Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ретроградная трассировка дрозофилических мотонейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей

6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60716

⸱

12 января 2020 г.

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод ретроградного отслеживания дрозофилэмбриональных моторных нейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей.

Аннотация

Мы описываем технику ретроградной маркировки моторных нейронов в Дрозофиле. Мы используем растворенный маслом липофильный краситель и доставляем небольшую капельку в эмбриональную подготовку филе микроинжетором. Каждый моторный нейрон, мембрана которого контактирует с каплей, может быть быстро помечен. Индивидуальные моторные нейроны постоянно маркируются, что позволяет четко визуализировать детали конструкций. Учитывая, что липофильные красители бывают различных цветов, техника также обеспечивает средства, чтобы получить соседние нейроны помечены в многоцветных. Этот метод отслеживания поэтому полезен для изучения нейрональных морфогенеза и синаптической связи в двигательной нейронной системы Drosophila.

Введение

Эмбриональная двигательная нейронная система Дрозофилы предлагает мощную экспериментальную модель для анализа механизмов, лежащих в основе развития центральной нервной системы (ЦНС)1,2,3. Система моторных нейронов поддается биохимическим, генетическим, визуальным и электрофизиологическим методам. Используя методы, генетические манипуляции и функциональные анализы могут быть проведены на уровне одиночных моторных нейронов2,4,5,6.

Во время раннего развития нервной системы нейробласты делятся и генерируют большое количество глии и нейронов. Пространственно-временной связи между delamination и профиль экспрессии генов нейробластов ранее были исследованы в деталях7,8,9. В случае двигательной нейронной системы, формирование эмбрионального нервно-мышечного соединения (NMJ) было широко изучено с помощью aCC (передняя угловая клетка), RP2 (сырые креветки 2), и RP5 моторных нейронов2,10. Например, когда двигательный нейрон RP5 образует зарождающийся синаптический узел, досинаптический и постсинаптический филоподия переплета11,12,13. Такая прямая сотовая связь имеет жизненно важное значение для инициирования формирования NMJ. Вопреки тому, что мы знаем о периферических нервных ветвей, наши знания о том, как моторные дендриты инициировать синаптические связи в ЦНС по-прежнему примитивным.

В этом отчете мы представляем метод, который позволяет ретроградную маркировку моторных нейронов в эмбрионах с помощью микропипети-опосредованного доставки липофильных красителей. Этот метод позволяет нам проследить 38 моторных нейронов, иннервирующих каждый из 30 мышц стенки тела в геми-сегменте на 15 ч после откладки яиц (AEL)14. Используя эту технику, наша группа тщательно исследовала многочисленные выгоды-оф-функции / потери функции аллелей15,16,17. Недавно мы разгадали молекулярные механизмы, которые управляют инициации соединения двигательного дендрита и показали, что взаимодействие Dscam1-Dock-Pak определяет место развития дендрита в моторном нейроне ACC17. В целом, этот метод адаптируется для фенотипического анализа любых эмбриональных моторных нейронов в диком типе или мутантных штаммов, повышая нашу способность предоставлять новые идеи в функциональном дизайне нервной системы Дрозофилы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Оборудование и материалы

  1. Материалы для сбора эмбрионов и обучения взрослых откладывать яйца
    1. Подготовка фильтрации аппарата, разрывая 50 мл трубки и резки открыть отверстие в крышке установить сетчатый фильтр с порами 100 мкм (Таблица материалов) между трубкой и крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, клеточные ситечко с порами 100 мкм(Таблица материалов) могут быть использованы для фильтрации шаг сбора эмбриона.
    2. Сделать агар пластины с виноградным агаром премикс(Таблица материалов) в соответствии с перечисленными инструкциями. Кратко, аккуратно перемешать 1 пакет порошка смесь в 500 мл комнатной температуры (RT, 23 КС) dH2O и микроволновой растворенные смеси до энергичного кипения. После охлаждения до 70-75 градусов по Цельсию, залить смесь в чашку Петри (60 мм). После того, как агар затвердеет, храните тарелки при 4 градусах Цельсия.
    3. Подготовка дрожжевой пасты путем смешивания активных сухих дрожжей(Таблица материалов) и воды в пасту консистенции, и держать на 4 градусов по Цельсию.
    4. Используйте яичные клетки (для 60 мм Петри блюдо, таблица материалов), которые обеспечивают достаточный поток воздуха.
  2. Приготовление рассечения игл и микропипететов для впрыски красителя
    1. Приготовьте краситель инъекций микропайпета и иглу вскрытия из той же капиллярной трубки с внутренним диаметром 0,6 мм и внешним диаметром 1,2 мм(Таблица материалов). Потяните капиллярные трубки на выдвижной микропайпет на 7% от 170 V максимальный выход (Таблица материалов) для создания острой иглы с конусом 0,4 см в длину.
    2. Для впрыска красителя, отрегулируйте micropipette с beveler micropipette (Таблица материалов) методом beveling пузыря описанным в руководстве прибора.
      1. Короче говоря, замочите мясорубку с смачивания агента (Таблица материалов), чтобы предотвратить воду от "перетаскивания" кончик иглы. Поместите иглу на зажим микропипетки на уровне 25–30 градусов и опустите кончик на две трети радиуса из центра поверхности, соскабившей. Измельчить иглу в то время как шприц с трубками толкает воздух в иглу, чтобы микропипетка будет очищена от стеклянной бритья.
      2. Отметьте микропайпет с тонкой кончик перманентный маркер, чтобы указать положение открытия на кончике после beveling, как это сложно найти узкое отверстие микропайпет, который формируется под углом.

2. Подготовка к сбору эмбрионов

  1. Убедитесь, что взрослые мухи (20-40 диких типа Canton-S или белые мухи), самцы и самки, поддерживаются в молодых (злит;7 дней) и здоровых условиях для идеальной коллекции яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стимулировать яйцекладка, мухи обучаются в их клетке сбора яиц за пару дней до сбора яиц на агар пластины полосатые дрожжевой пасты по крайней мере один раз в день.

3. Постановка эмбрионов

  1. Разрешить мухам откладывать яйца на ночь (или не менее 15 ч) на RT, чтобы собрать эмбрионы на 15 h AEL, т.е. этап 1618, для просмотра дендритогенеза aCC и RP3 моторных нейронов. Утром соберите тарелку с яйцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы на 15 ч AEL будет иметь различные 4-камерный кишечник18. Для визуализации различные этапы следуют их специфическим морфологическим критериям и условиям старения.
  2. Чтобы собрать эмбрионы, дехорионат яйца, отложенные на тарелке с 50% отбеливателем в течение 5 мин.
  3. После того, как хорионы очистили, залить содержимое пластины через фильтрационный аппарат или ситечко клетки, чтобы изолировать эмбрионы. Используя бутылку сжатия воды, разбавить отбеливатель слева на тарелке и собрать как можно больше эмбрионов, как это возможно путем декантирования смеси в фильтр.
  4. Вымойте эмбрионы на фильтре 3'4x с большим количеством воды или до тех пор, пока запах отбеливателя рассеивается. Снимите фильтр с аппарата и вымойте эмбрионы на другую чистую тарелку с водой. Декантная вода из новой пластины, что эмбрионы на.
  5. Подготовьте стеклянную горку, покрыв ее двумя слоями виниловой ленты в центре, образуя прямоугольник. Вырежьте прямоугольный бассейн из ленты с помощью лезвия бритвы. Поместите тонкую полоску двусторонней ленты к верхнему концу бассейна, это где эмбрионы будут размещены, как показано на рисунке 1.
  6. Используя тонкие щипцы, индивидуально отбирайте 5–10 эмбрионов при 15 л.с. AEL и размещайте их на двусторонней ленте с андреевской стороной вверх. Добавить солин насекомого Ringer19 в бассейн вскрытия для защиты эмбрионов от высыхания(рисунок 1).

4. Рассечение и окрашивание

  1. Используя стеклянную иглу под рассекающим микроскопом(Таблица Материалов),прорежьте середину одного эмбриона на его поверхности от задней части до переднего конца. Затем перетащите эмбрион из вительлина мембраны из ленты на стекло (коробка на рисунке 1). Позаботьтесь о том, чтобы не повредить внутренние ткани эмбриона.
  2. Переверните эпителиальные ткани из центра и прикрепите эпидермальный край на поверхность стеклянной горки(рисунок 1,вставить).
  3. Использование трубки подключенной иглы с наконечником открытия 300 мкм (подготовлены путем нарушения тонкого кончика иглы вскрытия), аспирили или дуть воздух, чтобы отделить и удалить дорсальный продольной трахеи стволы, а также любые оставшиеся кишки.
  4. Используйте 4% параформальдегида (PFA) в фосфат-буферизированных солей (PBS), чтобы исправить эмбрионы в течение 5 минут на RT. Вымойте эмбрионы 3x с PBS.
  5. Пятно эмбрионов с 1 Л анти-хонредас перекиснида антитела конъюгированные с цианин 3 красителя (анти-HRP Cy3) (Таблица материалов) в 200 ЗЛ PBS на 1 ч. Вымойте эмбрионы с PBS 3x после окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель анти-HRP может быть изменен на основе липофильных красителей выбора для инъекций.

5. Заполнение инъекционной микропипетки

  1. Тепло липофильных красителей (5 мг/мл DiO или DiD, Таблица материалов) до 60 градусов по Цельсию в 1:10 смесь этанола: растительное масло перед использованием.
  2. Подготовьте растворенный маслом слайд для инъекционного микропипети. Поместите микропипетт в держатель капилляра(рисунок 2,#1). Используя микроманипулятор(Таблица материалов),отрегулируйте микропипет, чтобы быть над слайдом красителя. Затем отрегулируйте сцену, чтобы поместить микропайпет на краситель(рисунок 2,#2).
  3. Чтобы заполнить микропипет, используйте микроинжектор(Таблица материалов)(рисунок 2,#3). Соберите краситель в микропайпет, установив Pi (давление инъекций) между 200-500 hPa (гектопаскаль), Ti (время инъекции) между 0,1 и 0,5 с и Pc (компенсационное давление) до 0 hPa в течение 5 мин(рисунок 2, #4).
  4. После того, как краситель был собран, удалить слайд красителя и поместить образец на стадии микроскопа. Затем увеличьте Pc до диапазона 20-60 hPa, прежде чем опустить микропипетик в образец, чтобы предотвратить загрязнение PBS капиллярным действием.

6. Инъекция красителя в нейроны

  1. Найдите эмбрион в центре с помощью микроскопа с 10-x объективным объективом(Таблица Материалов)и выровнять микропипетик с эмбрионом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер капли красителя можно регулировать путем изменения Pi или размера отверстия кончика micropipette. Капля должна быть 10–20 мкм, что примерно ширина 1 мышцы.
  2. Измените объектив объективного на объектив погружения в воду 40x(Таблица материалов)и погрузите линзу в PBS, чтобы увидеть эмбрион.
    1. Используйте флуоресцентную микроскопию, чтобы проверить морфологию нейронов, отмеченную анти-HRP Cy3, и определить место инъекции.
    2. Во время инъекций, используйте ярко-поле микроскопии, чтобы увидеть капли красителя. Когда эмбрион находится в фокусе, измените положение микропайпета, чтобы сделать нежный контакт с кончиком аксона интереса (например, aCC, RP3).
    3. Бросьте краситель в правом брюшной полости (A2'A6) геми-сегмент на нервно-мышечной стыке aCC или RP3 (Рисунок 3) с DiD или DiO, с помощью нейронов, отмеченных анти-HRP Cy3. Использование ручного управления (мышь; Рисунок 2, 5) отпустите краситель и удалить микропипетипосле после падения красителя с микроманипулятором и перейти на следующий сайт инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других красителей (например, Люцифер желтый, кальцийн), которые распространяются в соседние клетки через разрыв узлов, липофильные красители ассоциируются с клеточными мембранами и не передаются соседям. Из-за относительно большого размера капли красителя, однако, этот метод также приводит к маркировке партнерских мышц(Рисунок 3A).
  3. Инкубировать образец на RT в течение 1 ч после красителя капли до изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь перед монтажом, и образец может храниться при 4 градусах Цельсия на ночь. Липофильные красители также могут быть доставлены с помощью ионтофореза, если внутриклеточного прямого соединения (DC) усилитель легко доступны20.

7. Изображение с помощью конфокального микроскопа

  1. Снимите двусторонню ленту и виниловую ленту со стеклянной горки с помощью щипочек.
  2. Подготовьте крышку скольжения (22 х 22 мм2 No 1 крышка стекла) с небольшим количеством вакуумной смазки (Таблица материалов) на четырех углах и тщательно поместите на образец, избегая пузырьков воздуха. Удалите излишки PBS с помощью стеклоочистителей задач.
  3. Нажмите вниз крышка скольжения, чтобы настроить рабочее расстояние между объективом цели и образца. Полностью запечатать края крышки скольжения с лаком для ногтей.
  4. Изображение при увеличении в 10 раз и 100 раз с помощью конфокального микроскопа.
  5. Используйте программное обеспечение ImageJ для обработки необработанных изображений с микроскопа(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение должно начаться в течение 10 минут после монтажа для лучших изображений. В противном случае, на RT, краситель будет распространяться на сайты, прилегающие к месту инъекции создания нежелательных фон для изображения. Чтобы замедлить диффузию красителя, образец может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативное изображение моторных нейронов ACC и RP3 показано на рисунке 3C, чтобы продемонстрировать разноцветную маркировку моторных нейронов на уровне 15 л. Их дендритные морфологии в значительной степени инвариантны между эмбрионами. Шаблон окрашивания, полученный с анти-HRP антитела показаны в серый цвет. Небольшая капля DiO или DiD была депонирована на NMJ мышцы 1 или 6/7, соответственно. Рисунок 4 демонстрирует способность количествен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование маркировки красителей для изучения морфологии нейронов имеет ряд преимуществ по сравнению с методами генетической маркировки клеток. Техника маркировки красителя может свести к минимуму время, необходимое для маркировки и визуализации морфологий моторных нейронов. Процесс маркировки красителя довольно быстро, так как он занимает менее 2 ч и позволяет нам определить контур нейронных проекций. В качестве альтернативы, можно визуализировать aCC моторный нейрон, выбрав линию GAL4, которая выражает дрожжевой GAL...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим членов лаборатории Камиямы за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана NIH R01 NS107558 (м.и., К.Б. и Д.К.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-кратный объективNikonPlan
40-кратный водоиммерсионный объективNikonNIR Apo
капиллярная трубкаFrederick Haer & Co27-31-1
Конфокальный микроскопAndorN/ADragonfly Вращающийся диск Конфокальный
блок Защитное стеклоCorning22x22 мм Квадрат #1
DiDThermoFisherV22886
DiIThermoFisherV22888
DiOThermoFisherV22887
Препарирующий микроскопNikonN/ASMZ-U
Двухсторонняя лентаСкотч665
Dow Corning Высоковакуумная смазкаFisher Sci.14-635-5D
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11252-20
Клетка для сбора яицFlyStuff59-100
FemtoJet 5247Eppendorfсняты с производстваFemtoJet 4i (кат. No 5252000021)
ImageJNIHПрограммное обеспечение для обработки изображений
МикроманипуляторSutterMP-225
Микропипетка для снятия фаскиSutterBV-10-B
Игольчатый съемникNarishigePC-100
Nutri-Fly Порошок виноградного агара Премикс ПакетыFlyStuff47-102
Нейлоновая сетка ФильтрМиллипор
Параформальдегид 16% Раствор, ЭМ классЭлектронная микроскопия Науки15710Любой ЭМ класс
PBSRoche11666789001Продается на sigmaaldrich, в коробке 10x раствор
Photo-Flo 200Kodak146 4510Смачивающий агент
Вертикальный флуоресцентный микроскопNikonN/AEclipse Ci со светодиодным источником света
Виниловая изолентаСкотч6143
VWR Клеточные фильтрыVWR10199-659
ДрожжиFlyStuff62-103Активные сухие дрожжи (RED STAR)

Ссылки

  1. Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
  2. Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).
  3. Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
  4. Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
  5. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).
  6. Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).
  7. Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  9. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
  10. Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
  11. Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
  12. Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
  13. Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
  14. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
  15. Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
  16. Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
  17. Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
  19. Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
  20. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).
  21. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
  22. Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
  23. Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
  24. Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila
Ретроградная трассировка дрозофилических мотонейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.