Измерение эритроцитов дополнение рецептор ато 1 Использование потока цитометрии

Summary

Целью данного метода является определение плотности CR1 в эритроцитах любого предмета путем сравнения с тремя предметами, плотность которых известна плотность эритроцита CR1. Метод использует цитометрию потока после иммуностоцинирования эритроцитов испытуемых моноклональным антителом, в сочетании с усиленной системой с использованием фикоэритрина (ПЭ).

Abstract

CR1 (CD35, Дополнение Рецептор типа 1 для C3b/C4b) представляет собой большой молекулярный вес мембраны гликопротеин около 200 kDa, который контролирует дополнение активации, транспортирует иммунные комплексы, и участвует в гуморальных и клеточных иммунных реакций. CR1 присутствует на поверхности многих типов клеток, в том числе эритроцитов, и экспонаты полиморфизмов в длину, структуру (Knops, или KN, группа крови), и плотность. Средняя плотность CR1 на эритроцит (CR1/E) составляет 500 молекул на эритроцит. Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Мы представляем здесь надежный метод цитометрии потока для измерения плотности CR1/E, в том числе в субъектах, выражающих низкую плотность, с помощью усиливающейся системы иммуностоинга. Этот метод позволил нам показать снижение экспрессии ЭРитроцита CR1 при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера (АД), системная волчанка эритематоза (СКВ), СПИД или малярия.

Introduction

CR1 (дополнение рецептора типа 1, CD35) является 200 kDa трансмембранного гликопротеина присутствует на поверхности многих типов клеток, таких как эритроциты¹, B лимфоцитов², моноцитные клетки, некоторые Т-клетки, фолликулярные дендритные клетки³, фетальные астроциты⁴, и glomerular podocytes⁵. CR1 вмешиваясь в его лиганды C3b, C4b, C3bi^6,,7,,8,9, подразделение первого компонента дополнения, C1q¹⁰ и MBL (манна-связывающий лектин)¹¹ подавляет активацию дополнения и участвует в гуморальном и клеточном иммунном ответе.

У приматов, в том числе людей, эритроцит CR1 участвует в транспортировке иммунных комплексов в печень и селезенку, очищает кровь и предотвращает их накопление в уязвимых тканях, таких как кожа или почки^12,13,14. Это явление иммунной адгезии между иммунными комплексами и эритроцитами зависит от количества молекул CR1^15. У человека средняя плотность CR1/E составляет всего 500 (т.е. 500 молекул CR1 на эритроцит). Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Некоторые лица "нулевой" фенотип выразить менее 20 CR1/E¹⁶.

Плотность CR1/E регулируется двумя содоминирующими аутосомными аллелями, связанными с точечной мутацией в интронном 27 кодирования гена для CR1'1^17,18. Эта мутация создает дополнительный узел ограничения для фермента HindIII. Фрагменты ограничения, полученные после пищеварения с HindIII в данном случае 7,4 кб для аллеля, связанного с сильным выражением CR1 (H: high allele) и 6,9 кб для аллеля, связанного с низким выражением CR1 (L: низкий аллель). Эта связь встречается у кавказцев и азиатов, но не у людей африканского происхождения¹⁹.

Уровень экспрессии эритроцита CR1 также коррелирует с наличием точечных нуклеотидных мутаций в экзоне 13 кодирования SCR 10 (I643T) и в экзоне 19 кодирования SCR16 (981H). Он высок в гомозиготных 643I/981 "и низкий в гомозиготных 643T/981H лиц²⁰. Таким образом, "низкие" лица выражают около 150 CR1/E, "средние" лица выражают около 500 CR1/E, а "высокие" лица выражают около 1000 CR1/E.

В дополнение к этому полиморфизму плотности эритроцита, CR1 характеризуется полиморфизмом длины, соответствующим четырем аллотипам разных размеров: CR1'1 (190 kDa), CR1'2 (220 kDa), CR1'3 (160 kDa) и CR1'4 (250 kDa)²¹ и антигенийский антигенный^{антигенистый антигенный антигенный антиген.}

Мы представляем наш метод, основанный на цитометрии потока, чтобы определить плотность CR1/E. Используя три предмета, плотность которых известна как CR1/E, выражая низкий уровень плотности (180 CR1/E), средний уровень плотности (646 CR1/E), и высокий уровень плотности (966 CR1/E), легко измерить среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) их эритроцитов или красных кровяных телец (РБК) Затем можно построить стандартную линию, представляющую МФО в зависимости от плотности CR1/E. Измеряя МФО субъектов, плотность CR1/E не известна, и сравнивая ее с этой стандартной линией, можно определить плотность CR1/E. Этот метод был использован в течение многих лет в лаборатории, и позволило нам обнаружить снижение экспрессии эритроцитов CR1 во многих патологиях, таких как системная волчанка эритематоза (СКВ)²³, Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)²⁴, малярия²⁵, и недавно болезнь Альцгеймера (AD)^26,27. Разработка препаратов, нацеленных на CR1 в паре с эритроцитами, как и в случае антитромботических препаратов²⁸ требует оценки плотности CR1/E, а также наличия надежной техники количественной оценки CR1.

Представленный протокол проходит в singlicate. Он адаптируется для определения плотности CR1/E на многих людей, использующих конкретные коммерчески доступные 96 пластин скважин (см. Таблицу Материалов). С этой целью, это легко адаптировать наш метод к любой 96 хорошо пластины. Для каждого образца на один колодец распределяется клеточная суспензия эритроцитов (0,5 х 10⁶-1 х 10⁶ эритроцитов). Для каждого колодца сначала добавляются первичные анти-CR1 антитела, затем стрептавидин ПЭ, вторичное антиорганизмы против стрептавидина, и снова стрептавидиновые ПЭ, использующие те же разбавления, что и наш метод, но путем адаптации объемов и соблюдения пропорциональности.

Образцы крови, взятые у субъектов диапазона и от предметов, которые должны быть количественно оценены для CR1, должны быть взяты в то же время, храниться в холодильнике при 4 градусах Цельсия и обрабатываться при 4 градусах Цельсия (на льду и/или в холодильнике).

Protocol

Протокол по сбору и обработке крови человека был рассмотрен и утвержден региональным комитетом по этике (CPP Est II), а протоколномер 2011-A00594-37. Поскольку в следующем протоколе описывается обработка человеческой крови, должны соблюдаться институциональные руководящие принципы по утилизации биоопасных материалов. Оборудование для обеспечения безопасности лабораторий, такое как лабораторные пальто и перчатки, следует носить.

1. Стила эритроцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: За день до обработки, подготовить pbS-BSA буфер с фосфатами буферного сольного раствора (PBS), содержащий 0,15% бычьего сыворотки альбумина (BSA) и поместите его в холодильник при 4 градусах Цельсия. Этот буфер будет использоваться в качестве буфера для стирки и буфера разбавления.

1. Пипетка 20 мл PBS-BSA в трубку 50 мл.
2. Аспират 250 л этиленденамин тетраацетическая кислота (ЭДТА) антикоагулят всю кровь из трубок для хранения крови и добавить в трубку, содержащую 20 мл PBS-BSA. Закройте трубку, завинчивая крышку. Смешайте осторожно, инвертируя трубку 2x.
3. Центрифуга трубки в течение 10 минут при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант с помощью 10 мл пипетки. Отдохните гранулы в остаточном объеме супернатанта нежным и осторожным пипеткой.
4. Добавьте 20 мл холодного PBS-BSA (4 кВ) в трубку, содержащую гранулы. Центрифуга трубки в течение 10 минут при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант с помощью 10 мл пипетки.
5. Добавьте 20 мл холодного PBS-BSA (4 кВ) в трубку, содержащую гранулы. Центрифуга трубки в течение 10 минут при 4 КК при 430 х г. Оставьте трубку в центрифуге при 4 градусах по Цельсию и перейдите в раздел 2.

2. Разбавление эритроцитов

1. Пипетка 3 мл холодной PBS-BSA в трубку 50 мл и хранить его при 4 градусах По с на стойке во льду.
2. Положите центрифугедную трубку, содержащую эритроциты (шаг 1.4) на стойку, помещенную во льду.
3. Пипетка 8 л гранулированных эритроцитов с помощью пипетки и добавить в трубку 50 мл, содержащую 3 мл PBS-BSA для получения разбавления эритроцита. Смешайте трубку осторожно вручную, чтобы получить однородную клеточную подвеску эритроцитов.

3. Эритроцит иммуностоина

1. Пипетка 100 л эритроцитов разбавления (получено в разделе 4) и добавить к 1,4 мл труб.
2. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Во время центрифугации подготовьте разбавление биотинилапортовых анти-CR1 J3D3 антитела миочприза в концентрации 0,05 мкг/л в буфере PBS-BSA.
3. Как только центрифугация будет сделана, удалите и отбросьте супернатант.
4. Добавьте 20 зл биотининатированных анти-CR1 J3D3 непосредственно к грануле. Чтобы подготовить отрицательный контроль, добавьте 20 юл буфера PBS-BSA вместо. Смешайте трубки осторожно и инкубировать в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия.
5. После 45 минут инкубации добавьте в трубки 750 кЛ PBS-BSA. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите.
6. В то же время, подготовить 1:10 разбавления стрептавидин-фикерин разбавленной в PBS-BSA буфера. Пипетка 20 л из 1:10 разбавления стрептавидина-фикоэритрина и добавить в трубки. Смешайте трубки осторожно и инкубировать в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия.
7. Добавьте 750 кл буфера PBS-BSA в трубки. Хорошо перемешайте и центрифугу в течение 5 мин при 4 кв С при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите.
8. Во время центрифугации, подготовить 1:100 разбавления биотинилаповых антистрептавидина антитела разбавленной в буфере PBS-BSA.
9. Как только центрифугация будет сделана, удалите и отбросьте супернатант.
10. Пипетка 20 л 1:100 разбавления биотинилаповых антистрептавидина в трубки. Смешайте трубки осторожно. Инкубировать трубки в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия.
11. После 45 минут инкубации, пипетка 750 л буфера PBS-BSA и добавить в трубки. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите.
12. Пипетка 20 л из 1:10 разбавления стрептавидина-фикоэритрина и добавить в трубки. Смешайте трубки осторожно. Инкубировать трубки в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия.
13. Пипетка 750 л буфера PBS-BSA и добавить в трубки. Хорошо перемешать и центрифуги труб в течение 5 мин при 4 КК при 430 х г. Удалите и отбросьте супернатант. Повторите этот шаг 2x.

4. Иммуноокрашенная фиксация эритроцита

1. Во время последней центрифугации, подготовить буфер фиксации, 1:100 разбавления 37% формальдегида с помощью стирального буфера PBS-BSA.
2. Пипетка 450 л фиксационного буфера и добавить в иммуноокрашенные эритроцитные трубки (от шага 3.13) при вихре в течение 5 с.
3. Pipette все фиксированные клетки в 5 мл круглых нижних труб и хранить в холодильнике.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь до 48 ч.

5. Анализ цитометрии потока окрашенных эритроцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется обратиться к руководству оператора для цитометра (см. Таблица материалов), чтобы знать, как выполнять цитометрические показания. Предлагаемые ниже параметры применяются к используемому инструменту и должны быть оптимизированы для каждого цитометра.

1. Включите цитометр потока, затем включите компьютер. Пусть температура оптической системы стабилизируется, оставляя ее на 30 мин. Проверьте окно цитометра в программном обеспечении, чтобы убедиться, что цитометр подключен к рабочей станции (сообщение Cytometer Connected отображается).
2. Убедитесь, что буферный контейнер заполнен и что контейнер для отходов пуст. Удалите пузырьки воздуха в буферном фильтре и буферной линии с помощью системы очистки. Прайм жидкости системы, нажав кнопку Prime на консоли цитометра. Подождите, пока индикатор ный свет не изменится с красного на зеленый.
3. Для очистки жидкости установите трубку, содержащую 3 мл чистящего раствора, на порт для впрыска образца и дайте очистке раствора работать в течение 5 минут с высокой частотой потока образцов. Повторите это с раствором промыть дистиллированной водой. Оставьте трубку, содержащую воду, в порте для впрыска образца.
4. Для подготовки калибровочных бусин, пипетка 400 л PBS в нижней части круглой нижней трубки. Смешайте запасы биса сильно вихрем для 30 s. Добавить падение в круглую нижнюю трубку, содержащую PBS. Тщательно перемешайте, загоняя 30 с.
5. Выполнить проверку производительности. Откройте модуль настройки и слежения цитометра в программном обеспечении(рисунок 1A). Убедитесь, что конфигурация цитометра является правильной для эксперимента с использованием PE иммуностоинга. Убедитесь, что калибровка партии биса является правильной с конфигурацией.
6. Установите трубку из биса на порт впрыска образца и дайте ей работать с низкой частотой потока образца. Выполнить проверку производительности, которая занимает около 5 минут для завершения). Как только проверка производительности завершена, убедитесь, что производительность цитометра является удовлетворительной(рисунок 1B). Закройте модуль настройки и слежения за цитометром в программном обеспечении.
7. Чтобы настроить эксперимент и создать настройки приложения, нажмите кнопку New Experiment на панели инструментов браузера и откройте новый эксперимент. Укажите параметры, выбрав соответствующие настройки цитометра: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) и PE из выпадающего меню эксперимента(рисунок 1C). Выберите линейный режим для параметра FSC и режим Logarithm для параметров SSC и PE.
8. В открытом эксперименте выберите настройки цитометра (рисунок 1D),затем выберите настройки приложенияи создайте глобальную таблицу(рисунок 1E). Используйте серые коробки и перекрестия для руководства оптимизации.
9. Загрузите неокрашенную трубку управления на цитометр и запустите Приобретение. Убедитесь, что население, представляющие интерес (т.е. РБК) находится в масштабе за счет оптимизации напряжения FSC и SSC. Оптимизация порогового значения FSC для ликвидации мусора, не мешая населению, интересуемому.
10. Нарисуйте ворота вокруг РБК на участке FSC против SSC. Отображение популяции РБК в точечном участке фторесценции PE. При необходимости увеличьте флуоресценцию напряжения фотомультипликаторной трубки (PMT), чтобы поместить отрицательную популяцию в серые ящики. Выгрузите неокрашенную контрольную трубку от цитометра.
11. Убедитесь, что положительные популяции находятся в масштабе. Загрузите окрашенные трубки управления на цитометр и запустить Приобретение. Снижение напряжения PMT для положительной популяции, если оно зашкаливало до тех пор, пока положительное население не будет видно полностью в масштабе. Затем выгрузите окрашенный образец.
12. Для записи и анализа образцов на новом глобальном листе создайте следующие участки для просмотра данных: 1) FSC против SSC и 2) гистограмма ФЛуоресценции PE. Загрузите первый образец на цитометр и запустите Приобретение.
13. Нарисуйте ворота РБК вокруг эритроцитов на участке FSC против SSC. Отображение популяции РБК в гистограмме флуоресценции PE. В представлении Статистика выберите среднее для параметров ФЛуоресценции PE на популяциях GR(рисунок 1F).
14. В панели мониторинга приобретения выберите все события в остановке ворот и 10 000 событий для записи(рисунок 1G). Нажмите данные записи. Когда запись события будет завершена, удалите первую трубку из цитометра. Глобальные участки листа должны выглядеть как на рисунке 2.
15. Загрузите следующие образцы и запишите их.

6. Определение плотности эритроцита CR1

1. Возьмем значения средней интенсивности флуоресценции образцов, соответствующих "низкой" теме(рисунок 3, таблица I,МФО РБК), "средний" предмет(рисунок 4, таблица D,МФО РБК), "высокий" предмет(рисунок 4, таблица I,МФО РБК) и отрицательный контрольный образец(рисунок 3, таблица I,МФО РБК).
2. На графике, представляющем среднюю интенсивность флуоресценции как функции плотности CR1, поместите четыре точки, соответствующие отрицательному контролю, "низкий" предмет, "средний" предмет и "высокий" предмет (синие точки, рисунок 6).
3. Нарисуйте линию регрессии, чтобы получить линию калибровки и ее уравнение.
4. Возьмем значения средней интенсивности флуоресценции образцов, соответствующих предметам, плотность которых должна быть определена. (Рисунок 5, Таблицы D и i,МФО РБК).
5. Получить уравнение, заменив "Y" с использованием значений средней интенсивности флуоресценции, и вычислить плотность CR1/E (Рисунок 6).
6. Проверьте на графике, что средние значения интенсивности флуоресценции и определяется CR1 /E плотность соответствуют точке на линии калибровки (Рисунок 6).

Results

Эритроциты трех субъектов, плотность которых CR1 известна ("низкий" предмет (180 CR1/E), "средний" предмет No646 CR1/E и "высокий" предмет No 966 CR1/E), а также двух субъектов, плотность CR1 которых должна была быть определена иммунопрепаратами, примыкающих к флюторной системе. В начале плотность CR1 испытуемых из низкого высокого диапазона была определена методом Scatchard²⁹ с использованием радиомаркированных антител. Определенные стандарты (низкие, средние и высокие) использовались для кривой ...

Discussion

Несколько методов доступны для определения плотности эритроцита CR1 (CR1/E). Первыми методами были агглютинация красных кровяных телец анти-CR1 антител³¹ и образование розетов в присутствии эритроцитов, покрытых C3b³². Эти рудиментарные методы были быстро заменены иммуностоинга методы с использованием радиомаркировки анти-CR1 антител^1,33. Также можно измерить концентрацию CR1 в мембранных экстрактах с помощью фермен...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000E Барьерный наконечник	Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Франция	2079E	Образец пипетирования
1-100 &микро; L Скошенный, наконечник фильтра	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Германия	S1120-1840	образец пипетирования
Биотинилированное моноклональное антитело против CR1 (J3D3)	Домашнее производство некоммерческого моноклонального антитела, любезно предоставлено доктором Дж. Куком		иммуноокрашивание
Защита блузки			Бовин
сывороточный альбумин (7,5%)	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Иллкирх, Франция	15260037	цитометрии
	Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Франция	11176917	центрифугирование
Clean Solution	BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция	340345	цитометрия
Comorack-96	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	944060P	Установка стоечного
цитометра & Набор бусин для слежения	BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция	655051	цитометрия
Раствор формальдегида 36,5 %	Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, Франция	F8775-25ML	Фиксация
10 & микро; L Градуированный, наконечник фильтра	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Германия	S1121-3810	пипетирование образцов
LSRFORTESSA Flow Cytometer	BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция	647788	цитометрия
Microman капиллярные поршни	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	067494	пипетирование образцов
Micronic 1,40 мл пробирки с круглым дном	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	MP32051	смесь
Микропипетка Microman - тип M25 -	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	066379	образец пипетки
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Франция	10010031	цитометрия
Пипетка PS 325 мм, 10 мл	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	391952	образец пипетки
без порошка нитрил Exam перчатки	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, США	486802	защиты образцов
Ссылка 2 пипетки, 0,5-10 &; L	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция	4920000024	дозатор для отбора проб
Reference 2 pipette, 20-100 &; L	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция	4920000059	дозирование проб
Reference 2 pipette, 100-1000 &; L	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция	4920000083	пипетирование проб
Раствор для полоскания	BD, F-38801 Le Pont de Claix, Франция	340346	цитометрия
Круглая донная пробирка	Sarstedt, F-70150 Marnay, Франция	55.1579	цитометрия
Safe-Lock Tubes, 1,5 мл	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция	0030120086	смесь
стрептавидин R-PE	Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, Франция	AS-60669	иммуноокрашивание
Конические центрифужные пробирки 50 мл	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Франция	10203001	смесь
Вектор антистрептавидиновый биотин	Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, Франция	BA-0500	иммуноокрашивание
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc, Богемия, Нью-Йорк 111716, США	Смесь SI-0236