Однородный гликоконъюгированный, производимый комбинированной неестественной аминокислотной инкорпорацию и нажмите-химию для целей вакцины

Краткое содержание

Генетическое расширение кода применяется для введения неестественной аминокислоты, несущей биоргононо-функциональную группу на несущем белке в определенном месте. Биортогональная функция далее используется для селективного соединения углеводного антигена для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины.

Аннотация

Расширение генетического кода является мощным инструментом для внедрения неестественных аминокислот (УА) в белки для изменения их характеристик, изучения или создания новых белковых функций или доступа к протеиновым конъюгратам. Остановить подавление кодона, в частности подавления янтарного кодона, стало самым популярным методом генетического внедрения БПЛА на определенных позициях. Эта методология применяется к подготовке несущего белка, содержащего UAA укрывательство биоортогональной функциональной группы. Эта реактивная ручка может быть использована для конкретного и эффективного прививки синтетического олигосахарида hapten для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины. Протокол ограничен синтезом гликоконъюгатов в соотношении белка 1:1 углеводов, но податлив к многочисленным парам биортогональных функциональных групп. Гликококонджгейт однородность вакцины является важным критерием для обеспечения полной физико-химической характеристики, тем самым удовлетворяя все более и более требовательные рекомендации агентства по регулированию лекарственных препаратов, критерий, который не удовлетворяется классическими стратегиями спряжения. Кроме того, этот протокол позволяет точно настроить структуру фактической конъюгации вакцины, что дает возможность использовать инструменты для решения отношений между структурой и иммуногенностью.

Введение

Гликоконъюгированные вакцины являются важными элементами арсенала вакцин, доступного для профилактического лечения инфекционных заболеваний. Они безопасны, хорошо переносятся и эффективны в широкой возрастной группе, включая маленьких детей. Они обеспечивают оптимальную защиту от инфекций, вызванных капсулированных бактерий, таких как менингококк, пневмококк или гемофильные грипп типа b¹. Гликоконъюгированные вакцины сделаны из очищенных бактериальных полисахаридов, которые образуют капсулы бактерий или синтетических олигосахаридов, которые имитируют эти поверхностно выраженные^{полисахариды 2}, которые ковалентно ....

Протокол

1. Синтез УАА: пропаргыл-лизин (PrK)

1. Синтез N^α-Boc-propargyl-lysine¹⁸
   1. Растворите 500 мг Boc-L-Lys-OH (2,03 ммоль) в смеси aqueous 1 M NaOH (5 мл) и THF (5 мл) в колбе и поместить колбу с кремниевой перегородкой.
   2. Охладить колбу в ледяной ванне, а затем добавить 158 л пропаргилового хлороформата (1,62 ммоль) dropwise (в течение 2-3 мин период) с помощью микросыринга при перемешивании.
   3. Разогреть реакционной смеси до комнатной температуры и продолжать помешивая в течение 10 ч.
   4. Охладить растворы 50 мл диэтил эфира, 50 мл аквеозной 1 М соляной кислоты и 60 мл этилового ацетата в л....

Результаты

В этом проекте, однородная вакцина гликоконъюгат был подготовлен с использованием стратегии подавления остановки янтаря кодона ввести UAA на определенном сайте (Рисунок 1). Пневмоккокал поверхности адхезин А был выбран в качестве носителя белка moiety. Этот белок высоко сохраняется и выражается всеми штаммами стрептококковой пневмонии²². Он высоко иммуногенный и ранее использовался в качестве носителя в пневмококковых препарат.......

Обсуждение

Сайт-направленный мутагенез является простой стратегией для включения конкретных аминокислот в определенном положении белка, который остается едва используется с целью подготовки^{гликоконъюгированных вакцин 7,8,14}. Классический мутагенез, основанный на подходе 20 натуральных аминокислот, является высокоэффективным, поскольку никаких изменений в механизме перевода не требуется. Мутации цистеина, как правило, направлены на дальнейш.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
AIM (автоиндуктивная среда)	Formedium	AIMLB0210	Твердый порошок
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Твердый порошок
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	emE. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λ S)
Диализная мембрана
DNAseI
Filter 0.45 µ m
L-арабинозная
лизоцим
Ni-NTA смола	Machery Nagel	протино	Ni-NTA в суспензии в 20% этаноле
центробежное устройство
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	в этом исследовании		то же, что и pET24d-mPsaA-WT, но с мутацией K32TAG в Ген mPsaA
pET24d-mPsaA-WT	в этом исследовании		используется плазмид pET24d с геном Wt mPsaA, клонированный между сайтами рестрикции BamHI и XhoI с последовательностью протеазы TEV, за которой следует метка His6 на С-концевом конце гена mPsaA и несущая плазмидный подарок pEVOL гена резистентности к канамицину
	от Эдварда Лемке EMBL (ссылка 19)		плазмид с происхождением p15A, две копии MmPylRS (одна под промотором GlnS и одна под промотором pAra), одна копия тРНКCUA под промотором ProK, ген резистентности к хлорамфениколу
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220

Pall