in vivo
X-tremeGENE 9 Реагент для трансфекции ДНК X-tremeGENE 9 (липидный раствор для трансфекции)Roche6365787001Для упаковки вируса
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074Для вестерн-блоттинга
эвтаназии для хвостовых вен

Ссылки

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122(2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119(2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529(2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647(2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310(2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122(2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Метастазирование рака молочной железыколонизация легкихбиолюминесцентная визуализацияфлуоресцентная визуализацияметастатическая нагрузканокдаун YAP TAZколичественная оценка метастазовдизайн экспериментов in vivo
Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.