Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг и идентификация РНК Silencing супрессоров от секретных эффектов растительных патогенов

6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60697

⸱

3 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Laboratory of Plant Molecular Sciences, College of Life Sciences, Shanghai Normal University, 2College of Agriculture, Yangtze University, 3Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем модифицированный метод скрининга, который может быть широко использован для быстрого скрининга РНК глушителей в растительных патогенных микроорганизмов.

Аннотация

РНК-глушитель является эволюционно сохраненным, последовательность конкретных механизмой регулировки генов в эукариотах. Несколько возбудителей растений развивались белки с возможностью ингибировать хозяина завода РНК глушитель пути. В отличие от белков вирус-эффектора, только несколько выделяемых белков-эффекторов показали способность подавлять заглушения РНК в бактериальных, омицете и грибковых патогенах, а молекулярные функции большинства эффекторов остаются в значительной степени неизвестными. Здесь мы подробно описываем слегка измененную версию соинфинигционного анализа, который может служить общим методом наблюдения заглушинием РНК и для характеристики белков-эффекторов, выделяемых растительными патогенами. Ключевыми шагами подхода являются выбор здоровых и полностью разработанных листьев, адаптация культуры бактерий к соответствующей оптической плотности (OD) на уровне 600 нм, а также наблюдение за флуоресценцией зеленого флуоресцентного белка (GFP) в оптимальное время на проникнув листья, чтобы избежать опущения эффекторов со слабой активностью подавления. Этот улучшенный протокол будет способствовать быстрому, точному и обширному скринингу супрессоров ЗАглушения РНК и служить отличной отправной точкой для исследования молекулярных функций этих белков.

Введение

За последние два десятилетия ускорение секвенирования генома микроорганизмов, вызывающих заболевания растений, привело к постоянному увеличению разрыва в знаниях между информацией о последовательности и биологическими функциями закодированных белков1. Среди молекул, выявленных секвенированием проектов являются молекулы-эффекторы, которые подавляют врожденный иммунитет и способствуют колонизации хозяина; эти факторы выделяются разрушительными возбудителями растений, включая бактерии, нематоды и нитевидные микробы. Чтобы ответить на эти угрозы, принимающие растения развили новые рецепторы, которые распознают эти эффекторы, что позволяет восстановить иммунный ответ. Таким образом, эффекторы подвергаются различным селективным давлениям, что приводит к диверсификации репертуаров эффекторов среди патогенных линий2. В последние годы, предполагается, эффекторы из растительных патогенов было показано, нарушить растительный врожденный иммунитет, препятствуя принимающей клеточных процессов в интересах микробов в различных отношениях, в том числе дисрегуляции сигнальных путей, транскрипции, внутриклеточного транспорта, цитоскелет стабильности, везикулы торговли, и РНК улащивания3,4. Однако подавляющее большинство патогенных эффекторов, особенно от нитевидных патогенных микроорганизмов, остаются загадочными.

РНК глушитель является гомология-опосредованного гена инактивации механизма, который сохраняется среди эукариот. Этот процесс срабатывает длинной двухцепочечной РНК (dsRNA) и нацелен на гомологичную одноцепочечную РНК (ssRNA) в последовательности-специфической манере, и он манипулирует широким спектром биологических процессов, включая противовирусную защиту6. Чтобы преодолеть врожденные иммунные реакции хозяина, некоторые вирусы эволюционировали, чтобы компенсировать замалчивание РНК, в том числе способность размножаться внутри внутриклеточных отсеков или вырваться из глушителя реорганизованного сигнала. Тем не менее, наиболее общая стратегия, с помощью которой вирусы защищают свои геномы от РНК глушитель-зависимой потери генной функции является кодирование конкретных белков, которые подавляют РНК глушитель7,8. Несколько механически различных подходов были созданы для скрининга и характеристики вирусных супрессоров РНК глушитель (VSRs), в том числе совместное проникновение агробактерии tumefaciens культур, трансгенных растений, выражающих побудители, прививки и клеточной культуры9,10,11,12,13.

Каждый из этих анализов имеет преимущества и недостатки, и определяет VSRs по-своему. Один из наиболее распространенных подходов основан на совместной инфильтрации отдельных культур A. tmuefaciens укрывательство потенциального вирусного белка и репортер гена (обычно зеленый флуоресцентный белок (GFP) на Nicotiana benthamiana 16c растений, составляющих GFP под контролем мозаичного вируса цветной капусты 35S промоутер. При отсутствии активного вирусного глушителя суитоля, GFP определяется как экзогенный клетками хозяина и заглушается в течение 3 дней после инфильтрации (dpi). В отличие от этого, если вирусный белок обладает активностью подавления, уровень экспрессии GFP остается стабильным за 3'9 dpi9. Это совместное проникновение анализ прост и быстр; однако она не является ни высокой стабильной, ни чувствительной. Тем не менее, анализ выявил многочисленные VSRs с различными последовательностями и структурами белка во многих РНК-вирусах7,8.

В последнее время несколько эффектор белков, которые могут ингибировать клеточной РНК глушитель деятельности были охарактеризованы от бактериальных, oomycete, и грибковых патогенов растений14,15,16. Эти выводы подразумевают, что подавление РНК-заглушения является общей стратегией для облегчения инфекции, которая используется патогенами в большинстве королевств. Теоретически, многие, если не все, из эффекторов могут кодировать РНК глушитель супрессоров (RSSs); однако на сегодняшний день было выявлено лишь несколько из них, главным образом из-за отсутствия надежной и общей стратегии скрининга. Кроме того, супрессоры заглушения РНК не были исследованы в подавляющем большинстве возбудителей растений17.

В этом отчете мы представляем оптимизированный и общий протокол для выявления эффекторов патогенных патогенов растений, которые могут подавлять локальную и системную РНК-глушитель с помощью агроинфильтрационного асссса. Главной целью этого исследования было подчеркнуть ключевые аспекты протокола и подробно описать шаги, тем самым предоставив скрининговый анализ, который подходит почти для всех эффекторов растительных патогенов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы процедуры должны проводиться при комнатной температуре (RT).

ВНИМАНИЕ: Депозит всех средств, содержащих патогенные микробы, а также растений и растительных тканей, используемых в анализе, в соответствующие контейнеры отходов и автоклав перед отказом.

1. Подготовка плазмидных конструкций, содержащих ориентировочные эффекты

  1. Выберите прогнозные секретированные эффекторы, которые высоко выражены во время инфекции, как это определено секвенированием РНК (РНК-Сек), а далее по количественному реальному времени пЦР (qRT-PCR) метод.
  2. Определите место расщепления пептида сигнала каждого эффектора с помощью программного средства, такого как SignalP18.
  3. Дизайн праймеров и выполнять ПЦР для усиления гена кодирования эффектор интереса с использованием высокой точности ДНК полимераза. Выполните агарозный гель электрофорез, чтобы проверить продукт ПЦР, а затем клонировать ампликон в вектор входа шлюза p'BV3 с помощью комплекта клонирования без перевязок(Таблица материалов), а затем в направлении выражения вектора pEG100 с помощью реакции рекомбинации LR19.
  4. Преобразуйте 3-5 л реакционных смесей LR в 100 л компетентных клеток кишечной палочки (например, TOP10, DH5), распространяйте преобразованные бактериальные клетки на агар-среде Лурия-Бертани (LB), дополненной 50 мкг/мл канамицином, и инкубировать при 37 градусах по Цельсию для 16–20 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные трансформаторы могут быть определены колонии PCR20 и далее проанализированы плазмид минипреп и секвенирования.
  5. Ввести 50-100 нг рекомбинантных плазмидов, несущих протеин эффектора, в 100 л химически компетентных клеток A. tumefaciens (например, GV3101 или C58C1), аккуратно перемешайте, а затем заморозьте в жидком азоте на 1 мин. Оттепель клетки в воде 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
  6. Добавьте 500 кЛ бульона LB и инкубировать при 30 градусах По цельсии в течение 4-6 ч с нежной тряской, а затем переложить и распространить все клетки агробактерий на среде агара LB, дополненной 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицин омчицин омовой в течение 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные клоны могут быть проверены колонии PCR.
  7. Используйте одну преобразованную колонию для агроинфильтрационных экспериментов, если иное не направлено.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании, ни один из проверенных генов эффектора, содержащихся предсказал интроны; каждый из генов был непосредственно усилен из геномной ДНК изолята Phytophthora sojae. Вектор экспрессии растения Gateway без каких-либо тегов рекомендуется, но не обязательно.

2. Подготовка растений Н. Бентамиана 16c

  1. Приготовьте смеси почвы для заливки, состоящие (по объему) 50% торфяного мха, 30% перлита и 20% вермикулита, а также автоклав при 120 градусах По Цельсию в течение 20 мин.
  2. Замочите автоклавированные смеси почвы с раствором растительных удобрений (1 г/л) и упакуйте их в более мелкие горшки (80 мм x 80 мм x 75 мм), хранящиеся в более крупном лотке (540 мм x 285 мм x 60 мм).
  3. Посеять один или два семена N. benthamiana 16c на поверхность почвы каждого горшка. Накройте лоток пластиковым куполом и дайте семенам прорасти.
  4. Поместите лоток под светлые и температурно-контролируемые камеры роста с температурой 23-25 градусов по Цельсию, 50-60% относительной влажности, и долгосрочный фотопериод (14 ч свет/10 ч темный, с освещением на 130-150йE'm -2s-1).
  5. Снимите пластиковый купол после прорастания семян (3–4 дня) и дайте саженцы расти в тех же условиях, которые используются для прорастания шага.
  6. Добавьте соответствующее количество воды, сохраняя влажную почву, но не замачивая, каждые 2–3 дня; добавлять удобрения каждые 10 дней, чтобы способствовать дальнейшему росту. Поддерживать растения N. benthamiana 16c в нормальных условиях до тех пор, пока они не будут готовы к использованию; на этом этапе растение должно иметь не менее пяти полностью разработанных истинных листьев и отсутствие видимых подмышечных или цветочных почек, а листья должны иметь здоровый зеленый вид).
  7. Используйте 3-4 недельные листья N. benthamiana 16c для местных анализов замалчивания РНК, а молодые растения N. benthamiana 16c (10–14 дней) для системных анализов замалчивания РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия роста растений и объекты варьируются в разных лабораториях; выбрать здоровые, хорошо развитые и полностью расширенные листья для инфильтрации.

3. Подготовка агробактерии культуры для инфильтрации

  1. Выберите положительную колонию из пластины LB и привить клетки в стеклянную трубку, содержащую 5 мл среды LB дополнен50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицин. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин при 24-48 ч.
  2. Передача 100 мл культуры в 5 мл среды LB дополнены теми же антибиотиками, 10 мМ 2-(N-морфолино) этанесульфоновой кислоты (MES; pH 5.6) и 20 мкм ацетосирингона (АС). Выращивайте бактерии при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин при 16–20 ч.
  3. Клетки центрифуги при 4000 х г в течение 10 мин. Налейте супернатант и отдохните гранулы в 2 мл 10 мм mgCl2 буфера.
  4. Повторите шаг 3.3 для обеспечения полного удаления антибиотиков.
  5. Определить плотность агробактерии культуры путем измерения оптической плотности на 600 нм (OD600). Отрегулируйте к OD600 из 1.5'2.0 с буфером 10 mM MgCl2.
  6. Добавьте 10 мМ МЧС (pH 5.6) и 150 мкм AS к конечным культурам подвески и инкубировать клетки на RT, по крайней мере 3 ч без тряски.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте окончательные культуры подвески на ночь.

4. Со-инфильтрация Н. Бентамиана листья

  1. Смешайте равные объемы агробактерии культуры, содержащей 35S-GFP с культурой агробактерий, содержащей 35S- огуречной мозаики вирус супрессор 2b (CMV2b), ориентировоченный эффектор, или пустой вектор (EV).
  2. Тщательно и медленно проникают смешанные суспензии агробактерий на абсаксиальных сторонах листьев N. benthamiana 16c с использованием шприца без иглы 1 мл.
  3. Удалите оставшуюся бактериальную подвеску из листьев с помощью стеклоочистителей мягких тканей и обведите поля проникших патчей пером.
  4. Оставьте проникнутые растения в камеру роста при тех же условиях роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям безопасности и здоровья, защитные очки для глаз и маска должны носить во время инфильтрации. Для предотвращения перекрестного загрязнения перчатки следует менять или стерилизовать с помощью этанола между инфильтрациями. Обычно для проникновения требуется не менее 1 мл агробактерии на лист. Для системного замалчивания, по крайней мере два листа будут необходимы для проникновения.

5. Анализ изображений GFP

  1. Визуально обнаружить флуоресценцию GFP в недавно выращенных листьях целых растений 2 недели после инфильтрации (для системного замалчивания РНК) или проникнутые участки листьев 3'4 dpi с помощью длинноволновой ультрафиолетовой (УФ) лампы без сбора листьев.
  2. Фотография собранных растений и/или отдельных листьев с цифровой камерой, оснащенной как ультрафиолетовыми, так и желтыми фильтрами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализов местных заглушая подавления, исследовать проникли патчи N. benthamiana 16c листья, в то время как для системного замалчивания подавления деятельности, исследовать вновь выращенные листья. Активность подавления РНК может варьироваться в зависимости от отдельных эффекторов. Таким образом, наблюдать патчи или листья в течение нескольких дней, начиная с 3 dpi. Используйте CMV2b и EV в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно.

6. Северный анализ помот gFP мРНК в проникнутых листьях

  1. Изоляция общей РНК от листовой ткани с помощью реагента изоляции РНК(Таблица материалов)
    1. Соберите ткани листьев из проникнутых N. benthamiana 16c патчи на 4'7 dpi, распылить в жидком азоте в мелкий порошок, и передать порошок в стерильной 2 мл трубки.
    2. Добавить РНК изоляционных реагента (1 мл/ 100 мг ткани) сразу же в пробы трубки в капюшоне, встряхнуть энергично гомогената, и инкубировать на RT в течение 5 мин.
    3. Добавьте хлороформ (200 л/1 мл РНК изоляционный реагент) к каждой трубке в капюшоне, энергично встряхните в течение 15 с, и инкубировать на RT в течение 5 мин. Центрифуге гоменат при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусах по Цельсию.
    4. Перенесите супернатант в новую трубку без RNase и отбросьте гранулы. Добавьте 0,7 тома изопропанола в супернатант, аккуратно инвертировать несколько раз, и инкубировать смесь на RT в течение 10 минут.
    5. Осажгите гранулы РНК центрифугированием при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
    6. Откажитесь от супернатанта, промойте гранулы 70% этанола и высушите гранулы в капоте. Растворите РНК в диэтил-пирокарбонат (DEPC) - обработать водой, инкубируя в водяной бане 65 градусов по Цельсию в течение 10-20 минут.
  2. Северный анализ помот GFP мРНК в проникнутых листьях
    1. Подготовка 1,2% формальдегида денатурирование агарозный гель в 1x MOPS работает буфер.
    2. Смешайте РНК 1:1 с РНК-погрузочным красищем и денатурацияю путем инкубации при уровне 65 градусов по Цельсию в течение 10 мин, немедленно охладите денатурированные образцы на льду в течение 1 мин.
    3. Загрузите образцы на гель и электрофорез на 100 В в течение 50 минут, пока РНК хорошо разделена.
    4. Промыть гель в 20x солевой цитрат натрия (SSC) буфер для удаления формальдегида и передачи геля на нейлоновую мембрану капиллярной передачи в 20x SSC буфера в одночасье. Замочите мембрану в 2x SSC и исправить РНК в мембрану, подвергая мокрой мембраны для УФ-кросс связи.
    5. Добавьте соответствующее количество буфера гибридизации (10 мл на 100 см2 мембраны; Таблица материалов) в трубке гибридизации и агитировать при температуре 60 градусов по Цельсию в духовке гибридизации.
    6. Положите мембрану в трубку гибридизации и инкубировать в течение 60 мин при 60 градусах Цельсия. Разбавить 5'DIG-маркированный зонд ДНК (окончательная концентрация, 50 нг/мл) в раствор гибридизации, содержащий преднагреваемый буфер гибридизации.
    7. Откажитесь от буфера предгибридизации и немедленно замените раствором гибридизации, содержащим зонд с маркировкой DIG. Инкубировать пятно с зондом при 60 градусах Цельсия на ночь, с нежным возбуждением.
    8. После гибридизации, мыть мембрану дважды в буферах увеличения строгости на 60 градусов по Цельсию в течение 20 минут каждый. Аккуратно протрите мембрану, чтобы удалить дополнительный буфер для мытья и добавить реагенты, как это предлагается в химилюминесцентной гибридизации и обнаружения комплекта (Таблица материалов).
    9. Обнаружение гибридизированных сигналов с помощью хемилюминесцентной реакции в сочетании с системой визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выше мы описываем пошаговую процедуру для улучшения скринингового обследования для оценки активности RSS P. sojae RxLR. В общей сложности эксперимент занимает от 5 до 6 недель. Впоследствии, RSSs определены анализ может быть дополнительно характеризуется с точки зрения функции и молекулярного механизма. В качестве примера нашего подхода, мы использовали P. sojae RxLR effecto Phytophthora супрессор РНК глушитель 1 (PSR1), который выделяется и поставляется в клетки-хозяина...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

РНК глушитель является ключевым защитным механизмом, используемым растениями для борьбы с вирусными, бактериальными, омицетами и грибковыми патогенами. В свою очередь, эти микробы эволюционировали глушитель белков супрессора для противодействия противовирусным глушителям, и эти RSS вмешиваться в различные шаги РНК глушитель путь22,23. Несколько скрининговых анализов были разработаны для выявления RSSs10.

Здесь м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от "Шугуан программы" Шанхайского фонда развития образования и Шанхайской комиссии муниципального образования, Национальной ключевой программы исследований и разработок Китайской национальной ключевой программы НИОКР Китая ( 2018YFD0201500), Национальный фонд естественных наук Китая (No 31571696 и 31660510), Программа «Тысячи талантов» для молодых специалистов Китая и Комиссия по науке и технике муниципалитета Шанхая (18D-2260500).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Морфолиноэтансульфоновая кислота (MES)Biofroxx1086GR500Буфер
2xTaq Master MixVazyme BiotechP112-AAPCR
3-(N-морфолино) пропансульфоновая кислота (MOPS)Amresco0264C507-1KGMOPS Буфер
ацетосирингон (AS)Sigma-AldrichD134406-5GИндукция агробактерий
агарSigma-AldrichA1296-1KGLB средний
AgaroseBiofroxx1110GR100Электрофорез
Amersham Hybond -N+GE HealthcareRPN303 BNothern blot
Amersham ImagerGE HealthcareAmersham Imager 600Image
Bacto TryptoneBD Biosciences211705LB средний
Bacto Дрожжевая экстракцияBD Biosciences212750LB средняя
фотокамераNikonD5100Фотосистема
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad
Модуль хемилюминесцентного детектирования компонент наборов dafaThermo Fisher Scientific89880Обнаружение люминесценции
ХлорамфениколAmresco0230-100GАнтибиотики
ClonExpress II One Step Cloning KitVazyme BiotechC112-01Ligation
DIG Easy HybSigma-Aldrich11603558001Гибридизационный буфер
Easypure Plasmid Miniprep kitTransGen BiotechEM101-02Плазмидная экстракция
EasyPure Quick Gel Extraction KitTransGen BiotechEG101-02Гелевая экстракция
ЭДТА дигидрат динатриевой солиAmresco/VWR0105-1KGMOPS Буферный
электрофорез Источник питанияLiuYiDYY6DЭлектрофорез нуклеиновых кислот.
FastDigest EcoRVThermo Fisher ScientificFD0304Векторное разложение
Гель Система визуализацииТанонТанон3500Изображение
ГентамицинАмреско0304-5GАнтибиотики
Канамицина сульфатСигма-ОлдричK1914Антибиотики
LR Фермент клоназа IIИнвитроген11791020LR реакция
Нитроцеллюлоза Блоттинг мембрана 0,45 мкмGE Здравоохранение10600002Northern
NORTH2south набор для мечения биотина случайного прайма ДНК ThermoFisher Scientific17075Маркировка биотина
ПЦР Термические амплификаторыBio-RadT100ПЦР
Торфяной мохPINDSTRUPТемное золото + глинарастения
Peters Водорастворимое удобрениеICEPeter Professional 20-20-20Удобрение
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazyme BiotechP505-d1Фермент
рифампицинMP Биомедицинские 219549005антибиотики
РНК Гель Загружающий краситель (2X)Thermo Fisher ScientificR0641РНК Гель Загружающий краситель
Ацетата натрияГидрат Amresco/VWR0530-1KGMOPS Буфер
Хлорид натрияAmresco0241-10KGLB среда
Три-цитрат натрияAmresco0101-1KGSSC Буфер
Реагент ТризолИнвитроген15596018РНК изолирующий реагент
УФ-лампаАналитик JenaUVP B-100APObservation
UVP Hybrilinker ПечьAnalytikJena OV2000Northern

Ссылки

  1. Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
  2. Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
  3. Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
  4. Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
  5. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
  6. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
  7. Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
  8. Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
  9. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
  10. Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
  11. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
  12. Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
  13. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  14. Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
  15. Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
  16. Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
  17. Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
  18. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
  19. Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
  20. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
  21. Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
  22. Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
  23. Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
  24. Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GFPAgrobacteriumNicotiana benthamiana
Скрининг и идентификация РНК Silencing супрессоров от секретных эффектов растительных патогенов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.