Мы представляем муриновую модель индукции смерти мозга для оценки влияния его патофизиологического воздействия на органы, а также на последовательные трансплантаты в контексте сплошной трансплантации органов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индукция смерти мозга у мышей с использованием внутриартериального мониторинга кровяного давления и вентиляции через трахеостомию
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В то время как живое пожертвование и донорство после смерти в кровеносном организме предоставляют альтернативные возможности для трансплантации органов, донорство после смерти донора мозга (БД) по-прежнему является основным источником твердых трансплантаций. К сожалению, необратимая потеря функции мозга, как известно, вызывают несколько патофизиологических изменений, в том числе гемодинамических, а также гормональные изменения, наконец, приводит к системной воспалительной реакции. Модели, позволяющие систематически исследует эти эффекты in vivo, скудны. Мы представляем мурин модель индукции BD, которая могла бы помочь расследования разрушительных последствий BD на качество аллотрансплантата. После проведения внутриартериального измерения артериального давления через общую сонной артерии и надежную вентиляцию через трахеостомию, БД индуцируется постоянно растущим внутричерепным давлением с помощью катетера воздушного шара. Через четыре часа после индукции БД органы могут быть собраны для анализа или для дальнейших процедур трансплантации. Наша стратегия позволяет провести всесторонний анализ донорского БД в модели мурин, что позволяет углубленное понимание связанных с БД эффектов при трансплантации твердых органов и потенциально прокладывает путь к оптимизации предки органов.
Введение
Трансплантация в настоящее время является единственным лечебным лечением для отказа органов на конечную стадию. До сих пор, смерть мозга (BD) пациенты были основным источником для донорства органов, хотя живое пожертвование и пожертвование после смерти кровообращения являются ценными альтернативами1. БД определяется необратимой комой (с известной причиной), отсутствием стволовых рефлексов мозга и апноэ2. К сожалению, органы BD демонстрируют более низкие результаты в долгосрочном выживании трансплантата независимо от человеческого антигена лейкоцита (HLA)-несоответствие и холодное ишемическое время3. Между тем, интенсивные исследования по этому антиген-независимый фактор риска было проведено в результате трех основных аспектов патофизиологических изменений опосредовано в результате БД: гемодинамические, гормональные, и воспалительные4.
На сегодняшний день экспериментальные модели BD у грызунов в основном выполняются с использованием крыс. Для того, чтобы получить более глубокое понимание иммунологических последствий для твердых органов после БД, мы стремились создать модель murine BD, так как в настоящее время только мыши модели позволяют всестороннее расследование генетических или иммунологических факторов. В этом контексте система мыши предоставляет более широкий спектр аналитических инструментов.
Принцип индукции БД, описанный здесь, основан на увеличении внутричерепного давления, вызванного инфляцией катетера воздушного шара, вставленного под череп. Повышенное внутричерепное давление имитирует физиологический механизм БД, блокируя перфузию головного мозга, мозжечка и ствола мозга5,,6. Для обеспечения достаточного перфузии периферических органов, измерение артериального давления является обязательным во время процедуры. Катетер, используемый для этой цели, в то же время служит для сосудистого введения для стабилизации артериального давления путем замены жидкости. Поскольку БД сопровождается прекращением спонтанного дыхания, необходима достаточная вентиляция легких. Электрическое одеяло поддерживает физиологическую температуру тела ядра.
Таким образом, эта модель позволит углубленного исследования влияния BD-индуцированной травмы, на миграции лейкоцитов7, комплимент активации8, ишемическая реперфузионная травма9, и другие факторы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами лабораторного ухода за животными, разработанными Национальным обществом медицинских исследований и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленным Национальной академией наук и опубликованным Национальными институтами здравоохранения (публикация NO 86-23, пересмотренный в 1985 году). Все эксперименты были одобрены Министерством образования, науки и культуры Австрии (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Артериальная катетеризация
- Анестезия мыши с интраперитонеальной инъекции кетамина и ксилазина10 и анальгетик в соответствии с местной практикой (например, бупренорфин). Pinch задние конечности с щипками, чтобы подтвердить правильную глубину анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования использовались мыши C57BL/6N в возрасте от 8 до 12 недель (вес 20–25 г). Авторы протестировали мужской BALB/c того же возраста безуспешно, но не пробовали другие штаммы (см. Обсуждение). - Удалите волосы в интересующих регионах (голова, шея) с помощью электрической бритвы. Убедитесь, что не осталось свободных волос, чтобы предотвратить раневого загрязнения. Затем дезинфицировать хирургическое поле с 70% этанол / хлоргексидин / бетадин и место мыши supine с головой перед хирургом.
- Сделайте разрез средней линии шейки матки с рассекающими ножницами.
- Вскрыть подчелюстные железы и ткани шеи мышечной ткани и отделить их для того, чтобы разоблачить общую сонную артерию. Используйте в основном тупой рассечение через щипки.
- Место три 8-0 шелковые лигатуры под правой общей сонной артерией.
- Поместите зажим на проксимальной лигатуре и принести напряжение в артерии так, что поток подвешивается.
- Закройте самую дистальную лигатуру.
- Вставьте артериальный катетер через небольшое, предварительно сформированное отверстие кожи на черепном аспекте разреза. Сожмите и деформируйте просвет катетера, если он кажется слишком большим, чтобы уменьшить приток крови. Зафиксировать со всеми тремя лигатурами.
- Прикрепите катетер к коже, чтобы избежать вывиха. Сделайте это с помощью шва (например, 5-0 монофилом, неабсорбируемый), который соединяет катетер с кожей в области предварительно сформированного отверстия кожи.
2. Трахеостомия
- Вскрыть предтрахеальной мускулатуры прямо с помощью щипки.
- Место два 8-0 шелковые лигатуры под трахеей.
- Трахеотомизировать с помощью микро ножниц как можно более проксимически, чтобы избежать односторонней вентиляции. Используйте горизонтальную линию резки между двумя трахеальными хрящами.
- Вставьте вентиляционную трубку и зафиксировать с обеих подготовленных лигатур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проксимальный конец трахеи не должен быть ligated. - Закройте кожу бегущим швом (например, 6-0 монофилом, неабсорбируемым).
- Вентиваю мышь с частотой 150/мин и приливным объемом 200 л.
3. Индукция смерти мозга
- Расположите мышь в положении склонного.
- Удалить кожу из черепа с помощью хирургических ножниц и щипцы, чтобы держать кожу.
- Просверлите скважину калибра 1 мм парамедиалло над левой теменной корой. Прекратите бурение перед нарушением внутренней компактной кости и дюра-матер.
- Проникают в окончательный тканевый мост черепа с помощью тупых щипц, удаляя острые края.
- Вставьте воздушный шар катетер, так что это полностью в полости черепа. Убедитесь, что воздушный шар предварительно заполнен сольнием и весь воздух эвакуирован.
- Начните инфляцию на уровне 0,1 мл/мин в течение 10-15 мин (общий объем 0,8-1,2 мл) с помощью шприского насоса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь будет проявлять миоклон, мидриаз, дальнейшее захват деятельности и агональных вздохов. - Произносите мыши мозга мертвым, как только хвост мыши пошел жесткой и возведен.
ПРИМЕЧАНИЕ: BD подтверждается характерным начальным пиком артериального давления (Cushing reflex), отсутствием стволовых рефлексов мозга и спонтанным дыханием. Регулярное тестирование апноэ следует избегать во время экспериментов, как мышей может стать кровообращения нестабильной из-за недостатка кислорода. - Остановите инфляцию катетера воздушного шара.
- Положите отопительное одеяло над мышью, чтобы избежать переохлаждения.
4. В период БД
- Регулярно отслеживайте и документируйте артериальное давление. Исключить мышей с длительной гипотензивной фазой (среднее артериальное давление (MAP) (MAP) (мят) на 50 мм рт. ст.
- Настоять 0,1 мл солья каждые 30 минут, чтобы стабилизировать кровяное давление мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 0,8 мл соля было введено к каждой мыши в этом исследовании. - После 4 ч продолжительности BD, урожай органов мыши / тканей. Исключите мышь из эксперимента, если сердце мыши не бьется в конце эксперимента.
5. Процедура Шама
- Выполните шаги 1.1'3.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте внутреннюю компактную кость. Не вставляйте и не надувайте катетер воздушного шара. - Оставайтесь рядом с мышью и постоянно наблюдайте за животным. Неоднократно щипать задние конечности с щипками, чтобы подтвердить правильную глубину анестезии. Примените дополнительную анестезию подкожно (примерно 1/2 от стартовой дозы), если мышь показывает признаки пробуждения, что, по нашему опыту, происходит примерно после 2/3 ч после анестезии.
- Нанесите такое же количество внутривенного солика, как и у BD мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивная мышь восстановит спонтанное дыхание после прекращения вентиляции. Мышь BD не будет. Тестирование апноэ должно быть сделано при создании модели, но во время экспериментов его следует избегать из-за ненужного физиологического стресса.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Модель murine BD была успешно выполнена более 100 раз с показателем успеха более 90%. Кроме того, после интервенционной трансплантации органов сердца и почек было безопасно выполнено7.
BD вызывает различные патофизиологические изменения, которые могут быть дополнительно исследованы с помощью этой модели. Как показано на рисунке 1, кровяное давление показывает начальный гиперт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
BD, фактор риска для качества аллотрансплантата у многоорганных доноров, влечет за собой множество патофизиологических изменений, которые могут быть достаточно оценены с использованием моделей in vivo. Гемодинамические изменения, цитокин буря, гормональные изменения и их конечное влияние на качество трансплантата органов и выживание не могут быть проанализированы в пробирке4. Большинство основных трансплантаций, а также иммунологических исследований зависит от сложных диагностических инструментов,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Неприменимо.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Артериальный катетер (BD Neoflon 26G) | Датчики | ||
| (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Фогарти Артериальная эмболэктомия катетер N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Щипцы | FST | 11271-30 | |
| Гомеотермические одеяла с гибким зондом | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Микроножницы | FST | 15018-10 | |
| Иглодержатель | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Насос 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Ножницы | FST | 14075-11 | |
| Стереотаксический микроскоп | Olympus | SZX7 | |
| Транспоровая лента | 3M | 1527-1 | |
| Подкладки | Molinea.A | 274301 | |
| Вентилятор для мышей (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Ксиласол | Грэуб | 7630109 |
Ссылки
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
