Method Article

Количественная оценка размера печени в Larval Зебрафиш Использование Brightfield микроскопии

DOI:

10.3791/60744

⸱

February 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем метод количественной оценки размера печени у личинок зебры, обеспечивая способ оценки влияния генетических и фармакологических манипуляций на рост и развитие печени.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нескольких трансгенных моделях зебры гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) гепатомегалия может наблюдаться на ранних личиночных стадиях. Количественная оценка размера личинки печени в моделях HCC зебрафиш обеспечивает возможность быстрой оценки воздействия лекарств и других манипуляций на фенотип, связанный с онкогеном. Здесь мы покажем, как исправить личинки зебры, вскрыть ткани, окружающие печень, фотографировать печень с помощью ярко-поляной микроскопии, измерять область печени и анализировать результаты. Этот протокол обеспечивает быструю и точную количественную оценку размера печени. Поскольку этот метод включает в себя измерение площади печени, он может недооценивать различия в объеме печени, и дополнительные методологии необходимы для различать изменения в размере клеток и изменения в количестве клеток. Техника вскрытия, описанная здесь, является отличным инструментом для визуализации печени, кишечника и поджелудочной железы в их естественных положениях для множества приложений вниз по течению, включая оленивость иммунофлюоресценции и гибридизацию на месте. Описанная стратегия количественной оценки размеров личиночной печени применима ко многим аспектам развития и регенерации печени.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) является наиболее распространенной первичной злокачественности печени1 и третьей ведущей причиной смертности, связанной с раком2. Чтобы лучше понять механизмы гепатокарциногенеза и определить потенциальные терапии HCC, мы и другие разработали трансгенные зебры, в которых гепатоцитов конкретных выражение онкогенов, таких как з-катенин3,4, Крас (V12)5,6, Myc7, или Yap18 приводит к HCC у взрослых животных. В этих зебры, увеличение печени отмечается уже в 6 дней после оплодотворения (dpf), обеспечивая поверхностную платформу для тестирования воздействия наркотиков и генетических изменений на онкогена инициативе печени разрастание. Точное и точное измерение размера личинки печени имеет важное значение для определения последствий этих манипуляций.

Размер и форма печени могут быть оценены полуколичественно в фиксированных личинок зебры по маркировке CY3-SA9 или в живых личинок зебры с использованием гепатоцитов конкретных флуоресцентных репортеров и флуоресценции вскрытия микроскопии5,6. Последний метод является относительно быстрым, и его отсутствие точности может быть решена путем фотографирования и измерения площади каждой печени с помощью программного обеспечения обработки изображений7,10. Тем не менее, это может быть технически сложным, чтобы равномерно положение всех живых личинок в эксперименте, так что двумерная область печени является точное представление размера печени. Аналогичный метод для количественной оценки размера печени включает в себя использование светлиста флуоресценции микроскопии для количественной личинки печени объем8, которые могут быть более точными для обнаружения различий в размерах, когда печень расширяется неравномерно в различных измерениях. Флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) может быть использован для подсчета числа флуоресцентно помечены гепатоцитов и других типов клеток печени в личиночных печени8,11. При этом методе личиночная печень объединяются и разобщены, поэтому теряется информация об отдельных размерах и форме печени. В сочетании с другим методом определения размера печени, FACS позволяет дифференцировать между увеличением количества клеток (гиперплазия) и увеличение размера клеток (гипертрофия). Все эти методы используют дорогие технологии флуоресценции (микроскоп или сортировка клеток) и, за исключением маркировки CY3-SA, требуют маркировки гепатоцитов флуоресцентным репортером.

Здесь мы подробно описываем метод количественной оценки личинки зебры области печени с использованием ярко-поля микроскопии и обработки изображений программного обеспечения3,12,13,14. Этот протокол позволяет точно определить область отдельных печени на месте без использования флуоресценции микроскопии. При анализе размера печени, мы слепых личности изображения, чтобы уменьшить предвзятость следователя и улучшить научную строгость15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования на животных проводятся в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата

1. Фиксация лирва

  1. В 3-7 дней после оплодотворения (dpf), эвтаназии личинок с трикаин метанесульфонат (0,03%) и собирать до 15 личинок в трубку 2 мл с помощью стеклянной пипетки и пипетки насоса.
  2. Вымойте личинки дважды с 1 мл холода (4 КК) 1x фосфат-буфера солей (PBS) на льду. Для каждой стирки, удалить как можно больше жидкости из трубки со стеклянной пипеткой и пипеткой насоса, а затем добавить 1 мл холодного PBS в трубку.
  3. Удалите как можно больше PBS с помощью стеклянной пипетки и насоса пипетки, и добавьте 1 мл холодного (4 кВ) 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
    ВНИМАНИЕ: ПФА является раздражителем и подозреваемым канцерогеном. Перчатки следует носить при обращении с PFA, а концентрированные растворы должны быть обработаны в химическом капоте дыма.
  4. Инкубировать при 4 градусах по крайней мере на ночь (но до нескольких месяцев) с нежным раскачиванием.

2. Рассекающие ткани, окружающие печень

  1. Удалите личинки из PFA, прополоскнив 3x с 1 мл холодного (4 кВ) PBS и качалки в течение 5 минут между полосками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, чтобы держать промытые личинки в PBS в течение дня или двух при 4 градусах Цельсия.
  2. Pipette несколько личинок в PBS в один колодец 9-хорошо круглых нижней стеклянной тарелке.
  3. Удалить кожу, окружающую печень.
    1. Используйте мелкие щипцы, чтобы держать личинки на спине (живот вверх), захватповав по обе стороны головы как можно мягче. Затем используйте очень тонкие щипки в другой руке, чтобы захватить кожу только над сердцем.
    2. Потяните кожу вниз по диагонали к хвосту рыбы и нижней части блюда на левой или правой стороне рыбы. Повторите для другой стороны (правая или левая сторона).
    3. Продолжить захвата лоскути кожи и потянув вниз / назад, пока все кожи и меланофоры над лежащими или вблизи печени были удалены.
  4. Удалите желток, если присутствует.
    1. Для 5-6 dpf личинок, снять желток в один кусок, держа рыбу с тонкими щипцы на спине и с помощью очень тонкой щипцы, чтобы подпрыгивая желток мягко.
    2. Для личинок dpf 3-4 dpf, соскребите желток на куски. Держите рыбу с тонкими щипками на спине и использовать очень тонкие щипцы, чтобы погладить желток, начиная с брюшной стороны.
  5. Поместите расчлененные личинки в свежий холодный PBS с помощью стеклянной пипетки и пипетки насоса.

3. Визуализация

  1. Чтобы смонтировать личинки, вылейте несколько мл 3% метилцеллюлозы на крышку чистой пластиковой чашки Петри.
  2. Используйте стеклянный пипетка и пипетка насос, чтобы добавить личинки в метил целлюлозы, добавив, как мало PBS с личинками, как это возможно.
  3. Под рассекающим микроскопом при низком увеличении, используйте тонкие щипцы, чтобы сориентировать рыбу, чтобы они лежали на правой стороне, лицом влево.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рыба ориентирована идеально на их стороне или печени измерений не может быть точным.
  4. Сфотографировать каждую рыбу.
    1. Подтвердите, что рыба, которую нужно сфотографировать, выровнена идеально, одним глазом прямо на другом глазу. При необходимости используйте тонкие щипцдляния, чтобы слегка наживать на голове или хвосте рыбы, чтобы отрегулировать ориентацию. Если хвост рыбы согнут, удалите хвост, защипывая его силой с щипцы, чтобы удалить его, чтобы рыба лежала плашмя.
    2. Увеличить до высокого увеличения и сосредоточиться на печени, убедившись, что контур печени хорошо видны.
    3. Прикрепите картинку и сохраните файл.
    4. Повторите для всех рыб, убедившись, что увеличение то же самое для каждой картины.
    5. Сфотографировать микрометр с помощью того же увеличения (см. Рисунок 2H).

4. Анализ изображений

  1. Измерьте область печени каждой рыбы с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
    1. Слепой все фотографии печени, чтобы избежать потенциальных предубеждений следователя и содействовать научной строгости15. Этот шаг может быть сделан вручную другим членом лаборатории или с помощью компьютерной программы(Дополнительный материал). Переименуйте файлы случайным образом и создавайте «файл рандомизации», содержащий список исходных имен файлов и соответствующие ослепленные имена файлов.
    2. Откройте рандомизированные файлы по порядку, начиная с файла 1.
    3. Выберите инструмент выбора от руки и наброски каждой печени.
    4. Нажмите Ctrl-M для измерения площади каждой печени.
    5. Для любой печени, которые не могут быть точно измерены, вставьте измерение заполнителя (очень маленький или очень большой, так что это может быть легко исключено позже).
    6. Сохранить измерения в текстовом файле ("файл измерений").
  2. Оон-слепой и анализ данных
    1. Открыть "файл измерений" и "файл рандомизации" в программе электронной таблицы.
    2. Вставьте новую колонку в "файл измерений" и добавьте исходные имена файлов для ослепленных файлов, используя "файл рандомизации". Сохранить этот файл как "файл неслепых измерений".
    3. Сортировать данные по первоначальному имени файла.
    4. Не забудьте исключить любые измерения печени, для которых фотографии были недостаточными (см. Рисунок 2A-G).
    5. При необходимости преобразуйте значения измерений в желаемую шкалу (мм2,например).
      1. Откройте панель масштаба в программном обеспечении для обработки изображений.
      2. Используйте инструмент прямой линии для измерения 1 мм на панели масштаба. Программное обеспечение для обработки изображений будет измерять в тех же единицах, что и печень (пиксели), давая коэффициент конверсии.
      3. Используйте коэффициент преобразования для преобразования измерений в "файл неслепых измерений".
    6. Используя программу электронной таблицы или вставляя данные в программное обеспечение для графиков и статистики, определите среднее и стандартное отклонение и вычислите значение p(s).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансгенные зебрафиш, выражающие гепатоцитов конкретных активированный катенин (Tg (fabp10a:pt-й-кошка) зебры)3 и не-трансгенных братьев и сестер контроля были усыплена в 6 dpf и области печени была количественно с помощью яркого поля микроскопии и программного обеспечения для обработки изображений. Трансгенные зебры значительно увеличили размер печени (0,0006 см2) по сравнению с их нетрансгенными братьями и сестрами (0,0004 см2, р/з; 0,0001;

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная оценка размера печени имеет решающее значение в исследованиях, направленных на понимание развития печени, регенерации и онкогенеза. Описанный здесь протокол является относительно быстрой, легкой и дешевой техникой количественной оценки размера печени у личинок зебры. Осуществление надлежащей осторожности при выполнении некоторых аспектов протокола может помочь в повышении точности результатов и снижении разочарования.

Правильная фиксация личинок имеет решающее значение для получ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы отметить Моурин Хоббс и централизованный ресурс животных зебрафиш (КЗАР) в Университете штата юта за предоставление зебры, лабораторное пространство и оборудование для проведения части этого исследования. Расширение ЦАР частично поддерживается грантом NIH No 1G20OD018369-01. Мы также хотели бы поблагодарить Родни Стюарт, Хлоя Лим, Лэнс Грэм, Коди Джеймс, Гарретт Никум, и Хантсман институт рака (HCI) Зебрафиш фонда для лечения зебры. Мы хотели бы поблагодарить Кеннета Компасса за помощь в программировании R. Эта работа была частично профинансирована грантами Фонда рака Хантсмана (в сочетании с грантом P30 CA042014, присужденным Институту рака Хантсмана) (KJE) и NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Камера для препарирования микроскопаLeica, например
Препарирующий микроскопLeica, например
щипцы Fine (Dumont #5)Fine Science Tools11254-20
Стеклянные пипеткиVWR14672-608
Программное обеспечение для анализа изображенийImage J/FIJIImageJ/FIJI можно загрузить бесплатно: https://imagej.net/Welcome
МетилцеллюлозаSigmaM0387
ПараформальдегидSigma AldrichP6148
Фосфатно-солевой буферРазличные поставщики
Пипеточный насосVWR53502-233
Пластиковые чашки ПетриСША Scientific Inc2906
Pyrex 9-луночная стеклянная тарелка с круглым дномVWR89090-482
Программное обеспечение для ослепления файловR projectR можно скачать бесплатно: https://www.r-project.org/
Scientific программное обеспечение для построения графиков и статистикиGraphPad Prism
Программа для работы с электронными таблицамиMicrosoft Excel
Трикаин метансульфонат (Трикаин-S)Western Chemical200-226
Очень тонкие (Dumont #55) щипцыFine Science Tools11255-20

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liver Size QuantificationBrightfield MicroscopyZebrafish LarvaeTissue DissectionImage AnalysisPFA FixationMethylcellulose MountingFreehand SelectionScale Bar CalibrationHepatocellular Carcinoma

Related Articles