Методическая статья

Уточнение и изображение Candida Альбиканс Biofilms

20K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60718

⸱

6 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2Department of Pharmacology, Second Military Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Для просмотра и количественной оценки внутренних особенностей биофильмов Candida Albicans мы готовим нетронутые образцы, которые уточняются с помощью сопоставления рефракционного индекса. Затем оптическая секционная микроскопия может быть использована для получения трехмерных данных изображения, хотя и полной толщины биопленки.

Аннотация

Микробный грибОк Candida albicans может претерпеть переход от комменсальной колонизации к вирулентности, которая сильно коррелирует с его способностью переключаться с роста дрожжевой формы к росту гифального. Клетки, инициирующих этот процесс, становятся приверженцами поверхностей, а также друг к другу, что приводит к развитию биопленки колонии. Это обычно происходит не только на поверхности слизистой ткани в дрожжевых инфекций, но и на медицинских имплантатов, таких как катетеры. Хорошо известно, что биопленки клетки устойчивы к противогрибковым препаратам, и что клетки, которые проливают из биопленки может привести к опасным системных инфекций. Биопленки варьируются от сильно полупрозрачных до непрозрачных из-за рефракционной неоднородности. Поэтому грибковые биопленки трудно изучать с помощью оптической микроскопии. Чтобы визуализировать внутренние структурные, клеточные и субклеточные особенности, мы разъясняем фиксированные нетронутые биопленки по шаговой части обмена растворителями до точки оптимального соответствия рефракционного индекса. Для биопленк C. albicans, достаточное уточнение достигается с метилсалицилат (n No 1.537), чтобы конфокальная микроскопия от вершины до основания в 600 мкм биопленки с небольшим затуханием. В этом протоколе визуализации мы описываем фазовую контрастную рефрактометрию, рост лабораторных биопленок, фиксацию, окрашивание, обмен растворителя, установку для конфоковой флуоресценции микроскопии и репрезентативные результаты.

Введение

Candida Albicans является микробный грибок, который, как правило, сопутствующие у людей. Он представляет фундаментальный интерес для биологов, потому что организм имеет множество морфологий. Например, в ответ на определенные экологические сигналы или стрессоры, дрожжевой форме подающий надежды клетки перейдут на нитевидный рост, как перепсечение цепи высокоудлинных клеток, известных как гифы. Переход важен как пример фенотипического выражения перехода между одноклеточной и многоклеточной программой экспрессии генов. Аналогичным образом, C. albicans представляет биомедицинский интерес, поскольку организм является известным оппортунистическим патогеном. Он отвечает за мукозные дрожжевые инфекции, такие как молочница (устный кандидоз), мочеполовой инфекции, и причиной опасных инвазивных или системных инфекций у ослабленных иммунитетом пациентов.

Потенциал вирулентности этого организма тесно связан с его многочисленными морфотипами и другими аспектами его генетической универсальности1,2,3,4. Расширение трубки зародыша, первый видимый этап перехода к росту гифального, происходит с достаточной быстротой, чтобы позволить поглощенные клетки C. albicans вырваться из фагоцитов и тем самым избежать ранней фазы клеточного иммунного ответа хозяина5. Кроме того, нити предшествует и сопровождается большим увеличением клеток к клетке и клеток к поверхности присоединения, что связано с регулируемым выражением нескольких классов белков клеточной стенки, известных как клеи6,7,8,9. В самых разнообразных условиях сочетание присоединения и нити приводит к резкому переходу от планктонного одноклеточного роста к связанного с поверхностью колониального роста, который образует биопленку. Биопленки C. Albicans могут развиваться на обычных имплантированных медицинских устройствах, таких как венозные катетеры. Распространение инфекций может привести, когда такие биопленки начинают бутон от дрожжевой формы клеток и пролить их в циркулирующей крови. Многочисленные исследования показали, что биопленки клетки более устойчивы к противогрибковым препаратам, чем планктонные клетки10,11, которые могут быть отчасти из-за снижения метаболизма12. Кроме того, высокая общая приверженность биопленки может обеспечить якорь, необходимый для эффективного инвазивного роста гифы в ткань хозяина1.

Оптическое прояснение биопленок C. Albicans путем соответствия рефракционного индекса оказало большое влияние на нашу способность визуализировать структуру этого микробного сообщества и обнаружить взаимосвязь между экспрессией генов и фенотипом. Биопленки, выращенные в лаборатории на испытательных поверхностях под жидкой культурой среды для 48 ч появляются как беловатое покрытие, которое достаточно плотное и достаточно толстым, чтобы быть непрозрачным (Рисунок 1). Поэтому многие интересные фенотипические особенности биопленки скрыты от глаз. 24 ч диких биопленок типа, выращенных в YPD, RPMI-1640, или Спайдер среды на 37 градусов по Цельсию диапазоне до 300 мкм толщиной, с 48 ч биопленок часто достигает 500 мкм. Непрозрачность обусловлена рассеянием света, которое возникает из-за рефракционной неоднородности: грибковая клеточная стенка более рефракционна, чем окружающая среда, а цитоплазма немного более рефракционная, чем клеточная стенка. В результате высокой оптической плотности родной биопленки скрывает все структуры более чем на 30 мкм глубиной при просмотре с обычным микроскопом или даже конфокальный сканер (Рисунок 2). Тем не менее, большая степень прояснения может быть достигнуто путем проникновения фиксированных биопленок с высоким рефракционным индексом жидкости, что примерно соответствует рефракции основных клеточных компонентов. После уточнения, визуализация в субмикроном разрешении может быть выполнена путем конфокальной микроскопии через всю толщину практически любого биопленки C. albicans 13. В диких образцах типа, легко увидеть, что биопленки состоят из длинных запутанных гиф, кластеры подающий надежды дрожжевой формы клеток или псевдогифальных клеток, пустоты пространства, и некоторое количество внеклеточной матрицы. Кроме того, биопленки обычно стратифицированы, показывая пространственно вариант морфологических различий в типе клеток, плотности клеток, и наличие подающих надежды или ветвящиеся клетки. Многие вариации в одной или нескольких из этих функций наблюдались в биопленках, разработанных штаммами мутантов14,15. Дополнительно, штаммы репортера показывают на месте пространственные различия в экспрессиигенов 16,9,13. Удивительная степень разъяснения, получаемого с помощью этого относительно простого и недорогого подхода, также позволяет увидеть, что многие биопленки включают апикатические гифы и базальные инвазивные гифы, простирающиеся на миллиметровые расстояния.

В этом протоколе визуализации мы демонстрируем фиксацию, маркировку, разъяснение и визуализацию биопленки C. Albicans с помощью простого маркера клеточной стены в качестве пятна. Происхождение нынешней версии протокола является улучшение ясности мы наблюдали, когда формальдегид фиксированной биопленки были проникли с 97% гликол метакрилат (GMA), который затем полимеризован для встраиваемого биопленки в жесткий пластик, имеющих умеренно высокий рефракционный индекс (n 1.49). Затем мы использовали обычную фазовую контрастную микроскопию и серию рефракционных индексных справочных жидкостей для более точного определения точки разворота контраста (максимальная прозрачность) биопленки(рисунок 3). Для биопленок C. Albicans это произошло близко к n 1.530, что было удивительно высоко, учитывая, что плотная структура белка, такая как кератин волос, лишь немного более рефракционна (1.54-1.55). Хотя это на верхнем конце оптимального диапазона на рисунке 3, мы приняли метил салицилат (масло зимнего зеленого цвета, n 1.537) в текущем протоколе, потому что он уже давно используется в качестве прояснительного агента для микроскопии в эмбриологии и гистологии, он имеет низкую токсичность и низкое давление пара, и он дал отличные результаты в наших испытаниях с использованием умеренно-NA погружения нефти оптики.

Четыре момента должны быть сделаны здесь:

(1) За редким исключением, идеальная ситуация в микроскопии является то, что рефракционный индекс образца должен быть равен рефракционный индекс объективного погружения объектива жидкости17,18,13. Для трехмерных (3D) исследований изображений, где необходима глубокая фокусировка, это всегда важно.

(2) Наш экспериментальный результат для оптимальной очистки (n No 1.525-1.535) немного выше, чем стандартные масла погружения (n 1.515, 1.518) и, следовательно, нарушает точку (1), и таким образом вводит источник сферической аберрации при использовании стандартной масляной оптики погружения. Одним из решений этой проблемы является использование цели, предназначенной для индекса погружения в более высоком диапазоне. Из-за возрождения интереса к образу очищенных образцов, специальные цели с необходимой коррекцией становятся доступными. Другим решением является корректировка индекса прояснения среды до 1,515 или 1,518 путем добавления небольшого количества бутанола (n no 1.399) для оптимальной производительности погружения масла, и принять слегка ухудшившееся ясность.

(3) Микроскопия нетронутых биопленок (и других образцов такого масштаба) требует значительного рабочего расстояния для размещения толщины образца. Это важное практическое соображение. Большое рабочее расстояние ограничивает оптику умеренной численной диафрагмой (NA 0.6-1.25), которая ограничивает разрешение, но также ограничивает тяжесть сферической аберрации.

(4) Оптимальный рефракционный индекс для уточнения может отличаться для других типов фиксированных образцов. Specimens должны быть проверены соответствующим образом с использованием фазового контраста и серии рефракционных индексных справочных жидкостей, как показано на рисунке 3.

Протокол

1. Рост культур биопленки

ВНИМАНИЕ: Candida Albicans является человеческим патогеном. В некоторых учреждениях культура этого организма требует сдерживания BSL-2.

  1. Полоса из выбранной деформации на дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) агар пластины и расти 48 ч при 30 градусах Цельсия.
  2. Выберите одиночные колонии от плиты для того чтобы привить 5 ml среды YPD в пробках культуры 15 mL для ночного аэробного роста (ротатор карусели, 52-55 rpm) на 30 c.
  3. Определить плотность клеток с помощью 40-50-кратного разбавления ночной культуры. Вычислите коэффициент разбавления, необходимый для доведения плотности клеток до 3 х 106 ячеек/мл для силиконовой субстраты, или 0,6-1,2 х 106-6-ти клеток/мл для поверхностных стеклянных поверхностей, обработанных конкановалином-А (ConA) или агглютином из пшеники (WGA) (см. Обсуждение).
  4. Для роста биопленки в 12 хорошо пластины(Рисунок 1), обойтись 2,0 мл стерильной нити среды в каждый колодец, и теплой пластины до 37 градусов по Цельсию в увлажненный инкубатор. Разнообразие носителей будет вызывать нити, более сильно при повышенной температуре (37 градусов по Цельсию) и с добавлением сыворотки. Рекомендуется сыворотка крупного рогатого скота (FBS). Рекомендуемые средства массовой информации YPD, Spider-Mannitol, или RPMI-1640.
  5. С помощью стерильных пинцетов поместите подготовленный субстрат в каждый колодец в разогретую тарелку и выбить пузыри. Добавьте инокулум из ночной культуры, чтобы достичь плотности клеток, рекомендованной в шаге 1.3 в каждом колодце. Один колодец без инокулума служит визуальным пробелом и контролем против загрязнения.
  6. Поместите пластину на орбитальный смеситель с 60 об/мин в увлажненный воздухоплаватель 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут, чтобы дать время для сливк клеток. После 90 мин, удалить средние и неприсоединения клеток, мыть стерильной среды или фосфат-буфера солей (PBS), и место прививки субстраты в культуре блюда или другой многовелл пластины, содержащие прегревной нити среды. С мультивеллными пластинами очень удобно использовать вторую пластину для стирки и третью пластину с 2,0 мл предварительно разогретой среды на скважину, чтобы получить промытую привитированную субстрату. Стерилизовать пинцет перед каждой передачей.
  7. Верните пластину в увлажненный атмосферно-воздушный инкубатор 37 градусов Цельсия и выращивайте биопленки до 48 ч с 60 об/мин орбитальным смешиванием для аэрации. Там должно быть мало планктонского роста в каждой культуре, если развивающаяся биопленка пролить дрожжевой форме клеток. Биопленка, выращенная таким образом, показана на рисунке 1.

2. Обработка образцов для визуализации

ПРЕДЕКТО: Альдегид фиксаторы являются летучими и опасными. Подготовка фиксации разбавления в дым капот, а не в биобезопасности кабинета. Не кладите фиксаторы в инкубаторы, используемые для живых клеток. Работайте с разбавленными фиксаторами в крытой посуде в дымовом капюшоне или хорошо проветриваемых скамейках. Утилизация фиксаторов и пост-фикс овых растворов в качестве опасных отходов.

  1. Приготовьте свежий фиксатор, 4% формальдегида или параформальдегида в PBS, дополнительно с до 2% глютаральдегида. Формалин, разбавленный до 4%, может быть использован для рутинной работы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глютаральдегид, в частности, увеличит широкополосную автофлуоресценцию и может утихать флуоресценцию выразимых тегов, таких как dTomato.
  2. Удалите культурную среду из образца и замените PBS, чтобы разбавить белки сыворотки, или перенести биопленку на ее субстрат в PBS, в течение нескольких минут.
  3. Перенесите образец в фиксатор и установите покрытую тарелку на медленный орбитальный миксер на 20 мин. Продлите срок обработки более толстых образцов (см. Обсуждение). К каждому блюду следует добавить достаточный фиксаторный объем, чтобы погрузить весь рост биопленки, в том числе и на внутренней стороне блюда.
  4. Удалить фиксатор и пополнить блюдо с PBS, чтобы вымыть остаточный фиксатор. Утилизация фиксатора в качестве опасных отходов. Повторите несколько краткосрочных стирки, а затем больше стирки, чтобы время для остаточного фиксатора, чтобы рассеять из биопленки или агар блока. Период стирки зависит от времени, отведенного для фиксации (см. Обсуждение).
  5. Необходимое количество пятен будет зависеть от массы биопленки. Удалите все биопленки из не-образца областях культуры блюдо до окрашивания, или передать фиксированный образец в новое блюдо перед окрашиванием. Не допускайте слива биопленки или высыхания.  Держите его погруженным в PBS.
  6. Добавьте пятно в блюдо (см. Обсуждение) и установите крытое блюдо на медленном орбитальном миксере на ночь (см. Обсуждение). Защитите от света.
  7. Утром, удалить окрашивающий раствор и пополнить блюдо с PBS разбавить несвязанные пятна. Установите блюда на медленном орбитальном миксере, чтобы разложить в течение нескольких часов.

3. Протокол разъяснения: Биопленки на Impermeant Substrata

  1. Уточненные биопленки трудно различить визуально. Поэтому, при желании, отметьте одну сторону каждого субстрата царапиной, чтобы обозначить сторону для прививки.
  2. Используйте помеченные длинные пипетки Pasteur для всех последующих отходов и платежеспособных переносов, чтобы избежать перекрестного загрязнения растворителей.
  3. Используя пинцет, перенесите фиксированную биопленку с PBS на 5 мл 50:50 PBS: метанол в стеклянном флаконе 20 мл с биопленкой вверх. Вручную смешивайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 5 минут (см. Обсуждение).
  4. Удалите растворитель в бутылку отходов, будьте осторожны, чтобы избежать контакта между пипеткой и биопленкой, или биопленкой и флаконом. Аккуратно пополнить 3 мл аккуратного метанола. Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 3 мин.
  5. Удалите растворитель в бутылку с отходами и немедленно пополнить с 5 мл метанола. Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 5-10 мин. Удалите растворитель в бутылку с отходами и немедленно пополнить 3 мл метанола. Биопленки часто выглядят более непрозрачными на данный момент, чем их первоначальный вид.
  6. Удалите растворитель в бутылку отходов, и сразу же пополнить флакон с 5 мл 50:50 метанола: метил салицилат. Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 5-10 мин. Биопленка должна быть полупрозрачной в этом смешанном растворителе.
  7. Удалите растворитель в бутылку с отходами. Аккуратно пополнить флакон с 3 мл аккуратного метилсалицилата (MS). Вручную смешайте с орбитальным движением с интервалом 1 мин в течение 3 мин.
  8. Удалите растворитель в бутылку отходов, и сразу же пополнить с 5 мл аккуратные MS. Ручно перемешать с орбитальным движением на 1 мин интервалы в течение 5-10 минут. На данный момент биопленка должна быть прозрачной. Удалите растворитель в бутылку отходов, и сразу же пополнить флакон с 3 мл аккуратные MS. Обработанная биопленка стабильна в этом растворителе.
  9. Для биопленки на агар (см. Обсуждение) продлить все периоды обмена времени, чтобы для воды и растворителя диффузии, хотя агар. Необходимые периоды времени можно оценить с помощью маломощных рассекающих микроскопов с темным освещением поля для просмотра заранее растворителя в агар. Протокол достигает хорошего уточнения и никаких серьезных эффектов усадки, когда 2% агар используется, но уточнил агар будет конденсироваться, если сжать при обработке с пинцетом. Рекомендуется использовать шпатель.

4. Настройка изображений для конфокальной микроскопии

  1. Следующие шаги для использования перевернутого микроскопа. Используйте растворитель-доказательство блюдо, которое имеет крышку стеклянного дна для проведения перевернутый образец на стадии микроскопа (см. Обсуждение).
  2. Подготовьте прокладки для поддержки перевернутого образца. Используйте небольшие прямоугольники, вырезанные из слайдов микроскопа (толщиной 1000 мкм), крышки (170 мкм), или 13 мм силиконовых колец (330 мкм, см. Таблица материалов), которые могут быть уложены по мере необходимости. Предварительно замочить кольца в метил-салицилат в течение 1 ч, чтобы свести к минимуму фокус дрейфа из-за отеков.
  3. Для биопленки на кремниевом квадрате медицинского сорта инвертировать квадрат (т.е. поверните его на биопленку) и установите его на прокладку в бассейне метил-салицилата в блюде (Рисунок 2). Убедитесь в том, чтобы избежать каких-либо пузырьков ниже образца.
  4. Смонтировать блюдо твердо на сцене микроскопа и сделать масло погруженный контакт с целью (см. Обсуждение).
  5. Отрегулируйте количество MS в тарелке так, что мениск держит образец твердо вниз на прокладке поверхностным натяжением. Поместите каплю MS на верхней части перевернутой квадратной субстратума, чтобы уменьшить рассеяние света от матовой отделки, и накройте блюдо стеклянной пластиной, чтобы ограничить испарение. Подождите несколько минут, пока образец осядет на прокладки до получения изображения.
  6. Используйте передаваемый свет для визуального осмотра поля зрения и определения текущего положения фокусировки относительно апикаических и базальных областей перевернутой биопленки. Установите конденсатор освещающей численную диафрагму (INA) до минимума (закрыть конденсаторную радужную оболочку), чтобы увеличить контрастность, в противном случае уточненная биопленка будет почти невидимой. После этого выключите передаваемый источник света.
  7. Переключитесь на конфокальный флуоресценции и установить нижние и верхние пределы серийного фокуса изображения стек, необходимый для охвата биопленки. Вверх фокус диск ажиотажа, который рекомендуется, сначала покажет выбили клетки, которые поселились на крышку стекла и очень длинные apical гифы, которые опираются на стекло. На верхнем конце последовательности следует увидеть клетки-основатели, прилипаемые к субстратуму у основания биопленки. Установите диаметр пинхола, расстояние пикселей в плоскости изображения и приращение шага фокусировки с использованием общих критериев, изложенных в обсуждении.

Результаты

Биопленки, такие как на рисунке 1, сильно полупрозрачны до непрозрачных, но обычно проясняются и изображения, используя протокол выше. На рисунке 2 показано сильное затухание флуоресценции с глубиной фокуса в фиксированной биопленки в PBS, по сравнению с той же биопленкой после соответствия индекса. Как показано на рисунке 3, используя последовательно неверные растворители увеличения рефракционного индекса, максимум в ясности можно быстро оценить. Это уточняется с помощью обычной фазовой контрастной микроскопии, чтобы найти точку минимального контраста (максимальная прозрачность). Очевидно, что этот оптимальный показатель не достигается за счет однородного сопоставления индекса. Это связано с тем, что субклеточные структуры немного отличаются рефракционным индексом. В этом случае контрастный разворот произошел в клеточной стенке при несколько более низком индексе растворителя, чем в цитоплазме. Для биопленок Candida Albicans оптимальный торопянин приближается к n и 1.530. 48 ч дикий тип и cak1 DX мутант биопленки на рисунке 4A были 500 мкм в толщину, но дрожжевые клетки в базе были изображены почти так же резко, как апикальные клетки. Аналогичным образом, как показано на рисунке 4C,затухание флуоресценции не сильно коррелирует с глубиной фокусировки. На рисунке 5 показаны инвазивные гифы в агаре, сотни микрометров под поверхностной биопленкой. Зрелые инвазивные гифы последовательно производят боковые подающий надежды дрожжей проксималь к септе в гифальной цепи, что приводит к субколониям дрожжеподобных клеток на регулярной основе вдоль инвазивной гифы.

figure-results-1
Рисунок 1: Культуры биопленки до уточнения. Биопленка 24 ч, выращенная из изолята дополненного штамма efg1 (' s. s. c. albicans в 12 скважинной пластине на силиконовой площади в жидкой среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS. Стерильный пробел находится в колодце C4.  Врез показывает вырезать поперечное сечение 96-часовой биопленки дикого типа, выращенного в 6-колойной пластине на 3,75 мм агар базы в той же среде, показывая инвазивных гиф. Обе панели имеют одинаковый масштаб. Шкала бар 2,0 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Улучшение глубокой визуализации путем сопоставления индекса. На рисунке показаны боковые проекции конфокальных стеков изображений из биопленки 48-го природного типа, которая была зафиксирована и окрашена ConA-Alexafluor 594. (A) Образец был изображен в PBS с помощью 63x 1.0 NA прямой цель погружения воды. Затухабыло сильное на глубине фокуса 30 мкм. (B) После уточнения протоколом шаги 3.3-3.8, тот же биопленка была изображена в метилсалицилат с минимальным затуханием с использованием 40x 0,85 NA цель погружения масла. После фонового вычитания и боковой проекции 3D-изображений данные 40x были пространственно перемазаированы в соответствии с данными 63x для сравнения. (C) Схема диаграмма, показывающая перевернутое монтаж очищенного образца (от MS) путем передачи ms в черно-анодированной алюминиевой тарелке с зацементированным стеклянным дном крышки (см. Обсуждение). Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Фазовая контрастная рефрактометрия показывает контрастный разворот клеточных объектов в диапазоне оптимального соответствия индекса. Фиксированные биопленки на крышках были обменены из PBS в метанол, затем в ксилен (n no 1.496). Эти биопленки были затем обменены по одному из ксилена в набор рефракционных индексных справочных жидкостей (Серия E, Лаборатории Cargille, см. Таблица материалов)и визуально изучены бок о бок, чтобы определить диапазон индексов, дающий наивысшую прозрачность. (верхняя панель) Фазовые контрастные изображения: Одна биопленка была последовательно обменяна между ксиленом и узким набором эталонных жидкостей в этом диапазоне. После каждого обмена, то же поле было перемещено и рассматривать, хотя крышка стекла с использованием 40x 0,85 NA Ph2 нефти погружения фазы контрастной цели и Ph2 конденсатор. Все изображения были записаны с той же настройкой лампы и экспозиции камеры для точного отображения изменений. С увеличением индекса разворот контраста впервые наблюдается на n - 1.530 для клеточной стенки, а затем цитоплазме на n й 1.535. Шкала бар 10 мкм. (нижняя панель) График, показывающий минимальную в средней яркости биопленки в точке максимальной прозрачности. Сильное рассеяние света внутри биопленки приводит к тому, что средняя яркость превышает пустое поле. Изолированные ячейки кажутся темнее пустого поля, вплоть до разворота контраста в диапазоне 1.530-1.535. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Глубокая визуализация мутантов и диких биопленок типа C. Albicans. Дикий тип штамма (DAY185) и клеточного цикла, связанного с протеиновой киназой уменьшилось напряжение выражения(cak1 DX)14 были выращены при 37 кс для 48 ч на силиконовой субстрате в жидкой среде YPD. Биопленки были зафиксированы, окрашены ConA-Alexafluor 594, и уточнены с помощью протокола обмена растворителя в метилсалицилат. 3D конфокальная микроскопия показала, что оба биопленки были толщиной 500 мкм. Данные изображения были преобразованы в 32-битный формат в ImageJ или Фиджи (https://imagej.nih.gov/ij/ или http://fiji.sc), затем обработаны с помощью функции Subtract Background с 50-пиксельным радиусом подвижного шара, порогом для установки отрицательных пикселей до нуля, перерезыванием и использованием максимальной интенсивности проекции для получения боковых представлений. (A) Осевые и боковые прогнозы: биопленка дикого типа выросла до толщины 502 мкм, как видно из проекции бокового обзора стека 558-plane confocal изображения. Шкала бар 100 мкм. (левые панели рук) 40-plane осевые проекции от вершины (вверх) к базе (внизу) показывают изменение типов клеток в различных слоях биопленки. Этот пример показал характерную структуру дикого типа: клетки адептов в основании приводят к гифы, которые поднимаются в плотную среднюю зону псевдогифальных и дрожжеподобных клеток. Над средней зоной, гифы вновь появились и привели к кластеров подающих надежды дрожжей. Длинные гифы, замеченные в апиальной зоне, вероятно, распространились на культурную среду в живой биопленке, но сложиться на поверхность биопленки во время обработки образцов. Биопленка cak1 DX выросла до толщины 500 мкм, как видно из проекции бокового обзора стека 556-plane изображения. Этот мутант, который, как известно, претерпевает нитевидный рост в отсутствие индуцирующих стрессов14,произвел совершенно иную архитектуру. Как видно как в боковом, так и в осевом прогнозах (панели правой руки), многие ветвящиеся клетки привели к радиальным наростам. (B) Примеры разветвления гифы в cak1 DX биопленки. Шкала бар 10 мкм. (C) Флуоресценция затухания с глубиной в уточнил дикий тип биопленки была количественно путем маскировки из фоновых пикселей, а затем вычисления среднего цифрового сигнала для всех нефоновых пикселей в каждой плоскости изображения. За исключением акических гифок, которые ярко помечены лектином, не было сильной тенденции затухания с глубиной фокуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Инвазивные гифы в агаре. C. albicans hyphae в поверхностной биопленке будет проникать в агар субстрат на миллиметр расстояния (см. Рисунок 1). После уточнения, инвазивные структуры могут рассматриваться вниз, хотя биопленка, или вверх от нижней части агара. Последнее требует большей рабочей дистанции. Кроме того, после фиксации, но до окрашивания и обмена растворителя, агар может быть сокращен вертикально с кальпелью или лезвием бритвы в 1-2 мм плиты, которые затем могут быть включены на стороне и изображены непосредственно в боковой вид после окрашивания и уточнения. Эта процедура рекомендуется. В этой проекции квадратного поля обзора площадью 213 мкм для кодирования осевого положения на диапазоне 75 мкм: синие объекты находятся рядом, а красные объекты глубже в плоскость страницы. Эта точка зрения показывает, что длинные гифы бутон от боковой дрожжевой формы клеток на полурегулярных интервалах, которые приводят к субколониям. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Достижения в флуоресценционной микроскопии в оптическом сечении, разрешении, скорости, избежании или компенсации аберрации, многоканального приобретения, а также в вычислительной мощности, вызвали возрождение в визуализации нетронутыми образцами. Для фиксированных образцов, как классические, так и новые методы уточнения и расширения оказали значительное влияние19,20,21,22,23,24. В этом случае мы применили быстрый и простой подход к сопоставлению индекса на основе растворителя для изучения структуры грибковых биопленок, которые сильно полупрозрачны, к непрозрачным.

Предыдущие протоколы были протестированы с рядом образцов. В нашей лаборатории биопленки Candida Albicans чаще всего выращиваются на 14 мм квадратов, вырезанных из листа силиконовой резины медицинского класса (см. Таблицу Материалов). Этот субстрат используется потому, что рост pdMS (поли-диметилсилоксана), погруженного в среде жидкой культуры, был установлен в качестве важной модели in vitro для инфекций, связанных с медицинскими имплантатами, особенно в жилых катетерах. Подчеркнутые клетки, инициирующих нити, быстро прилипают к неполярным поверхностям, таким как PDMS. На практике, используемые квадраты, которые были очищены и resterilized в автоклаве (сухой цикл) дают наиболее последовательные биопленки для любого конкретного штамма. Биопленки также обычно выращиваются на крышках стаканов, в крышке стеклянных донных культурных блюд, в стандартных бактериологических полистироловых блюдах и на агаре. Поскольку клетки C. albicans не хорошо прилипают к стеклу, крышку стаканов следует обработать лектином, который свяжет полисахариды клеточной стенки. Мы применяем 40 кл 1 мг/мл ConA или WGA в стерильной воде на каждой поверхности покрытия. После высыхания, крышка стаканы обрабатываются с 40 Зл 1% 1% глютаральдегида в течение 3 минут, чтобы перекрестно белка в нерастворимые пленки. Затем они промывают стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить фиксатор и любой растворимый лектин и высушенный воздухом. При необходимости обработанные крышки стаканов или посуды рестерифицируются под гермицидальной ультрафиолетовой лампой в течение 10 мин.

Толщина протеже повлияет на необходимые инкубационные периоды в протоколах. Фиксированная диффузия в биопленку мощностью 300 мкм требует нескольких минут, чтобы уравновесить. Этот период времени увеличивается как квадрат толщины образца, и должен быть продлен до часа или более для очень толстых биопленок или образцов агар блока, которые могут быть 2-3 мм толщиной. Период равновесия для окрашивания также зависит от толщины образца, как описано для фиксации и вымывания. Однако, поскольку лектины рассеивается медленнее, чем низкой МВт фиксаторов, особенно в агар гель, окрашивание должно быть продлено на ночь. То же самое должно быть сделано для вымывания избыточного пятна.

Пятна различных типов могут быть включены в протоколы. Мы используем пятно клеточной стенки для структурной визуализации, чаще всего Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) или красителя помечены лектин, такие как ConA-Alexafluor 594 или WGA-Alexafluor 594. Следует обратить внимание на валентность белка. Тетрамер ConA может вызвать перекрестное соединение очень гибких гиф в апикатической области биопленки. Это менее очевидно с WGA dimer. Канонические особенности этих маркеров Calcofluor для хитина, ConA для остатков маннозы, и WGA для N-ацетил-D-глюкозамин и сиаловая кислота остатков.

Поскольку протокол обмена растворителям градуируется из PBS или воды, хотя метанол в метилсалицилат, образцы контейнеры должны быть платежеспособными. Метилсалицилат (МС) быстро смягчит полистирол пластичной посуды и медленно смягчит другие пластмассы. Протокол шагов до использования аккуратного метанола может осуществляться в пластичной посуде, но в этот момент в протоколе мы обычно переключаемся на стандартные 20 мл стеклянных флаконов с растворителем. Флаконы удобны для биопленки на силиконовой квадратной субстрате, так как квадраты можно подобрать и перенести с помощью тонкого пинцета. Кроме того, флакон может быть осушена и пополнена плоским квадратом, опираясь на внутреннюю изогнутую поверхность, чтобы биопленка не контактировала со стеклом. Субстрат должен быть биопленкой, когда он погружен в вертикальном флакон. Флаконы отлично подходят для длительного хранения образцов.

В протоколе уточнения более градуированные шаги обмена растворителями сводят к минимуму риск деформации образца из-за эффектов смешивания растворителя. Для скорости и удобства в базовом протоколе, Есть четыре шага: 1) шаг 3.3, PBS до 50:50 PBS: метанол; 2) шаги 3.4 и 3.5, PBS: метанол к опрятной метанолу, 3) шаг 3.6, аккуратный метанол до 50:50 метанол:MS; и 4) шаги 3.7 и 3.8, метанол:MS к опрятному MS. Метанол обеспечивает переходную неправомерность. Однако, поскольку вода и РАССЕЯНный см почти невозможны, важно, чтобы вся вода была вытеснена метанолом до введения какого-либо MS. Кроме того, потому что метанол является весьма неустойчивым, важно, чтобы вытеснить все метанола MS. В противном случае, продолжается испарение остаточного метанола вызовет рефракционные колебания индекса в образце. В течение четырех шагов последовательности, повторяя второй и четвертый шаги, добавив еще одно изменение аккуратный растворитель, или даже третье изменение, рекомендуется. Для особо хрупких образцов изменения растворителя могут быть сформулированы меньшими процентами.

С образцами агар-блока, шаги 3.4 и 3.5 (neat метанол) могут причинить возникновение кристаллов соли внутри агар из-за insolubility остаточных сол ТОС в метаноле. Этого можно избежать с помощью дистиллированной воды (DW) в первом смешанном шаге растворителя вместо PBS для разбавления солей во время воды: метанол обмена. Альтернативная последовательность обмена растворителями для фиксированных биопленок затем состоит из этих шагов: 1) шаг 3.3, перенос образца из PBS в 50:50 DW:метанол (позволяет дополнительное время для диффузии через агар); 2) шаг 3.4, перенос образца от 50:50 DW: метанол в аккуратный метанол (повторите 2x с метанолом как в шаге 3.5); 3) шаг 3.6, перенос образца из метанола в 50:50 метанола: метил салицилат; и 4) шаг 3.7, передача образца от 50:50 метанола: MS аккуратно MS (повторить 2x с MS, как в шаге 3.8).

Поскольку метил-салицилат быстро смягчает полистирол пластичной посуды, мы используем анодированное алюминиевое блюдо с крышкой стеклянного дна, чтобы держать очищенную биопленку на сцене перевернутого микроскопа. Крышка стекла удерживается на месте с использованием УФ-лелечения оптического цемента (Норланд оптический клей #61, см. Таблица материалов). При условии, что MS удаляется в конце дня путем мытья блюда с изопропанол следуют мыльной воды и промывки, цементированные крышка стекла будет служить в течение многих месяцев.

Объективный отбор объективов имеет решающее значение при крупномасштабной визуализации уточненных образцов из-за важности минимизации сферической аберрации и необходимости достаточного рабочего расстояния. У нас есть опыт работы с тремя целями в этих исследованиях. В перевернутой установки микроскопа, мы используем большое рабочее расстояние, умеренное численное отверстие (NA) объективное масло, погруженное под крышкой стекла с биопленкой, погруженной в метилсалицилат в блюде над крышкой стекла. Большая часть нашей работы была выполнена с ахроматической целью серии Зейсс, тип 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, используемый с отрицательным 160-мм фокусным адаптером для номинальной бесконечной совместимости (IC) совместимости. Эта цель первоначально была разработана для нефти погружен просмотра через 1,5 мм микроскоп слайды с 0,35 мм рабочего расстояния25. При использовании со стандартным стеклом крышки (0,17 мм), рабочая дистанция гораздо больше: 1,5 и 0,35-0,17 и 1,68 мм и 1680 мкм. Мы также используем новую цель мультипогружения Зейсса, тип 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat с рабочим расстоянием, превышающим 540 мкм, с коррекцией погружения, установленной на высокой стороне 'масла'. Эта цель очень исправлена и производит превосходное изображение. На вертикальном подставке микроскопа мы использовали новую цель мультипогружения Nikon, тип MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat с рабочим расстоянием, превышающим 5000 мкм (5 мм), также с коррекцией погружения, установленной на высокой стороне «масла» (п. 1.518). Хотя эта цель имеет более низкую NA, чем другие, она имеет то преимущество, что непосредственно погружения в метил-салицилат.

Для оптимизации сбора данных с точки зрения скорости и разрешения, настройки конфокального микроскопа в идеале должны соответствовать как поперечной, так и осевой плотности выборки Nyquist18. Используя обычные критерии, установите диаметр конфокальной пинхола номинально до 1 Airy единицы. В увеличенных координатах,

dP (мкм) - 1,22 х увеличение x (длина волны выбросов в мкм) / NA

Поперечная выборка (расстояние пикселей) не должна превышать (1/2) х лимит разрешения Abbe. В координатах объекта-пространства,

Хх, у й (длина волны выбросов в нм) / (4 NA)

Осевой выборки (фокусный приращение) не должен превышать обратную осевую пропускную способность,

Зз (индекс погружения) x (длина волны выбросов в нм) / (NA2)

Конфокальная оптическая система расширяет пропускную способность микроскопа и обостряет как поперечное, так и осевое разрешение, по крайней мере, на 1 / 2.

Для 40x 0,85 NA цели, которые мы используем чаще всего, см. Таблица 1 для результатов этих формул для 600 нм длины волны выбросов (Alexa Fluor 594).

Формулах 1 / 2 евронабор (типичный)
dP (мкм)34,5 мкм-25 или 50 мкм
Кс, кю176 нм125 нм161 нм
Оз1200 нм848 нм900 нм

Таблица 1: Диаметр конфокальной пинхола, поперечная проба и значения осевой выборки для длины волны эмиссии 600 нм.

Используя вращающийся диск конфокальный сканер с этими настройками и 1,392 х 1040 пикселей сканирование поле, данные из биопленки образцов могут быть приобретены с разумной скоростью и разрешением. Типичные одноцветные 3D-изображения работают 0,35-1,55 ГБ.

Разъяснение носителей в широком использовании охватывает значительный диапазон рефракционных индексов. По темного поля освещения и визуального осмотра, мы обнаружили, что фиксированные C. Albicans биопленки были наиболее прозрачными выше n 1.5. Это было уточнено фазовой контрастной микроскопией до n No 1.530-1.535. По ряду практических причин мы используем метилсалицилат (n no 1.537) в качестве конечного индекса, сопрягаемого растворителем. Хотя обмен растворителями приносит риск деформации образца или других артефактов, клетки в фиксированных, уточненных образцах имеют аналогичные размеры тела клетки, диаметр гифы, и межсептальные размеры длины как живые образцы.

Возможны многочисленные вариации в процессе обмена растворителями (например, использование другого переходного растворителя или другого конечного растворителя). Метанол был выбран из-за его высокой полярности и быстрой диффузии, но этанол был показан, чтобы лучше сохранить красный флуоресцентный белок (RFP) квантовый выход26 в качестве переходного растворителя. Метилсалицилат был выбран для его индекса, умеренной полярности, низкого давления пара и совместимости со многими пятнами, красителями и флуоресцентными белками. Тем не менее, окончательный растворитель с несколько более низким индексом, или смесь метил-салицилата и более низкого индекса растворителя, таких как бутанол, может служить лучше.

Неожиданно, способность видеть через биопленку показывает не только его стратифицированные внутренние особенности, но и помогает в просмотре происхождения расширенных структур, таких как длинные, незапутанные аптические гифы и инвазивные базальные гифы на определенных субстратах. Оппортунистическая вирулентность у C. Albicans зависит от ее генетической универсальности (т.е. перехода к росту гифального, upregulation клеточного субстрата и присоединения клеток, генерации осмолитов для подачек и удлинения клеток, а также использования альтернативных питательных веществ). Hyphal расширение позволяет прорыв отдельных клеток C. Albicans из фагоцитических иммунных клеток, но также имеет важное значение для вторжения. Biofilm адгезии и гифальной запутанности, как представляется, обеспечивают поверхность якорь, необходимые для гифы эффективно вторгнуться в субстрат. Когда этот субстрат является тканью-хозяином, может возникнуть повышенная вирулентность.

Imaging нетронутыми биопленки позволяет огромное количество информативных экспериментов с использованием репортер штаммов для экспрессии генов, модель ткани substrata, и включение других организмов, таких как бактерии, найденные в природных биопленки. Даже в самом простом случае чисто структурной визуализации с пятном клеточной стенки, на месте обнаружены фенотипы, которые затем могут быть количественно и генетически проанализированы.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих интересов раскрывать.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано NIH гранты R01 AI067703, R21 AI100270, и R21 AI135178 А.П. Митчелл. Авторы благодарны Гринфилду 'Kip' Sluder за предоставление дальней рабочей цели погружения нефти, используемой в этой работе, и Даниэлю Шиварски за конфоковую микроскопию с прямым погружением метил-салицилата.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
для биологически опасных отходов
Шкаф биобезопасности с бактерицидной УФ-лампой
Calcofluor White M2R (2,5 мг/мл в метаноле)
Concanavalin A - Alexafluor-594 или другой конъюгат
Дистиллированная водаDW
Дистиллированная вода, стерильная
Этанол, абсолютныйEtOH
Фетальная бычья сыворотка (FBS), стерильная
Фиксирующая бутылка для отходов во вторичной оболочке
Формальдегид 20% в воде, ампулыЭлектронная микроскопия Науки
Альтернативы формальдегиду: порошок параформальдегида, формалин 37%Электронная микроскопия Науки
Вытяжной шкаф
Глутаральдегид 25% в воде, ампулыЭлектронная микроскопия Научный
инкубатор - 30&град; С, с ротационным смесителем (60 об/мин) для культуральных пробирок
Инкубатор - 37 ° град; C, с орбитальным смесителем для культуральных планшетов
Изопропанол 70%iPrOH 70%
Длинноволновая (365 нм) УФ-лампа, 5 ВтCole-Parmer Scientificдля отверждения цемента NOA-61
силиконовый лист, толщина 0,060 дюйма (1,52 мм) BentecMedical, Inc., http://bentecmed.com/Неармированный медицинский силиконовый лист
Метанол 99,9% MeOH
Метилсалицилат 99%MS
Millipore Swinnex 13 мм белые силиконовые кольцевые прокладкиMillipore Corp.
Norland УФ-отверждаемый оптический клей - тип NOA-61Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.comNOA-61
Орбитальный смеситель, настольный
фосфатно-солевой буфер (PBS), стерильные
стандартные жидкости с показателем преломления, n = 1.500 - 1.640 (29 жидкостей, шаг 0.005)Cargille Laboratories, https://cargille.comСерия ECedar Grove, NJ 07009, США
RPMI-1640 базовая среда, HEPES буферная, стерильные
сцинтилляционные флаконы, 20 мл - Wheaton, карбамидная крышка PE конус крышкаFisher Scientific Co.03-341-25Hдля обработки и хранения образцов Бутылка
отходами растворителя во вторичной защитной оболочке
Среда для пауков с маннитолом, стерильная (1% питательного бульона Difco, 0,2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Агглютинин зародышей пшеницы - Alexafluor-594 или другой конъюгат
Дрожжевая пептон-декстроза (YPD) агаровые пластины, стерильные (1% экстракт дрожжей, 2% пептон Bacto, 2% декстроза, 2% агар Bacto)
среда YPD, жидкая, стерильная (1% экстракт дрожжей, 2% пептон Bacto, 2% декстроза)
Контейнер Медицинский SX0001301 лайнер с

Ссылки

  1. Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
  2. Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144(2017).
  3. Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
  4. Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
  5. Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226(2018).
  6. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
  7. Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525(2012).
  8. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
  9. Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
  10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
  11. Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  12. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
  13. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  14. Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487(2016).
  15. Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787(2019).
  16. Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
  17. Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
  18. Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
  19. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  20. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  21. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  22. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
  23. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
  24. Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
  25. Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48(1971).
  26. Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113(2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи