Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60703

⸱

16 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

В этой статье

Краткое содержание

Пренилирование является важной модификацией периферических мембранных связывающих белков. Клетки насекомых можно манипулировать для производства фарнезилатных и carboxymethylated KRAS4b в количествах, которые позволяют биофизические измерения белково-белковых и белково-липидных взаимодействий

Аннотация

Пренилация белка является ключевой модификацией, которая отвечает за таргетинг белков на внутриклеточные мембраны. KRAS4b, который мутирует в 22% рака человека, обрабатывается фарнезиляции и карбоксиметилирования из-за присутствия 'CAAX' мотив коробки на C-термину. Инженерная система бакуловируса была использована для выражения фарнезилатовые и carboxymethylated KRAS4b в клетках насекомых и была описана ранее. Здесь мы описываем детальную, практическую очистку и биохимическую характеристику белка. В частности, для очищения белка до однородности использовались сродство и ионная обменная хроматография. Intact и родной масс-спектрометрии был использован для проверки правильной модификации KRAS4b и для проверки нуклеотидных связывания. Наконец, мембранная связь фарнезилатной и карбоксиметилового KRAS4b к липосоме была измерена с помощью поверхностной плазмонрезонансной спектроскопии.

Введение

Почтовые изменения играют ключевую роль в определении функциональной активности белков. Такие модификации, как фосфорилирование и гликозилирование, хорошо известны. Липидные модификации менее хорошо характеризуются, однако. Подсчитано, что до 0,5% всех клеточных белков могут быть пренилированными1. Prenylation является передача 15-углеродный фарнесил или 20-углеродный геранилгеранил липидной цепи принимает белок, содержащий мотив CAAX2. Пренилированные белки были вовлечены в прогрессирование нескольких заболеваний человека, включая преждевременное старение3, болезнь Альцгеймера4, сердечная дисфункция5,сосудидеремия6, и рак7. Небольшие GTPases, HRAS, NRAS, и KRAS1, ядерные ламинины, и кинетохоры CENP-E и F являются фарнезилатными белками в базальном состоянии. Другие небольшие GTPases, а именно RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, и RRAS являются geranylgeranylated8, в то время как RhoB может быть farnesylated или geranylgeranylated9.

Небольшой GTPase KRAS4b функционирует как молекулярный переключатель, по существу передающий внеклеточный фактор роста, сигнализирующие на внутриклеточные пути трансдукции сигнала, которые стимулируют рост и пролиферацию клеток, через несколько белково-белковых взаимодействий. Есть два ключевых аспекта биохимии KRAS4b, которые имеют важное значение для его деятельности. Во-первых, белковые циклы между неактивным ВВП и активным состоянием связанного GTP, при котором он активно взаимодействует с эффекторами. Во-вторых, C-терминальный поли-лизин области и фарнезилати и карбоксиметилированный цистеин направить белок на плазменной мембраны, что позволяет вербовки и активации вниз по течению эффекторов. Мутант KRAS4b является онкогенным драйвером в поджелудочной железе, колоректальной и рак легких10, и как таковой, терапевтическое вмешательство будет иметь огромное клиническое преимущество. Производство подлинно модифицированного рекомбинантного белка, который фарнезилат и карбоксиметилированный позволит биохимический скрининг с использованием KRAS4b в сочетании с мембранными суррогатами, такими как липосомы или липидные нанодиски11,12.

Фарнесил трансферазы (FNT) катализирует добавление фарнесилового пирофосфата в C-терминал цистеин в мотиве CAAX в KRAS4b. После prenylation, белок торгуется в эндоплазмический ретикулум (ER), где Ras преобразования фермента (RCE1) расщепляет три C-терминалостатка остатков. Последним шагом в обработке является метилирование нового C-терминала фарнесилцистеина остаток мембранного белка ER, isoprenylcysteine carboxyl метилтрансферазы (ICMT). Выражение рекомбинантного KRAS4b в кишечной палочке приводит к выработке неизмененного белка. Предыдущие попытки производить обработанный KRAS4b были ограничены из-за недостаточной урожайности для структурных или наркотиков скрининговых экспериментов или не смогли резюмировать родной полнометражный зрелый белок13,14. В представленном здесь протоколе используется инженерная система экспрессии клеток на основе бакуловируса и метод очистки, который генерирует высокоочищенный, полностью обработанный KRAS4b при урожайности 5 мг/л клеточной культуры.

Тщательная характеристика белка имеет важное значение для проверки качества рекомбинантных белков до начала структурных исследований биологии или скрининга наркотиков. Двумя ключевыми параметрами полностью обработанного KRAS4b являются проверка правильной модификации пренил и наличие фарнезилатной и карбоксиметилированных C-терминов (FMe) для взаимодействия с мембранными заменителями или липидами. Электроспрей ионизация масс-спектрометрии (ESI-MS) KRAS4b-FMe использовалась для измерения молекулярного веса и подтверждения наличия фарнесиловых и карбоксиметиловых модификаций. Местная масс-спектрометрия, где образцы распыляются с неденативными растворителями, была использована для демонстрации того, что KRAS4b-FMe также был связан с его Кофактором ВВП. Наконец, поверхностная плазмонная резонансная спектроскопия использовалась для измерения прямого связывания KRAS4b-FMe с обездвижемыми липосомыми.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Очистка белка

  1. Подготовьте буферы A-H, как видно из таблицы 1.
Решение буфераБуферный агент (все 20 мМ) рH NaCl (mM)имидазол (mM)MgCl2 TCEP
AГЕПЕС7.3300-51
BГЕПЕС7.33003551
CГЕПЕС7.330050051
DМчс6.0200-51
EМчс6.0--51
FМчс6.0100-51
ГМчс6.01000-51
HГЕПЕС7.3300-11
  1. Подготовка очистных материалов (см. Таблица материалов):коктейль-ингибитор протеазы без ЭДТА или других хелаторов; обездвижение металлической хроматографии (IMAC) колонки; колонка cation exchange chromatography (CEX); 0,45 мкм фильтршого; 2 М имидазол (рН 7,5); ультрацентрифуги, способной 100 000 х г; центрифуга высокой скорости, способная 4000 х г; центробежные фильтровальные блоки (10 KDa NMWL); спектрофотометр, способный читать на уровне 280 нм; Его 6-табачный травяной вирус (TEV) протеазы; и хроматографические приборы, способные смешивать два буферных решения, применять решения к столбцов, создавать градиентные элевации из столбцов и собирать фракции из столбцов.
  2. Оттепель клетки из No 2 L культуры клеток насекомых ранее хранится при -80 градусов по Цельсию или использовать свежесобранные клетки. Смотрите Gillette et al. 201915 для получения подробной информации о линии клеток насекомых Tni.FNL и протоколах выражения. Тщательно resuspend клетки с 200 мл буфера С добавлением 1:200 v/v ингибитор протеазы без введения воздуха или создания пены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.3 и последующие шаги (за исключением как замечено) должны быть выполнены при комнатной температуре (22 градуса По Цельсию). Важно, чтобы образец был однородным, чтобы обеспечить полный лисис на следующем этапе.
  3. Лиза клетки гранулы в микрофлюидисизатор на 7000 пси в течение двух проходов или в эквивалентной системе лиза. Альтернативные методы лисиса не изучены.
  4. Уточнение лисатов клеток насекомых является проблематичным из-за присутствия соединений, которые засоряют фильтры. Таким образом, ультрацентрифугация (100 000 х г на 30 мин при 4 градусах Цельсия) очень важна. Белый липидный остаток на поверхности супернатанта следует избегать и может быть удален или уменьшен с помощью ватных тампонов. Фильтр декантированных супернатант через 0,45 мкм PES фильтра. Используйте уточненный образец немедленно или храните при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки блоков фильтры быстро и многие фильтры могут быть необходимы. Неспособность уменьшить количество этого материала приведет к высокому давлению столбца назад в последующих шагах.
  5. Определите объем уточненного лизата и отрегулируйте образец до 35 мМ имидазола путем добавления 2 M имидазола. Загрузите образец на 3 мл/мин на 20 мл колонны IMAC (колонка HisPrep FF 16/10), предварительно уравновешенную в буфере B в течение трех объемов колонн (CVs).
  6. Хотя целевой белок, как правило, количественно адсорбируется к столбце, лучше всего собирать поток столбцов для последующего анализа. Вымойте колонку до тех пор, пока Abs280 не достигнет устойчивого базового (злт;100 миллиабсорбционных единиц (mAU) с буфером B на 3 мл/мин на 20 мл (1 CV), затем для 3 CV на 4 мл/мин на оставшуюся часть шага мытья. Как правило, 60-80 мл буфера B необходимо для достижения базового поглощения.
  7. белок с градиентом 400 мл (20 CV) от буфера B до Буфера C, собирая 8 мл фракций. Как правило, целевой белок elutes в первой половине градиента(Рисунок 1A; не все более поздние фракции показаны).
  8. Анализ белковых фракций с помощью SDS-PAGE/Coomassie окрашивания. Бассейн пик фракций и диализировать бассейн на ночь против 2 L буфера D при 4 КС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкий рН имеет решающее значение для обеспечения связывания белка на следующем шаге. Однако, изменение рН во время этого диализа происходит медленно, и это удобный шаг для ночной инкубации. Альтернативные стратегии буферного обмена (например, более высокая концентрация буфера для ускорения изменения рН) не были исследованы. Белок начнет медленно осаждать сяртые с течением времени при более низком рН и более низких концентрациях соли и небольшое количество осадков является нормальным во время этого шага. Из-за этого мы избегаем обмена буфера на 100 мМ NaCl, необходимый для привязки к следующей колонке во время диализа. Скорее, концентрация NaCl 200 мМ используется для диализа и белок разбавляется до 100 мМ (см. ниже) непосредственно перед нанесением на столбец. Мы не исследовали, если это количество осадков является специфическим для KRAS4b, но белок, который делает осадок был подтвержден как KRAS4b-FMe. По этой причине мы предлагаем использовать более высокую концентрацию NaCl в буфере диализа для любого белка, интересующего интерес, в качестве меры предосторожности до тех пор, пока стабильность целевого белка в связывающем буфере не будет определена.
  9. Удалите образец из диализа и центрифуги на 4000 х г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадок. Окончательный диализированный, проясненный образец на данный момент все еще часто туманный, но может быть применен без дальнейшей обработки на последующую колонку CEX.
  10. Подготовьте столбец обмена катиона 20 мл (см. Таблица материалов)путем мытья с тремя резюме Buffer G, а затем с тремя резюме Buffer F.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы не тщательно оценили другие миски, некоторые коллеги нашли плохое разрешение с миссинами, кроме SP Sepharose высокой производительности мисы.
  11. Разбавить 20 мл диализированного образца до конечной концентрации NaCl 100 мМ, добавив 20 мл буфера E и нанесите разбавленный образец на колонку обмена катиона.
  12. Продолжайте загружать колонку, добавляя свежеразбавленные образцы, подготовленные, как описано выше, к нагрузочной трубке, поскольку предыдущее разбавление близится к концу нагрузки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление всего образца сразу до 100 мМ NaCl привело к значительной потере целевого белка из-за осадков.
  13. Вымойте столбец до базовой Abs280 с буфером F. Это обычно требует 3 резюме. Белок вымеливается из колонны во время градиента 400 мл (20 CV) от Buffer F до 65% Buffer G, собранного в 6 мл фракций(рисунок 1B).
  14. Продолжить мыть ежеколонку для дополнительного 1,5 CV (65% Buffer G) после завершения градиента. Выберите положительные фракции на основе обоих SDS-PAGE/Coomassie синий анализ пятен и осмотр УФ-след хроматограммы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-трассировка обычно содержит пять пиков. Начиная с более низких концентраций соли, первоначальный пик, как правило, необработанные и / или протеолиза белка. Второй и третий пики представляют собой смесь двух форм обработанного белка: второй пик в первую очередь фарнезилатный промежуточный (FARN), в то время как третий в первую очередь полностью обработанный белок FMe интереса. Пики четыре и пять представляют his6-MBP-KRAS4b синтез ампликов (все белки в этом формате на данный момент, так как не пищеварение TEV произошло). Они не N-ацетилированные на N-терминус и фарнезилат (пик четыре) и farnesylated и carboxymethylated (пик пять) на C-конец. Как пик два и пик четыре будет производить идентичные белки после удаления тегов (т.е., KRAS4b-FARN) они могут быть объединены на данном этапе при желании. Аналогичным образом, пик три и пик пять могут быть объединены для производства одного лота KRAS4b-FMe(рисунок 1B, Рисунок 2). Тем не менее, он сообщил, что это объединение будет сделано только тогда, когда природа белка в отдельных пиков была подтверждена.
  15. Переварить белок, объединенный в шаге 1.15 с протеазой His6-TEV (200 мкг протеазы/мл образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы делаем его6-TEV протеазы с использованием плазмиды и протоколы доступны из Addgene(https://www.addgene.org/92414). Диализ ный дайджест TEV против буфера A (10 kDa MWCO диализных труб с минимум40 мл буфера A на мл образца) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
  16. После пищеварения и диализа загрузите белок непосредственно в 20 мл колонны IMAC, уравновешивается с буфером A на 3 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 7 мЛ фракций во время всей этой хроматографии, потому что целевой белок имеет низкое сродство к столбцу, но не может быть полностью связан с мишенями. Вымойте столбец на 3 мл/мин с буфером A в общей сложности 3 резюме или до тех пор, пока не будет достигнут базовый абсорбция.
  17. Целевой белок eluted с 5 CV градиент буфера C от 0%-10%, собирая 7 мл фракций. В качестве меры предосторожности, дополнительные связанные белки могут быть eluted с 100% Буфер C. Положительные фракции определены после анализа SDS-PAGE (Рисунок 1C). Как правило, целевой белок elutes при низкой концентрации имидазола (т.е. в 0%-10% Buffer C градиента), но иногда elutes в потоке через или колонке мыть.
  18. Диализ окончательный бассейн против буфера H. Определите концентрацию белка спектрофотометрией на 280 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте учесть наличие нуклеотида при определении коэффициента вымирания для использования для этого расчета.
  19. Белок может быть сконцентрирован до 2-5 мг/мл с помощью центробежного фильтра (10 Км NMWL) без значительной потери белка. Фильтр с фильтром шприца 0,22 мкм. Измерьте абсорбцию раствора на Уровне280 для расчета конечной концентрации белка(рисунок 1D). Привязка заморозить aliquots в жидком азоте и хранить замороженные образцы при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенный белок связан с ВВП. KRAS4b-FMe можно обменять на GppNHp с помощью ранее опубликованных протоколов16.

2. Подготовка образца для нетронутого массового анализа и анализа массы нативной

  1. Подготовка образцов для нетронутого массового анализа
    1. Оттепель протеина образец на льду до анализа. Для нетронутого массового анализа разбавить белок до 0,1 мг/мл в 20 мм бикарбонат аммония (рН ю 8,4). Для анализа массы нативном языке разбавить белок до концентрации 0,1 мг/мл в ацетате аммония 50 мм (рН 7,5). Vortex каждый образец для 5-10 s, затем центрифуга на 12500 х г в течение 1 мин, чтобы гранулы любого твердого материала в растворе. Удалите 10-20 л каждого супернатанта и перенесите на стеклянный флакон автосэмпера. Cap каждый флакон плотно, чтобы предотвратить загрязнение или испарение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для нетронутого анализа массы или родного анализа массы, образец может быть опресненным до анализа с помощью 10 kDa MWCO целлюлозы мембранный фильтр для буфера обмена в окончательный буфер разбавления.
  2. Подготовка расширенного диапазона массы (Эмир) масс-спектроскопии для массового анализа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском любого анализа на масс-спектрометр, убедитесь, что он был недавно откалиброван. Кроме того, всегда носить перчатки и другие средства индивидуальной защиты по мере необходимости, чтобы избежать каких-либо вредных химических веществ и, чтобы избежать загрязнения образцов и растворителей. Калибровка осуществляется с использованием калибровоза в растворе, полученного на коммерческой основе, и раствора йодия цезия 2 мг/мЛ, подготовленного в домашних целях.
    1. Откройте программное обеспечение для анализа и загрузите соответствующий файл метода инструмента. Для нетронутого массового анализа белков KRAS4b подходящие стартовые параметры следующие: положительный способ обнаружения; три микроскана, разрешение 70 000 евро; Цель AGC 3e6; максимальное время интеграции - 200 мс; и диапазон сканирования - 70-1800 соотношение массы к зарядке (м/з). Для местного массового анализа белков KRAS4b подходящие стартовые параметры следующие: положительный способ обнаружения; 10 микросканов, разрешение 17 500 евро; в источнике столкновения индуцированной диссоциации (CID) - 20 eV; Цель AGC 3e6; энергия столкновения (CE) No 20; максимальное время интеграции - 200 мс; и диапазон сканирования 500-10 000 м/з.
  3. Приготовление хроматографических растворителей и колонны
    1. Подготовьте растворители, необходимые для нетронутого массового анализа. Solvent A - это вода с 0,1% для модной кислоты. Растворитель B составляет 80% ацетонитрила и 0,1% для модной кислоты в воде.
    2. Подготовьте растворители, необходимые для массового анализа нативной основе. Растворитель А составляет 0,1 М ацетат аммония в воде и Solvent B является вода.
    3. После того, как соответствующие растворители подготовлены, очистить систему так, что трубки заполнены соответствующими растворителями и все пузырьки воздуха удаляются от линий.
    4. Установите соответствующий столбец (столбец обратной фазы для анализа нетронутой массы и столбец исключения размера для анализа массы нативной стадии). Для нетронутого анализа массы скорость потока составляет 0,5 м/мин, а температура колонны (с помощью обогревателя колонны) составляет 50 градусов по Цельсию. Равновесие колонны в течение 15-20 мин. Для местного массового анализа скорость потока составляет 0,25 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда следите за давлением столбца, чтобы убедиться, что она не поднимается выше верхнего предела, что может указывать на засоренную линию или что матрица столбца скомпрометирована. При необходимости замените столбец.
  4. Анализ образцов
    1. Поместите подготовленный образец белка в стеклянный флакон автосэмпера в соответствующую стойку флакона в автосэмпере систем LC. Создайте список примеров (ы) в программной программе с соответствующим инструментальным методом для желаемого анализа. Как только список образцов будет завершен, нажмите кнопку Воспроизведения, чтобы начать анализ.
    2. Вводят 1-2 л образца на анализ, с пустой водой до и после каждого образца, чтобы обеспечить отсутствие переноса присутствует.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нетронутый анализ массы очень отличается от родного анализа массы и требует очень разных настроек метода инструмента. Это потому, что с нетронутыми массового анализа, белок "расслабленный" в присутствии органического растворителя, и, таким образом, способен принимать больше зарядов. Легче деконволутировать и решить изотопное распределение состояния заряда. Анализ массы на родине обеспечивает узкое распределение заряда ионов белка, и на основе белка, требует различных параметров напряжения и энергии столкновения.
  5. Анализ данных и деконволюция белка
    1. Экспорт спектра образца в программное обеспечение, где он может быть преобразован в де-запутанный спектр, который будет отображать нетронутой массы (или родной массы) белка. Нетронутая масса будет иметь изотопное пиковое распределение из-за высокого обилия заряженных спектральных пиков. Родная масса, как правило, имеют очень мало пиков из-за низкого изобилия заряженных спектральных пиков(рисунок 3D).
    2. Расширьте диапазон соотношения массы к заряду (м/з) пика d, чтобы подтвердить, что измеренная масса соответствует прогнозируемой массе. Иногда, из-за добавления зарядов к белку, могут быть небольшие различия между ожидаемым молекулярным весом (Mw) и наблюдаемым МВ. Кроме того, как и во многих анализах масс-спектрометрии, аддукты, такие как натрий, могут способствовать появлению дополнительных пиков в данных, даже с тщательно опресненные образцы. Иногда наблюдаются более низкие обильные пики с м/з, что ниже, чем ожидалось. Это, скорее всего, связано с нейтральной потерей, которая является потерей функциональной группы из-за процесса ионизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и ожидалось, будут различия между нетронутой массы и родной массы пиков. Нетронутый массовый дисплей покажет ожидаемый МВт белка. Он не будет иметь дополнительный МВт прилагается нуклеотид или других модификаций. Тем не менее, родной пик массы покажет белок с любым добавленным нуклеотидом.

3. Проверка связывания KRAS4b-FMe к липосом

  1. Препарат липосомы Мембраны
    1. Подготовьте буфер, состоящий из 20 мМ HEPES (pH 7.3), 150 мМ NaCl и 1 мМ TCEP.
    2. Липосомы препараты включают 25 мМ 1-пальмитоил-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин (POPC) и 10 мМ 1-palmitoyl-2-олеоил-глицеро-3-фосфо-L-серин (POPS) запасы в хлороформе; набор липидных экструдера с держателем и нагревательным блоком; аргон ный газ и жидкий азот; ультразвуковая ванна; стеклянный винт нить флаконы с PTFE пены вкладыши; и считыватель пластин, способный к динамическому обнаружению рассеяния света.
    3. Оттаивайте липидные запасы в хлороформе при комнатной температуре 30 мин. Приготовьте 1 мл 5 мМ 70:30 POPC: липосомы POPS путем алицитирования 106 мл 25 мМ POPC (запас) и 118 л 10 мм POPS (запас) в стеклянный флакон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не аликвот липиды с пластиковым наконечником, потому что хлороформ может растворить определенные пластиковые советы.
    4. Сухие липиды под устойчивым потоком аргонового газа. Медленно поверните стеклянный флакон при применении аргонового газа, чтобы сформировать тонкий слой сухой пленки.
    5. Положите образцы под вакуумный лиофилизатор на ночь, чтобы удалить избыток хлороформа.
    6. Восстановите липиды, добавив 1 мл буфера в сушеную пленку и вихрь смеси в течение 5 мин. Гидрат липидных смесей, качая в течение 1 ч при 25 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец будет очень мутным при добавлении буфера к высушенному пленочному слоеу липидов.
    7. Выполните пять циклов замораживания/оттепели, чередуя размещение пробы флакона между ледяной водой (4 градуса Цельсия или ниже) и теплой водяной баной (25 градусов по Цельсию или выше).
    8. Поместите образец флакона в ультразвуковую ванну и снотворизм образец около 0,5 ч или до тех пор, пока образец не станет полупрозрачным.
    9. Вынизуем образцы с помощью набора липидных экструдера. Соберите экструзионный комплект, как показано в инструкциях производителя. Вынизуем образцы, используя фильтровальную бумагу 0,1 мкм. Загрузите образцы в один стеклянный шприц и прикрепите его к одному концу экструзионного аппарата. Добавьте пустой шприц на другом конце экструзионного аппарата. Нажмите вперед и назад 10-20x, пока ваши образцы становятся полностью прозрачными.
    10. Спин окончательные образцы в течение 30 минут на 20000 х г, чтобы удалить любые крупные агрегаты.
    11. Используйте динамическое рассеяние света (DLS) для определения размера и однородности липосом (по желанию). Поместите 30 qL липосом в 384 хорошо плиты читателя. Спин пластины на 1000 х г в течение 30 мин. Поместите пластину в плиту читателя и собрать 10 измерения рассеяния света.
  2. Характеристика привязки KRAS4b-FMe к липосомам с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
    1. Соберите необходимые материалы: инструмент SPR; чип датчика L1; 7 х 14 мм флакон трубки; и CHAPS.
    2. Подготовьте буфер, содержащий 20 мМ HEPES (pH 7.3), 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP. Подготовьте серию разбавления 2:1 KRAS4b-FMe с 60 мкм-0,06 мкм в общем объеме 200 кл (всего 10 титров). Перенесите окончательные разбавленные образцы в флаковые трубки (см. Таблицу Материалов),поместите флаковы трубки в стойку и вставьте образцы в инструмент SPR.
    3. Вставьте чип датчика L1 в инструмент SPR. Прикрепите буфер и премьер системы с буфером в течение 7 минут.
    4. Настройка автоматизированного метода следующим образом:
      1. Установите температуру прибора до 25 градусов по Цельсию.
      2. Активируйте чип датчика L1, промыв его двумя 1 мин инъекциями 20 мМ CHAPS, растворенным в воде при скорости потока 30 л/мин.
      3. Выполните циклы запуска из десяти 1 мин впрыска бегущего буфера для увлажнения поверхности чипа.
        1. Депозит липосомы на чип датчика L1 путем введения липосом на ячейку потока (FC)-2 чипа L1 с 2 мин инъекций на 5 Л / мин. Цель для захвата уровне, по крайней мере 3000 единиц реагирования (RUs).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте время инъекции, пока не достигнете соответствующего уровня захвата.
      4. Введите три цикла буфера над FC-1 и FC-2 с 1 мин инъекций на 30 л/мин.
        1. Вводят различные титрации KRAS4b-FMe от самой низкой до самой высокой концентрационной серии. Вводят белки, используя 1 мин инъекции для фазы ассоциации и 2 мин инъекции для фазы диссоциации на 30 Л / мин скорость потока в течение обоих FCs.
        2. Регенерировать чип датчика L1 путем промывки его с двумя 1 мин инъекции 20 мМ CHAPS на 30 л / мин.
    5. Приспособите данные с помощью программного обеспечения оценки SPR с помощью единой модели связывания сайта для получения явной связывающей близости (см. раздел Обсуждение для объяснения установки данных).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Одной из самых больших переменных в протоколе является количество выраженного целевого белка (His6-MBP-tev-KRAS4b). Этот протокол был разработан с использованием изолята от линии клеток Trichoplusia ni, Tni-FNL17, адаптированного для роста подвески и отлуженных от сыворотки. Учитывая широкий спектр результатов, зарегистрированных в различных линиях клеток насекомых с системой экспрессии бакуловируса, желательно, чтобы Tni-FNL использовался, по крайней мере на начальном этапе, для производ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как отмечается в разделе «Результаты представителей», наиболее важным шагом при очистке является обработка образца во время его пребывания в более низкой соли. Ограничение времени, в течение которого образец подвергается воздействию менее 200 мМ NaCl, поможет уменьшить количество осадков и увеличить урожайность выборки. Интерпретация результатов CEX может быть затруднена, если профиль не соответствует ожиданиям (см. рисунок 2). До тех пор, пока протокол не стал рутиной, рекомендуется, чтобы ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признаем, клонирование и выражение поддержки от Карисса Гроуз, Джен Melhalko, и Мэтт Дрю в лаборатории экспрессии белка, Фредерик Национальной лаборатории по изучению рака. Этот проект был профинансирован в целом или частично за счет федеральных средств из Национального института рака, Национальные институты здравоохранения, в соответствии с контрактом No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,8 мл пробирки с безопасным замком, натуральныйEppendorf22363204
11 мм Cl SS Сблокированный вкладыш автоподатчикаThermo Scientific30211SS-1232
1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC)AVANTI ПОЛЯРНЫЕ ЛИПИДЫ 850457приобрести в виде жидких запасов в хлороформе
1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфо-L-серин (СОЗ)AVANTI ПОЛЯРНЫЕ ЛИПИДЫ840034купить в виде жидких запасов в хлороформе
5427R ЦентрифугаEppendorf
Ацетонитрил, ВЭЖХ GradeFisher ChemicalA998-1 1л
Ацетат аммонияSigma-Aldrich09689-250g
Газ аргонВоздухПробирная пластина ARUP
384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Ультразвуковая ваннаThermo Fisher15-336-1000
Катионообменная хроматография (CEX) колонкаGE Healthcare Life Sciences29018183HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Планшетный ридерWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Масс-спектрометрThermo Scientific
Муравьиная кислотаSigma-AldrichF0507-500MlИспользуйте реагент класса или лучше
Флаконы Gilson 7x14 мм ПробиркиGE HealthcareBR-1002-12
Стеклянные флаконы с винтовой резьбой и вкладышамииз пенопласта ПТФЭНаучные специализацииB69302
Высокоскоростная/настольная центрифугаThermo Fischer Scientific05-112-114D, способная до 4 000 xg
протеазы вируса травления табака (TEV) His6Addgene92414Очищенная согласно Raran-Kurussi et al. (2017) Удаление аффинных меток с протеазой TEV. В: Берджесс-Браун Н. (ред.) Гетерологичная экспрессия генов в E.coli. Методы молекулярной биологии, том 1586. Humana Press, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк
Иммобилизованная металлическая аффинная хроматография (IMAC) колонкаGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Внутреннее водоснабжение, Arium AdvanceSartorius StedimУдельное сопротивление 18 MΩ 0-см
Набор липидных экструдеров с держателемAVANTI POLAR LIPIDS
Жидкий азотВоздушный газNI-DEWAR
M110-EH микрофлюидизаторMicrofluidics
MabPac RP UHPLC Колонна, 4 мкм, 3,0 x 50 ммThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Колонка, 5 мкм, 300 Å, 2,1 x 150 ммThermo Scientific088790
Программное обеспечение MagTranThermo Scientific
Метанол, ВЭЖХ классаVWR ХимикатыBDH20864.400
NGC Хроматографическая системаBioRad78880002NGC QuestTM 100 Хроматографическая система
Коктейль ингибитора протеазы без ЭДТА или других хелаторовMillipore SigmaP8849
Резиновые колпачки тип 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L1Спектрофотометр GE Healthcare29104993
Thermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace at 280 nm
Ultra-15 Центробежные фильтрующие блоки, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES мембрана
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 мл Центрифугафильтры AmiconUFC501024
УльтрацентрифугаBeckman CoulterOptima - L80Kспособна до 100 000 xg
Vanquish UHPLC (насос, колонный сердцемер и система LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Вода, ВЭЖХ классаSigma-Aldrich270733-1LМожет использовать собственный источник воды (см. ниже)
Шприц Whatman GD/XP PES 0,45 мм фильтрGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificпрограммное обеспечение для протеомики
610023

Ссылки

  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка KRAS4bфарнезилированный белоккатионообменная хроматографиямасс-спектрометрия интактных белковповерхностный плазмонный резонансэкспрессия с помощью бакуловирусаанализ связывания с липосомамидиализ белкахроматография IMACанализ связывания нуклеотидов
Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.