Method Article

Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пренилирование является важной модификацией периферических мембранных связывающих белков. Клетки насекомых можно манипулировать для производства фарнезилатных и carboxymethylated KRAS4b в количествах, которые позволяют биофизические измерения белково-белковых и белково-липидных взаимодействий

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пренилация белка является ключевой модификацией, которая отвечает за таргетинг белков на внутриклеточные мембраны. KRAS4b, который мутирует в 22% рака человека, обрабатывается фарнезиляции и карбоксиметилирования из-за присутствия 'CAAX' мотив коробки на C-термину. Инженерная система бакуловируса была использована для выражения фарнезилатовые и carboxymethylated KRAS4b в клетках насекомых и была описана ранее. Здесь мы описываем детальную, практическую очистку и биохимическую характеристику белка. В частности, для очищения белка до однородности использовались сродство и ионная обменная хроматография. Intact и родной масс-спектрометрии был использован для проверки правильной модификации KRAS4b и для проверки нуклеотидных связывания. Наконец, мембранная связь фарнезилатной и карбоксиметилового KRAS4b к липосоме была измерена с помощью поверхностной плазмонрезонансной спектроскопии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почтовые изменения играют ключевую роль в определении функциональной активности белков. Такие модификации, как фосфорилирование и гликозилирование, хорошо известны. Липидные модификации менее хорошо характеризуются, однако. Подсчитано, что до 0,5% всех клеточных белков могут быть пренилированными1. Prenylation является передача 15-углеродный фарнесил или 20-углеродный геранилгеранил липидной цепи принимает белок, содержащий мотив CAAX2. Пренилированные белки были вовлечены в прогрессирование нескольких заболеваний человека, включая преждевременное старение3, болезнь Альцгеймера4<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка белка

  1. Подготовьте буферы A-H, как видно из таблицы 1.
Решение буфераБуферный агент (все 20 мМ) рH NaCl (mM)имидазол (mM)MgCl2 TCEP
AГЕПЕС7.3300-51
B
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной из самых больших переменных в протоколе является количество выраженного целевого белка (His6-MBP-tev-KRAS4b). Этот протокол был разработан с использованием изолята от линии клеток Trichoplusia ni, Tni-FNL17, адаптированного для роста подвески и отлуженных от сыворотки. Учитывая широкий спектр результатов, зарегистрированных в различных линиях клеток насекомых с системой экспрессии бакуловируса, желательно, чтобы Tni-FNL использовался, по крайней мере на начальном этапе, для производ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как отмечается в разделе «Результаты представителей», наиболее важным шагом при очистке является обработка образца во время его пребывания в более низкой соли. Ограничение времени, в течение которого образец подвергается воздействию менее 200 мМ NaCl, поможет уменьшить количество осадков и увеличить урожайность выборки. Интерпретация результатов CEX может быть затруднена, если профиль не соответствует ожиданиям (см. рисунок 2). До тех пор, пока протокол не стал рутиной, рекомендуется, чтобы .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаем, клонирование и выражение поддержки от Карисса Гроуз, Джен Melhalko, и Мэтт Дрю в лаборатории экспрессии белка, Фредерик Национальной лаборатории по изучению рака. Этот проект был профинансирован в целом или частично за счет федеральных средств из Национального института рака, Национальные институты здравоохранения, в соответствии с контрактом No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,8 мл пробирки с безопасным замком, натуральныйEppendorf22363204
11 мм Cl SS Сблокированный вкладыш автоподатчикаThermo Scientific30211SS-1232
1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC)AVANTI ПОЛЯРНЫЕ ЛИПИДЫ 850457приобрести в виде жидких запасов в хлороформе
1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфо-L-серин (СОЗ)AVANTI ПОЛЯРНЫЕ ЛИПИДЫ840034купить в виде жидких запасов в хлороформе
5427R ЦентрифугаEppendorf
Ацетонитрил, ВЭЖХ GradeFisher ChemicalA998-1 1л
Ацетат аммонияSigma-Aldrich09689-250g
Газ аргонВоздухПробирная пластина ARUP
384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Ультразвуковая ваннаThermo Fisher15-336-1000
Катионообменная хроматография (CEX) колонкаGE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Планшетный ридерWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Масс-спектрометрThermo Scientific
Муравьиная кислотаSigma-AldrichF0507-500MlИспользуйте реагент класса или лучше
Флаконы Gilson 7x14 мм ПробиркиGE HealthcareBR-1002-12
Стеклянные флаконы с винтовой резьбой и вкладышамииз пенопласта ПТФЭНаучные специализацииB69302
Высокоскоростная/настольная центрифугаThermo Fischer Scientific05-112-114D, способная до 4 000 xg
протеазы вируса травления табака (TEV) His6Addgene92414Очищенная согласно Raran-Kurussi et al. (2017) Удаление аффинных меток с протеазой TEV. В: Берджесс-Браун Н. (ред.) Гетерологичная экспрессия генов в E.coli. Методы молекулярной биологии, том 1586. Humana Press, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк
Иммобилизованная металлическая аффинная хроматография (IMAC) колонкаGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Внутреннее водоснабжение, Arium AdvanceSartorius StedimУдельное сопротивление 18 MΩ 0-см
Набор липидных экструдеров с держателемAVANTI POLAR LIPIDS
Жидкий азотВоздушный газNI-DEWAR
M110-EH микрофлюидизаторMicrofluidics
MabPac RP UHPLC Колонна, 4 мкм, 3,0 x 50 ммThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Колонка, 5 мкм, 300 Å, 2,1 x 150 ммThermo Scientific088790
Программное обеспечение MagTranThermo Scientific
Метанол, ВЭЖХ классаVWR ХимикатыBDH20864.400
NGC Хроматографическая системаBioRad78880002NGC QuestTM 100 Хроматографическая система
Коктейль ингибитора протеазы без ЭДТА или других хелаторовMillipore SigmaP8849
Резиновые колпачки тип 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L1Спектрофотометр GE Healthcare29104993
Thermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace at 280 nm
Ultra-15 Центробежные фильтрующие блоки, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES мембрана
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 мл Центрифугафильтры AmiconUFC501024
УльтрацентрифугаBeckman CoulterOptima - L80Kспособна до 100 000 xg
Vanquish UHPLC (насос, колонный сердцемер и система LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Вода, ВЭЖХ классаSigma-Aldrich270733-1LМожет использовать собственный источник воды (см. ниже)
Шприц Whatman GD/XP PES 0,45 мм фильтрGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificпрограммное обеспечение для протеомики
610023

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles