Целью данного метода является определение плотности CR1 в эритроцитах любого предмета путем сравнения с тремя предметами, плотность которых известна плотность эритроцита CR1. Метод использует цитометрию потока после иммуностоцинирования эритроцитов испытуемых моноклональным антителом, в сочетании с усиленной системой с использованием фикоэритрина (ПЭ).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение эритроцитов дополнение рецептор ато 1 Использование потока цитометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
CR1 (CD35, Дополнение Рецептор типа 1 для C3b/C4b) представляет собой большой молекулярный вес мембраны гликопротеин около 200 kDa, который контролирует дополнение активации, транспортирует иммунные комплексы, и участвует в гуморальных и клеточных иммунных реакций. CR1 присутствует на поверхности многих типов клеток, в том числе эритроцитов, и экспонаты полиморфизмов в длину, структуру (Knops, или KN, группа крови), и плотность. Средняя плотность CR1 на эритроцит (CR1/E) составляет 500 молекул на эритроцит. Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Мы представляем здесь надежный метод цитометрии потока для измерения плотности CR1/E, в том числе в субъектах, выражающих низкую плотность, с помощью усиливающейся системы иммуностоинга. Этот метод позволил нам показать снижение экспрессии ЭРитроцита CR1 при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера (АД), системная волчанка эритематоза (СКВ), СПИД или малярия.
Введение
CR1 (дополнение рецептора типа 1, CD35) является 200 kDa трансмембранного гликопротеина присутствует на поверхности многих типов клеток, таких как эритроциты1, B лимфоцитов2, моноцитные клетки, некоторые Т-клетки, фолликулярные дендритные клетки3, фетальные астроциты4, и glomerular podocytes5. CR1 вмешиваясь в его лиганды C3b, C4b, C3bi6,,7,,8,9, подразделение первого компонента дополнения, C1q10 и M....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол по сбору и обработке крови человека был рассмотрен и утвержден региональным комитетом по этике (CPP Est II), а протоколномер 2011-A00594-37. Поскольку в следующем протоколе описывается обработка человеческой крови, должны соблюдаться институциональные руководящие принципы по утилизации биоопасных материалов. Оборудование для обеспечения безопасности лабораторий, такое как лабораторные пальто и перчатки, следует носить.
1. Стила эритроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: За день до обработки, подготовить pbS-BSA буфер с фосфатами буферного сольного раствора (PBS), содержащий 0,15% бычьего сыворотки альбумина (BSA) и поместите....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эритроциты трех субъектов, плотность которых CR1 известна ("низкий" предмет (180 CR1/E), "средний" предмет No646 CR1/E и "высокий" предмет No 966 CR1/E), а также двух субъектов, плотность CR1 которых должна была быть определена иммунопрепаратами, примыкающих к флюторной системе. В начале плотность CR1 испытуемых из низкого высокого диапазона была определена методом Scatchard29 с использованием радиомаркированных антител. Определенные стандарты (низкие, средние и высокие) использовались для кривой .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несколько методов доступны для определения плотности эритроцита CR1 (CR1/E). Первыми методами были агглютинация красных кровяных телец анти-CR1 антител31 и образование розетов в присутствии эритроцитов, покрытых C3b32. Эти рудиментарные методы были быстро заменены иммуностоинга методы с использованием радиомаркировки анти-CR1 антител1,33. Также можно измерить концентрацию CR1 в мембранных экстрактах с помощью фермен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Благодарим всех членов URCACyt, тет-цитометрии технической платформы, сотрудников кафедры иммунологии, а также сотрудников кафедры внутренней медицины и гериатрии, которые внесли свой вклад в оптимизацию и проверку протокола. Эта работа финансировалась больницами Университета Реймса (грант AOL11UF9156).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1000E Барьерный наконечник | Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Франция | 2079E | Образец пипетирования |
| 1-100 &микро; L Скошенный, наконечник фильтра | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Германия | S1120-1840 | образец пипетирования |
| Биотинилированное моноклональное антитело против CR1 (J3D3) | Домашнее производство некоммерческого моноклонального антитела, любезно предоставлено доктором Дж. Куком | иммуноокрашивание | |
| Защита блузки | Бовин | ||
| сывороточный альбумин (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Иллкирх, Франция | 15260037 | цитометрии |
| Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Франция | 11176917 | центрифугирование | |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция | 340345 | цитометрия |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | Установка стоечного |
| цитометра & Набор бусин для слежения | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция | 655051 | цитометрия |
| Раствор формальдегида 36,5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, Франция | F8775-25ML | Фиксация |
| 10 & микро; L Градуированный, наконечник фильтра | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Германия | S1121-3810 | пипетирование образцов |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция | 647788 | цитометрия |
| Microman капиллярные поршни | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | пипетирование образцов |
| Micronic 1,40 мл пробирки с круглым дном | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | смесь |
| Микропипетка Microman - тип M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | образец пипетки |
| Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Франция | 10010031 | цитометрия |
| Пипетка PS 325 мм, 10 мл | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | образец пипетки |
| без порошка нитрил Exam перчатки | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, США | 486802 | защиты образцов |
| Ссылка 2 пипетки, 0,5-10 &; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция | 4920000024 | дозатор для отбора проб |
| Reference 2 pipette, 20-100 &; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция | 4920000059 | дозирование проб |
| Reference 2 pipette, 100-1000 &; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция | 4920000083 | пипетирование проб |
| Раствор для полоскания | BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция | 340346 | цитометрия |
| Круглая донная пробирка | Sarstedt, F-70150 Marnay, Франция | 55.1579 | цитометрия |
| Safe-Lock Tubes, 1,5 мл | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция | 0030120086 | смесь |
| стрептавидин R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, Франция | AS-60669 | иммуноокрашивание |
| Конические центрифужные пробирки 50 мл | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Франция | 10203001 | смесь |
| Вектор антистрептавидиновый биотин | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, Франция | BA-0500 | иммуноокрашивание |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Богемия, Нью-Йорк 111716, США | Смесь SI-0236 |
Ссылки
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
