Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких

Рак остается второй ведущей причиной смерти во всем мире¹ и метастаз является причиной большинства из этих смертей^2,3. Однако ограниченное понимание молекулярных механизмов, регулирующих метастатическую колонизацию и последующий рост, препятствует разработке эффективных методов лечения метастатических заболеваний. Идентификация новых терапевтических целей требует анализа, чтобы проверить, как возмущенное выражение или функция гена кандидата влияет на формирование метастаз и рост метастаза. В то время как автохтонусные модели мыши имеют свои преимущества, они отнимают много времени и дорого генерировать, что делает их более подходящими для целевой проверки, а не целевого обнаружения. Системы модели трансплантации, в которых ген кандидата возмущен в раковых клетках in vitro, а затем воздействие на метастатический потенциал оцениваются in vivo, являются менее дорогостоящими и более высокой пропускной способностью, чем автохтоновые модели. Кроме того, вирусные векторы для стабильной доставки РНК, CRISPR/CAS9 и трансгенов широко доступны, что делает его относительно легко возмущать практически любой ген или гены, представляющие интерес в раковых клеток линий. Этот подход также может быть использован для оценки роли генов-кандидатов в метастатической колонизации и росте раковых клеток человека путем пересадки клеток на ослабленных иммунитетом или гуманизированных мышей.

Два типа анализов, используемых для проверки образования метастазов пересаженные раковые клетки in vivo являются спонтанными метастазами анализы и экспериментальные метастазовые анализы. При спонтанных метастазах анализы^4,5, раковые клетки вводятся в мышей, позволило сформировать первичную опухоль, а затем спонтанное образование метастазов и последующего роста анализируются. Сила этой модели заключается в том, что клетки должны завершить все этапы метастатического процесса, чтобы сформировать метастатические опухоли. Тем не менее, многие линии раковых клеток не метастазируют эффективно в спонтанных моделях метастаз, и любые манипуляции клеток, которые влияют на первичный рост опухоли может смутить результаты метастазировать анализ. Экспериментальные метастазные анализы, в которых раковые клетки вводятся непосредственно в обращение, используются, чтобы избежать этих ловушек. Общие экспериментальные метастазовые анализы включают инъекции хвостовой^{вены 6,7,8} (и продемонстрировали здесь), интракардиальная инъекция^9,и портальная инъекция^{вены 10}.

Цель протокола, представленного здесь, заключается в том, чтобы обеспечить экспериментальный метастазный ассса in vivo, который позволяет исследователю отслеживать образование метастазов и рост в режиме реального времени, а также количественно определить количество метастазов и размер ы в легких одной и той же мыши. Для достижения этой цели, традиционные экспериментальные метастазовые хвостовые вены анализы^6,7,8 сочетаются с живой изображения животных, используя in vivo изображений устройства^{9,11,12,13,14}. Опухолевые клетки, устойчиво выражающие как люциферазу, так и флуоресцентный белок, вводятся мышам через боковую хвостовую вену, а затем устройство in vivo imaging используется для измерения изменений метастатического бремени в легких с течением времени(рисунок 1). Тем не менее, устройство in vivo live animal image не может различать или измерять размер отдельных метастазов. Таким образом, в конце эксперимента, флуоресцентный стереомикроскоп используется для подсчета числа и измерения размера флуоресцентных метастаз в легких без необходимости секционирования и гистологии или иммуногистохимии (Рисунок 1). Этот протокол может быть использован для проверки того, как изменение экспрессии или функции гена кандидата влияет на формирование метастазирования и рост. Потенциальные терапевтические соединения, такие как небольшие молекулы или функции блокирующие антитела также могут быть проверены.

Чтобы продемонстрировать этот подход, мы впервые выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором основной фактор репликации, репликации белка A3 (RPA3) сбит в метастатических клеток рака молочной железы мыши. Мы показываем, что мыши, вводимые клетками RPA3, имеют значительно меньше метастатического бремени в каждый момент времени по сравнению с мышами, вводимыми контрольными клетками. Анализ метастазов, содержащих легкие, показывает, что это снижение метастатического бремени является результатом значительного снижения метастатического колонизации и нарушения роста метастазов, которые образуются. Чтобы еще больше продемонстрировать этот метод, мы проверили ли одновременно сбить Да связанных белка (YAP) и транскрипционного со-активатора с PD - связывающий мотив (ТАЗ) ухудшает метастатическую колонизацию или последующий рост. YAP и ТАЗ являются двумя связанными транскрипционными со-активаторами, которые являются критическими эффекторами вниз по течению Пути Гиппо. Мы^15,16 и другие причастны YAP и ТАЗ в метастазирование (рассмотрено в^17,18,19), предполагая, что эти белки являются хорошими терапевтическими целями. Последовательно, мы обнаружили, что мыши, введенные с YAP / TA ' нокдаун клетки значительно снизили метастатическое бремя. Анализ легких показал, что клетки яп/ТАЗ образуют гораздо меньше метастазов и что метастазовые метастаза, которые действительно образуются, были меньше. Эти эксперименты демонстрируют, как экспериментальные метастазные анализы позволяют исследователю быстро и недорого проверить роль гена-кандидата в формировании метастазов и росте. Они также показывают, как комбинированное использование живой визуализации животных и флуоресцентная количественная оценка метастазов в целых легких позволяет исследователю лучше понять шаги во время метастатичной колонизации.

Этот протокол предусматривает использование мышей и биоопасных материалов и требует одобрения соответствующих институциональных комитетов по безопасности. Все описанные работы in vivo здесь одобрены Олбани медицинский колледж институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обзора протокола см.

1. Упаковка всех необходимых ретровирусов и лентивирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол использует лецивирные или ретровирусные векторы, чтобы заглушить фермент люциферазы и флуоресцентный белок, а также манипулировать экспрессией гена-кандидата. Эти вирусы упакованы в HEK-293FT клеток, как описано ниже.

1. День 1: Плита HEK-293FT клетки на 6-ну хорошо пластин в 2 мл полного роста средств (10% FBS в DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамамин), так что они 40-60% сливов на второй день. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ за ночь.
2. День 2: Для каждого вирусного вектора, который будет упакован, трансфектировать 40-60% сольется хорошо HEK-293FT клеток с ретровирусным или лентивирусным вектором и соответствующими векторами, кодирующими вирусную шерсть и упаковочные белки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует VSVG как белок пальто, psPAX2 для лентивирусной упаковки, и кляп-пол для ретровирусной упаковки (см. Дополнительную таблицу 1 для списка переносчиков).
3. Сделать смесь совместного трансфекции для каждого хорошо следующим образом:
   1. Смешайте 4 зллип липидного раствора для трансфекций (см. Таблицу Материалов)и 96 л трансфекционного буфера и инкубируйте в течение 5 минут.
   2. Добавьте 1 мкг вирусного вектора, 0,5 мкг переносителя белка пальто (VSVG) и 0,5 мкг вектора белка упаковки (psPAX2 или gag-pol) и инкубировать в течение 20 минут.
   3. Аккуратно добавьте смесь со-трансфекции от шага 1.3.2 до клеток HEK-293FT, покрытых шагом 1.1, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ за одну ночь.
4. День 3: Удалите трансфекционные носители из каждого колодца и аккуратно добавьте 2 мл полного роста носителя к каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ в течение примерно 24 часов.
5. День 4: Соберите вирусный супернатант из каждого колодца с помощью 3 мл шприца и процедите через фильтр 0,45 мкм в микроцентрифугную трубку 2 мл.
6. Необязательно: Если сбор второй партии вируса желательно, аккуратно добавьте 2 мл полного роста носителя к каждой скважине и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ в течение приблизительно 24 часов.
7. День 5 (необязательно): Соберите второй раунд вирусного супернатанта, как в шаге 1.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлено путем замораживания вирусного супернатанта.

2. Поколение раковых клеток, устойчиво выражающих люциферазу и флуоресцентный белок

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает, как сначала заболонь 4T1 клетки с светлячковой люциферазы и флуоресцентного белка (SGreen) с использованием двух векторов с уникальными генами отбора. Затем^3-й вирусный вектор используется для манипулирования экспрессией гена-кандидата. Однако вирусные векторы, которые одновременно обеспечивают флуоресцентный белок и генетические манипуляции, также могут быть использованы в качестве альтернативы (как в репрезентативных экспериментах ниже). Другие раковые клетки могут быть использованы, но номера клеток должны быть оптимизированы для шагов 2.1 и 2.7.1.

1. Плита 4T1 клетки на 1,5 х 10⁵ клеток / хорошо в 12-хорошо пластины в полном росте средств (10% FBS в DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамин) и инкубировать при 37 кС, 5% CO₂ ночь.
2. Заразить 4T1 клетки с вирусной супернатант генерируется в шаге 1 следующим образом.
   1. Аспирировать рост средств массовой информации из клеток и добавить 500 л люциферазы вирусного супернатанта и 500 л флуоресцентного белка вирусного супернатанта одновременно заразить клетки как люциферазы и флуоресцентные протеин вирусных супернатантов.
   2. Добавьте 1 л из 8 мг/мл бромистого гексадимертрина (см. Таблицу Материалов).
   3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% до 75-90% сплава (обычно 24-48 часов).
3. Трипсинизуйте 4T1 клетки с 500 зл и трипсина в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в 6-сантиметровое блюдо в 4 мл подбора носителей (полный рост носителя, содержащего соответствующие антибиотики), тем самым закачивая трипсин. Плита 6 см блюдо неинфицированных контрольных клеток в том же средств отбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующая концентрация антибиотиков должна быть определена заранее путем тестирования нескольких доз. Кроме того, флуоресцентная сортировка клеток также может быть использована для выбора флуоресцентно маркированных клеток вместо выбора препарата.
4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ в подборе носителей и разделить клетки, когда это необходимо, пока все неинфицированные контрольные клетки не умертвятся (зависит от гена отбора и клеточной линии).
5. Подтвердите, что инфицированные 4T1 клетки выражают флуоресцентный белок SGreen с помощью зеленого возбуждения (450-490 нм)/выброс (500-550 нм) фильтра, установленного на перевернутом флуоресцентном микроскопе при 50-100-x увеличении.
6. Подтвердите, что инфицированные 4T1 клетки выражают люциферазу, используя коммерчески доступный набор активности люциферазы следующим образом.
   1. Используйте минимальный объем 1x пассивный буфер лиза для лиза люциферазы-выражения 4T1 клеток и контролировать 4T1 клетки, которые не выражают люциферазу, мягко тряски в течение 30 минут.
   2. Добавьте 20 зЛ клеточного лисата в белоднюю 96-пуговую пластину, а затем 50 ЗЛ реагента прослеживого вещества из набора активности люциферазы.
   3. Используйте считыватель пластин для измерения люминесценции из клеток на всех длинах волн в спектре с помощью настройки люминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания вниз застойно-трансудированных клеток.
7. Манипулируйте экспрессией гена кандидата следующим образом:
   1. Плита 6 х 10⁵ помечены 4T1 клетки от шага 2,6 на 60 мм блюдо в 4 мл полного роста средств массовой информации и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ ночь.
   2. Аспирировать рост средств массовой информации от каждой скважины и добавить 2 мл полного роста средств, содержащих 4 л 8 мг/мл гексадиметрина бромида.
   3. Добавьте 2 мл вирусного супернатанта со шага 1 в клетки, покрытые шагом 2.7.2, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ за одну ночь.
   4. Трипсинизуйте 4T1 клетки с 500 зл и трипсина в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в 10 см блюдо в 10 мл средств отбора (полный рост средств массовой информации, содержащие соответствующие антибиотики), тем самым затушевывая трипсин. Плита некоторых неинфицированных контроля помечены 4T1 клеток в том же средств отбора.
   5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ в подборе носителей и разделить клетки, когда это необходимо, пока все неинфицированные клетки мертвы.
   6. Подтвердите, что экспрессия гена кандидата изменяется с помощью стандартного подхода, такого как западная подательная²⁰ или qPCR^21.
   7. Ассаи люминесценции и флуоресценции, как в шагах 2.5-2.6, чтобы определить, насколько похожи они находятся в контроле и нокдаун клетки, так как это может измениться (см. Обсуждение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания вниз застойно-трансудированных клеток.

3. Оптимизация экспериментального дизайна in vivo

1. Оптимизируйте соответствующее количество клеток и продолжительность эксперимента для желаемого метастатического бремени следующим образом.
   1. Расширьте флуоресцентные и биолюминесцентные 4T1 клетки со ступени 2.6 в носителях полного роста, чтобы лишние клетки были доступны в нужный день инъекции.
   2. Подготовьте клетки для инъекций хвостовой вены, как описано в шаге 4.2. Чтобы определить оптимальное число клеток для инъекций, повторно приостановить клетки в нескольких различных концентрациях в 100 зл и 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем тестировать диапазон номеров/мышей от 25 000 до 500 000.
   3. Держите клеточные подвески на льду до инъекций.
   4. Впрысните каждое разбавление 4T1 клеток со ступени 3.1.2 в 3-4 мышей через боковую хвостовую вену, описанную в шаге 4.3 (см. ниже).
   5. Верните мышь в клетку и монитор в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мыши должны быть проверены на наличие признаков боли или бедствия 3x еженедельно.
   6. Мониторинг мышей для образования метастазов и роста в течение 3-6 недель (клеточная линия и мышь деформации зависит) с помощью in vivo живого устройства изображения животных (см. шаги 5 и 6).
      1. Эвтаназия мышей 3-6 недель после инъекции хвостовой вены в соответствии со стандартными институциональными руководящими принципами.
      2. Подготовьте легкие и оцените размер метастазиса и количество, описанные в шаге 7.
      3. Выберите подходящий промежуток времени для роста метастаза для желаемого метастатического бремени (см. обсуждение).

4. Инъекция хвостовой вены помеченных раковых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4.2.4 был оптимизирован для 4T1 клеток, растущих в сингенных мышах BALB/c. Если используются другие линии раковых клеток и штаммы мыши, количество вводимых клеток и длина ассса сначала должны быть оптимизированы.

1. Расширьте 4T1 клеточные линии, генерируемые в шаге 2 на двух 15 см блюд в полном росте средств массовой информации, так что избыточные клетки доступны в день инъекции.
2. Подготовьте клетки для инъекции хвостовой вены следующим образом:
   1. Аспирировать средства массовой информации и промыть пластины клеток с 1x PBS.
   2. Трипсинизуйте клетки 5 мл трипсина на 15 см пластины в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в коническую трубку. Вымойте оставшиеся клетки из ткани культуры блюдо с достаточно полным иском роста, чтобы утолить трипсин и добавить мыть в той же конической трубки.
   3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячейки, чтобы определить общее число ячеек.
   4. Центрифуги клетки на 122 х г в течение 3 минут, аспирируется супернатант, и resuspend клетки в 1x PBS при нужной концентрации. Здесь, 2,5 х 10⁴ клетки вводятся в каждую мышь в 100 л PBS, так что повторноя клетки на 2,5 х 10⁵ клеток / мл. Держите клеточные подвески на льду до инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: важно ограничить время между трипсинизацию клеток и инъекцией хвостовой вены примерно 1 часом.
3. Впрысните 4T1 клетки от шага 4.2.5 в мышей через боковую вену хвоста следующим образом:
   1. Работая в капюшоне на животном объекте, осторожно, но тщательно смешать клетки, инвертируя трубку или с помощью шприца 1 мл, чтобы убедиться, что они равномерно повторно. Всегда убедитесь, что ячейки переосвязны перед загрузкой шприца.
   2. Загрузите 1 мл Шприца Luer-lock с клеточной подвеской и изгоняют излишки пузырьков воздуха. Поместите 1/2 дюйма, 30-калиберной иглы на шприц с скотом и изгнать пузырьки воздуха.
   3. Аккуратно поместите мышь в удерживающим средством грызунов.
   4. Боковые хвостовые вены должны быть видны и расширены. Если нет, осторожно щепотку основания хвоста и окунуть хвост в теплую воду из-под крана, чтобы утилизно вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диляция вен также может быть достигнута путем размещения клетки мыши под нагревательной лампой и / или на верхней части грелки.
   5. Используйте алкоголь протрите, чтобы очистить хвост. Вставьте иглу в хвостовую вену, сковеди вверх и введите 100 злиц клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла вставляется должным образом в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, и не должно быть сопротивления, когда поршень толкается. Успешные инъекции также должны привести к "флеш", в котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции.
4. Медленно удалите иглу и с помощью стерильной марли, применить давление на место инъекции, чтобы остановить любое кровотечение.
5. Верните мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мыши должны быть проверены на наличие признаков боли или бедствия 3x еженедельно.
6. Мониторинг мышей для образования метастазов и роста в течение 3-6 недель (клеточная линия и мышь деформации зависит) с помощью in vivo живого устройства изображения животных (см. шаги 5 и 6).

5. Мониторинг метастатического бремени с помощью флуоресценции с помощью устройства визуализации живого изображения животных in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Не изображение животного для флуоресценции с активным люминесцентным сигналом.

1. Если только визуализация биолюминесценции, перейдите к шагу 6.
2. Включите устройство in vivo live animal imaging.
3. Настройка in vivo живой системы визуализации животных в соответствии с руководящими принципами производителя, чтобы доставить между 1,5% и 2% изолюран в анестезии камеры и камеры изображения.
4. Анестезируйте мышей с флуоресцентно помеченными метастазами со 4-го шага, поместив их в анестезионную камеру и доставляя 1,5-2,5% изофлуран.
5. Откройте программное обеспечение для изображений (см. Таблицу Материалов)и войти.
6. Нажмите кнопку Инициализация и ждать, пока машина инициализируется.
7. Измените Поле зрения на D.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поле View C также может быть использовано, если требуется более близкий вид мыши, но это ограничивает количество мышей, которые могут быть изображены одновременно.
8. После того, как программное обеспечение показало, что камера достигла соответствующей температуры, нажмите кнопку Imaging Wizard, выберите Fluorescence, а затем выберите соответствующую пару фильтров из выпадающего меню.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если фторофор используется не вариант, выберите вход EX / EM и типа возбуждения и выбросов требуется.
9. Поместите мышь в камеру, как описано в шаге 3.2.4.
10. Нажмите Приобрести Последовательность.
11. После получения изображения верните мышь в клетку и проследите в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное выздоровление.
12. Повторите шаг 5.2 и шаги 5.7-5.9 с по крайней мере одной мышью, которая не содержит метастаз. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта мышь будет использоваться для количественной оценки и вычитания фонового сигнала во время анализа (шаг 8).
13. Изображение 2-3 раза в неделю в течение всего эксперимента.

6. Мониторинг метастатического бремени с помощью биолюминесценции с помощью устройства визуализации живого изображения животных in vivo

1. Включите устройство in vivo live animal imaging и установите программу следующим образом.
   1. Откройте программное обеспечение для изображений (см. Таблицу Материалов)и войти. Нажмите кнопку Инициализация и ждать, пока машина инициализируется. Измените Поле зрения на D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поле view C может быть использовано для более близкого представления к изображению полного тела мыши; однако, это ограничивает количество мышей, которые могут быть изображены сразу.
   2. Для использования в первый раз, отодевайте настройки экспозиции следующим образом: нажмите «Оторите» Предпочтения Приобретение (приобретение) Автоматическая экспозиция и изменить максимальное время экспозиции от по умолчанию 60 секунд до 300 секунд и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте никаких других параметров во вкладке автоматической экспозиции.
2. Настройка системы анестезии в соответствии с руководящими принципами производителя, чтобы доставить от 1,5% до 2% изолюран в анестезии камеры и камеры изображения.
3. Убедитесь, что камера достигла соответствующей температуры, прежде чем приступить к шагу 6.4.
4. Обезболивающее метастазно-содержащее метастазирование мышей со 4-го шага, поместив их в анестезионную камеру и доставляя 1,5-2,5% изолюран.
5. Подготовка мышей для биолюминесценции изображения следующим образом.
   1. Загрузите 1 мл шприца с D-люциферином (30 мг/мл в D-PBS), а затем добавьте 1'2 дюйма 30-калийной иглы шприц и изгнать пузырьки воздуха.
   2. Измерьте и запишите массу анестезируевской мыши.
   3. Сдержать мышь, щипать потертости шеи с помощью большого пальца и указательных пальцев и схватив хвост между мизинец палец и основание руки. Переворачивать мышь под углом 45 градусов, с головой, направленной вниз.
   4. Вставьте иглу, сковадину вверх, в левую сторону мыши интраперитонеального (IP) пространства. Подтвердите вход в пространство IP, отодвивая небольшой объем. Не должно быть цвета в основании иглы при оттягивании в пространстве IP.
   5. Вводят соответствующий объем D-люциферина в дозе 150 мг/кг.
   6. Сразу же после D-люциферина администрации, начать таймер и поместить мышь плашмя на спину в устройстве визуализации с носом в нос конуса и убедитесь, что 1,5-2,5% изофлуран вводится. Поместите разделители между каждой мышью при визуализации нескольких мышей. Убедитесь, что мыши расположены как можно более плоские (т.е. не склоняются в одну сторону).
   7. Нажмите Luminescent и фотографии коробки, а затем нажмите Приобрести в панели управления приобретением.
6. Непрерывно приобретать биолюминесцентные изображения до тех пор, пока пик сигнала достигается и использовать изображение с пиковым биолюминесцентным сигналом для анализа.
7. После получения изображения верните мышь в клетку и проследите в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное выздоровление.
8. Изображение 2-3 раза в неделю в течение всего эксперимента.

7. Количества и размер метастаз

ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени метастазами разрешено расти должна быть определена для каждой линии клеток и мыши штамма, и будет зависеть от количества клеток вводили.

1. Эвтаназия мышей в соответствии со стандартными институциональными руководящими принципами.
2. Изолировать и удалить легкие из каждой мыши и промыть в 1x PBS, чтобы удалить избыток крови.
3. Аккуратно разделите легкие на доли.
4. Приобретайте изображения метастазов sGreen в доле в 10x в ярком поле и флуоресценции с помощью флуоресцентного стереоскопа с широкодиапазонным фильтром GFP (возбуждение 470/40x).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте одинаковое увеличение и яркость для всех образцов. Используемое увеличение может варьироваться в зависимости от размера, количества и яркости метастаз, а также поля зрения для используемого микроскопа.
5. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки размера и количества метастазизмов изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для анализа изображений зависит от программного обеспечения и может быть оптимизирован с опухолями от step3. Кроме того, подсчитайте количество метастаз в каждом легком вручную с помощью флуоресцентного стереоскопа. Протокол может быть приостановлен здесь и шаг 8 может быть сделано в любой момент после того, как все изображения in vivo были собраны.

8. Обработка и анализ данных с изображений, полученных с помощью устройства визуализации живых животных in vivo

1. Откройте все файлы изображений для каждой мыши в программном обеспечении изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изображение с пиковым биолюминесцентным сигналом для анализа
2. Убедитесь, что единицы находятся в Radiance для биолюминесцентных данных и эффективности для флуоресцентных данных, нажав на стрелку в левом верхнем верхнем отоке изображения и изменив ее на соответствующую единицу.
3. Используйте изображение с последней точки времени для создания региона интереса (ROI) следующим образом.
   1. Нажмите ROI Tools в окне палитры инструментов. Вставьте одну рентабельность инвестиций, нажав на стрелку и выбрав 1.
   2. Нажмите на границу рентабельности инвестиций и переместите ее через грудь мыши. Отрегулируйте размер рентабельности инвестиций таким образом, чтобы она покрывала грудь мыши и не исключала сигнал.
4. Нажмите измерить ROIs и скопировать или введите сырой номер в лист Excel.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для биолюминесцентных данных выберите общий поток (фотоны в секунду), который является суммой всего сияния в рентабельности инвестиций. Поскольку метастаза не обязательно растут равномерно, общий поток предпочтительнее среднего сияния, поскольку он измеряет сумму метастатического бремени. Аналогичным образом, для флуоресцентных данных вместо средней эффективности следует использовать % общей эффективности (свет выбросов (фотон/второй)/возбуждательный свет (фотоны/секунда)..
5. Нажмите в файле изображения, чтобы скопировать рентабельность инвестиций, используемых в шаге 8.3, и вставить ее в каждый файл изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При количественной оценке флуоресцентных изображений, количественно той же области на мыши, которая была изображена без метастаз. Используйте этот сигнал в качестве фонового сигнала и вычесть его из каждого флуоресцентного метастазя, содержащего изображение мыши приобрел.
6. Перемещение вставки ROIs над той же областью, выбранной в шаге 8.3.4 для каждого изображения и повторите шаг 8.4.
7. Участок и анализ необработанных данных следующим образом (см. Дополнительную таблицу 2).
   1. Сделайте преобразование_{журнала 10} необработанных данных для каждой мыши с помощью указанной формулы(Дополнительная таблица 2)и участок, как на рисунке 2D и рисунок 4F. Преобразование журнала₁₀ линейно линейно кривой роста, которая имеет тенденцию быть геометрической и сводит к минимуму гетероскедастичность.
   2. Используя линейную регрессию, вычислите наклон установленной линии в журнал₁₀ преобразованных данных для каждой мыши, начертанных в шаге 8.7.1(Дополнительная таблица 2). Обратитесь к формуле в дополнительной таблице 2, чтобы соответствовать линии и рассчитать наклон в один шаг.
   3. Участок численные значения склонов, как на рисунке 2E и Рисунок 4G. Для определения статистической значимости используйте T-test или one-way ANOVA (более 2 групп).

Чтобы продемонстрировать вышеподход, мы выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором критический фактор репликации, RPA3 был сбит в метастатической линии клеток карциномы мыши (4T122). В то время как протокол описывает маркировку клеток как люциферазы и флуоресцентные белки до генетических манипуляций, мы использовали модифицированный подход, потому что векторы РНК также доставить SGreen (Рисунок 2A). Во-первых, 4T1 клетки были застеждены с лентивирусной конструкции кодирования светлячковой люциферазы и гигромицин сопротивление (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro). После выбора гигромицина, luciferase асссе был выполнен для подтверждения стабильной экспрессии светлячка luciferase (Рисунок 2A). Далее, 4T1-Luciferase клетки были застойно трансцированных с ретровирусными вектором, которые выражают sGreen и либо контроль miR30 основе shRNA, или miR30 основе shRNA ранее показано эффективно целевой мыши RPA316,23,24. Клетки затем вводили в мышей через боковую хвостовую вену и in vivo биолюминесцентный сигнал измерялся два раза в неделю для мониторинга метастатического бремени(рисунок 2B,C). Твёрлетный сигнал10 для каждой мыши был построен как метастатическое бремя с течением времени(рисунок 2D)и были определены склоны каждого участка(рисунок 2E). Эти данные показывают, что скорость изменения метастатического бремени значительно снижается с RPA3 нокдаун по сравнению с контрольными ячейками. Хотя различия поразительны, эти данные сами по себе не позволяют нам определить, является ли уменьшенное метастатическое бремя результатом менее метастазных или из-за замедления роста метастаз. Таким образом, метастаза с маркировкой SGreen в легких также были проанализированы в конце эксперимента. Мыши, введенные клетками RPA3, почти не имели метастазов в легких, в то время как у контрольных мышей было многочисленнgp больших метастазов(рисунок 3). Кроме того, метастаза, которые действительно образуются из rpA3 нокдаун клетки были явно меньше, чем контроль 4T1 метастаза(Рисунок 3A). В соответствии с нашими ручными подсчетами(рисунок 3B), программное обеспечение для анализа изображений насчитало значительно меньше метастазов в мышах RPA3 нокдауна(рисунок 3C). Кроме того, общая метастатическая нагрузка в легких (сумма областей каждого метастаза в миллиметрах) также была резко снижена на RPA3 нокдаун(рисунок 3D). Наконец, размер отдельных метастазов, которые образуются в RPA3 нокдаун мышей, как правило, гораздо меньше, чем в контроль ных мышей (Рисунок 3E). В дополнение к большим метастазам в контрольных мышей, мы наблюдали многочисленные небольшие метастазы, а также, но не может определить, если это опухолевые клетки, которые посеяли легкие и не растут, или если они опухолевые клетки пролить от одного из больших метастазов, которые повторно семеналегкие легкие в новом месте (Рисунок 3E). В совокупности эти данные показывают, что RPA3 необходим для образования метастазизов ячейками 4T1. Эти выводы были ожидаемы, потому что наша предыдущая работа показала, что RPA3 сбить клетки значительно снизили способность к формированию метастазов в легких после инъекции хвостовойвены 16. Тем не менее, этот эксперимент демонстрирует, как использование живой изображения животных и флуоресцентная количества метастазов и размер может быть использован, чтобы определить, если изменения в метастатическом бремени связаны с различиями в метастатической колонизации или роста.

Чтобы продемонстрировать, как этот подход может быть использован для ответа на более биологически актуальный вопрос, мы спросили, необходимы ли YAP и ТАЗ для метастатической колонизации и последующего роста в этой сингенной модели рака молочной железы. Выражение и активность YAP или ТАЗ увеличиваются во многих видах рака по сравнению с нормальной ткани, и это прогнозирование плохой исход пациента25,26,27,28,29. Кроме того, несколько исследований были вовлечены YAP, ТАЗ, или TEADs, критические YAP / ТАЗ-обязательных партнеров, в метастазах15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Учитывая эти данные, мы использовали наш подход для проверки, необходимы ли для формирования и роста метастазов YAP и ТАЗ. Для этого мы используем ретровирусный вектор, выражающий тандем miR30 на основе shRNA, нацеленный как на YAP, так и на ТАЗ. Как показано на рисунке, этот тандем shRNA эффективно снижает экспрессию и транскрипцию белка YAP и ТАЗ в 4T1 клетках(Рисунок 4A,B). 4T1-Luciferase клетки были stably transduced с zsGreen-выражая версией этого тандема YAP/TA' shRNA вектор или контроль miR30 основе shRNA (Рисунок 4C), а затем проверяли хвоственных инъекций вены в сингенных BALB/c мышей. Как показано на рисунке 4, скорость, с которой метастатическое бремя увеличилось было значительно быстрее у мышей, вводили с контрольными клетками по сравнению с мышами, введенными с яп/ ТАЗ нокдаун клетки (Рисунок 4D-F). Значительно меньше метастазов, образуются у мышей, введенных с яп. Мало того, что многие другие метастазы образуются в контроль ных мышей, но они, как правило, больше (Рисунок 5E). Последовательно, метастатическое бремя в легких (общая зона метастазов в мм) также резко сократилась на YAP / ТАЗ нокдаун(Рисунок 5D). Важно отметить, что, когда метастаза большие и близко друг к другу, программное обеспечение может быть не в состоянии дифференцировать различные метастаза. Это было в случае нескольких метастазов в контроль мышей (мышь 3 и мышь 7). Таким образом, важно проверить выход программного обеспечения для анализа изображений, чтобы убедиться, что он точно измеряет площадь отдельных опухолей. Именно поэтому важно оптимизировать количество впрыскиваемых клеток и продолжительность эксперимента. В совокупности эти данные показывают, что YAP и ТАЗ необходимы для поддержания темпов, с которыми метастатическое бремя увеличивается в сингенной модели мурина метастатического рака молочной железы, и что это связано с неспособностью метастазов формировать и уменьшить рост немногих метастазов, которые сформировались.

Рисунок 1: Схема протокола. Все необходимые вирусы сначала упакованы в клетки HEK-293FT. Нужные клетки для исследования затем одновременно инфицированы люциферазы и флуоресцентные вирусы, которые каждый выразить уникальный ген отбора млекопитающих наркотиков. Инфицированные клетки затем расширяются в соответствующих носителях, содержащих оба препарата, чтобы выбрать для стерлимо трансдуцированных клеток, выражающих как люциферазу, так и флуоресцентный белок. Выражение обеих меток подтверждается, как описано в протоколе. Помеченные клетки затем трансоксидируются третьим вирусом, содержащим генетические манипуляции (miR30 shRNA) и третьим уникальным геном отбора лекарств. После отбора с третьим препаратом, клетки вводят сява в мышей через боковую хвостовую вену. Метастатическая нагрузка контролируется у мышей на протяжении всего эксперимента с помощью системы визуализации живых животных in vivo. В конце эксперимента мышей усыпляется, а изображения целых легких делаются с помощью флуоресцентного рассекающего микроскопа, а затем используются для измерения количества и размера метастазов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Luciferase основе in vivo живой изображения животных показывает, что RPA3 нокдаун снижает метастатическое бремя рака молочной железы. (A) Схема, показывающая, как клетки были созданы для этого исследования in vivo. 4T1 клетки были стерли транскорпоранство с лентивирусной кодирования люциферазы и гигромицин сопротивление. Инфицированные клетки были выбраны с 600 мкг/мл гигромицина В в течение одной недели, а затем активность люциферазы была измерена в родительских или 4T1-люциферазы клеток с помощью luciferase репортер комплект и пластины читателя (n - 1 эксперимент с репликацией скважин усредненных). 4T1-Luciferase клетки были затем инфицированы ретровирусом, которые доставляют sGreen и miR30 shRNAs ориентации либо mCherry (контроль) или mRPA3. Выбор пуромицина (2,5 мкг/мл) в течение 3 дней использовался для выбора для стабильной интеграции вируса. (B-E) 4T1-люциферазы клетки усто и контроля (sh-mCherry) или mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs были введены в мышей и изображения для биолюминесценции на указанные дни, как описано в протоколе. (B и C) Биолюминесцентные изображения для репрезентативной мыши каждой группы в указанный день после инъекции (D) Участок журнала10 преобразованлю сигнала люциферазы измеряется для каждой мыши в ходе эксперимента. (E) Рассеянный участок со средним (твердая линия) для склонов каждой мыши в D (n No 6 для ш-контроля и 8 для ш-mRPA3-431). Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; ПР 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Количественная оценка флуоресцентных метастазов показывает, что RPA3 нокдаун предотвращает метастатическую колонизацию и последующий рост раковых клеток молочной железы. (A) Флуоресцентные (слева) и яркие (справа) изображения представительных долей из каждой мыши, впрыснутые на рисунке 2 через 21 день после инъекции. Звездочки (яп. ) указали зеленые автофлуоресцентные бронхи. (C-E) Программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблица материалов)использовалось для идентификации и измерения объектов с использованием порога интенсивности от 25 до 100 и порога размера 0,01 мм2 до бесконечности. (B и C) Рассеянный участок со средним (твердый бар) от общего количества метастаз в легких каждой мыши при подсчете (B) по программному обеспечению анализа изображений (C). (D) Общая площадь (мм) легких, которая была измерена с помощью программного обеспечения анализа изображений построен как метастатическое бремя со средним, указанным твердой бар. (E) Размер каждого метастаза построен для каждой мыши. Контроль мышей показаны синие точки и mRPA3 нокдаун мышей красными точками. Обратите внимание, что панель масштаба разделена на 1 мм, чтобы было легче визуализировать размер и количество небольших метастаз (n No 6 sh-контроль, 8 sh-mRPA3-431). Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; стр. 0,06; Р 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: ЯП/ ТаЗ нокдаун снижает метастатическое бремя рака молочной железы. (A и B) 4T1 клетки, устойчиво выражающие miR30 основе контроля (mCherry) или тандем YAP / ТаЗ shRNAs (sh-mYAP1/mTA6) были проанализированы западного анализа поблучки (A) или транс заражены YAP / ТАЗ-TEAD luciferase репортер астративные конструкции и ассес для YAP / ТАЗ-TEAD транскрипционной деятельности, как описано ранее15,16 (B) (n No 5 для контроля и 4 для YAP1/TA6). (C) Схема, показывающая, как клетки были созданы для исследования in vivo. 4T1-Luciferase клетки были инфицированы ретровирусами, которые поставляют sGreen и либо miR30 shRNA ориентации mCherry (контроль) или тандем miR30 shRNAs ориентации как mYAP и mTA. Инфицированные клетки были выбраны в Пуромицин (2,5 мкг/мл) в течение 3 дней. 4T1-люциферазы клетки устоичительно выражая sGreen и контроль (sh-mCherry) или YAP/TA '(sh-mYAP1/mTA1) shRNAs затем были введены в мышей и изображения для биолюминесценции на вводили дней. (D и E) Биолюминесцентные изображения для репрезентативной мыши каждой группы в указанный день после инъекции. (F) Участок журнала10 преобразованный сигнал люциферазы измеряется для каждой мыши в ходе эксперимента. (G) Рассеянный участок со средним (твердый бар) для склонов каждой мыши в F (n No 7 для ш-контроля и 8 для ш-mRPA3-431). Среднее указывается сплошной линией. Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; стр. 0,06; Вопрос, р 0,01; ***. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: YAP и ТАЗ необходимы для метастатических раковых клеток молочной железы для колонизации легких. (A) Флуоресцентные (слева) и яркие (справа) изображения представительных долей из каждой мыши, впрыснутые на рисунке 4 21 дней после инъекции. (C-E) Изображения были обработаны с помощью программного обеспечения для анализа изображений, как описано на рисунке 3. (B и C) Рассеянный участок со средним (твердый бар) от общего количества метастаз в легких каждой мыши при подсчете вручную (B) или программного обеспечения для анализа изображений (C). (D) Общая площадь всех метастазах (мм) была измерена с помощью программного обеспечения для анализа изображений и построена как метастатическое бремя со средним (твердая планка). (E) Размер каждого метастаза построен для каждой мыши. Контроль мышей показаны синие точки и ш-mYAP1/mTA6 нокдаун мышей красными точками. Обратите внимание, что панель масштаба разделена на 1 мм, чтобы лучше визуализировать размер и количество небольших метастазов (n no 7 sh-контроль, 8 ш-mYA1/mTA6). Среднее указывается сплошной линией. Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; . 0,05, п.п., 0,01 евро; **. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Таблица векторов. Перечислены все используемые векторы и описаны новые векторы. Стандартные методы молекулярной биологии были использованы для клонирования новых векторов и последовательностей для недавно описанных 97-мер shRNA включены. Цитаты относятся к: «1»53, No 2 »16, No354Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Пример обработки и анализа данных изображений изображений живых животных in vivo. Таблица, демонстрирующая, как необработанные данные из изображений живых животных in vivo преобразуются для анализа, как описано в шагах 6.7 и 6.8. Необработанные данные, полученные из изображения живых животных in vivo, трансформировались с помощью преобразования журнала10. Скорость изменения метастатического груза рассчитывается для каждой мыши путем расчета наклона, генерируемого преобразованными данными журнала10. Примеры включают анализ люциферазы с рисунка 2. Столбцы закодированы цветом, чтобы указать, какие данные использовались для генерации значения каждого наклона, а формулы встраиваются в электронную таблицу. Двойное нажатие на скважину покажет формулу, используемую для обработки данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Авторам нечего раскрывать.