Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Доставка модифицированной мРНК в модели мыши инфаркта миокарда

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60832

⸱

11 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой простой и последовательный способ превок ликуляции гена, представляющий интерес с помощью модРНК после инфаркта миокарда у мышей.

Аннотация

Инфаркт миокарда (МИ) является ведущей причиной заболеваемости и смертности в западном мире. В последнее десятилетие генная терапия стала перспективным вариантом лечения сердечных заболеваний, благодаря его эффективности и исключительным терапевтическим эффектам. В усилии отремонтировать поврежденные ткани post-MI, различные изучения использовали дна-основанную или вирусную терапию гена но смотрели на значительные барьеры из-за плохого и неконтролируемого выражения поставленных генов, отека, аритмии, и сердечной гипертрофии. Синтетическая модифицированная мРНК (модРНК) представляет собой новый подход к генной терапии, который предлагает высокую, преходящую, безопасную, неиммунизную и контролируемую доставку мРНК в сердечную ткань без риска геномной интеграции. Благодаря этим замечательным характеристикам в сочетании с колоколообразной фармакокинетикой в сердце, модРНК стала привлекательным подходом для лечения сердечных заболеваний. Однако для повышения его эффективности in vivo необходимо следовать последовательному и надежному методу доставки. Таким образом, для максимизации эффективности доставки модРНК и согласованности урожайности в модРНК-приложениях in vivo представлен оптимизированный метод подготовки и доставки модРНК-интракардиальной инъекции в модель мыши MI. Этот протокол сделает доставку модРНК более доступной для фундаментальных и трансляционных исследований.

Введение

Генная терапия является мощным инструментом, включающим доставку нуклеиновых кислот для лечения, лечения или профилактики заболеваний человека. Несмотря на прогресс в области диагностических и терапевтических подходов к сердечно-сосудистым заболеваниям, наблюдается ограниченный успех в доставке генов при инфаркте миокарда (МИ) и сердечной недостаточности (HF). Как простой, как процесс генной терапии кажется, это заметно сложный подход, учитывая многие факторы, которые должны быть оптимизированы перед использованием конкретного транспортного средства доставки. Правильный вектор доставки должен быть не иммуногенным, эффективным и стабильным внутри человеческого организма. Усилия в этой области породили два типа систем доставки: вирусные или невирусные. Широко используемые вирусные системы, включая передачу генов аденовирусом, ретровирусом, лентивирусом или адено-ассоциированным вирусом, показали исключительную способность к трансдукции. Однако их применение в клиниках ограничено из-за сильного иммунного ответа, индуцированного1,риска опухолевого мозга2,или наличия нейтрализующих антител3,все из которых остаются основным препятствием для широкого и эффективного применения вирусных векторов в генной терапии человека. С другой стороны, несмотря на их впечатляющую модель выражения, доставка обнаженной плазмидной ДНК показывает низкую эффективность трансфекта, в то время как передача мРНК представляет высокую иммуногенность и восприимчивость к деградации RNase4.

С обширными исследованиями в области мРНК, модРНК стала привлекательным инструментом для доставки генов в сердце и различные другие органы из-за его многочисленных преимуществ по сравнению с традиционными векторами5. Полная замена уридина естественным псевдоуридином приводит к более надежному и преходящее выражение белка, с минимальной индукцией врожденного иммунного ответа и риском геномной интеграции6. Недавно созданные протоколы используют оптимизированное количество аналога противооборотной крышки (ARCA), что еще больше усиливает перевод белка, повышая стабильность и трансабельность синтетической мРНК7.

Предыдущие отчеты показали экспрессию различных репортеров или функциональных генов, поставляемых модРНК в миокарде грызунов после И.В. С модРНК-приложений, значительные области миокарда, в том числе как кардиомиоцитов и noncardiomyocytes, были успешно трансфицированы пост-сердечной травмы8, чтобы вызвать ангиогенез9,10, выживаемость сердечной клетки11, и пролиферации кардиомиоцитов12. Одно администрирование модРНК, закодированного для мутировавших человеческих фоллистатиноподобных 1, вызывает распространение мыши взрослых КМ и значительно увеличивает сердечную функцию, уменьшает размер рубца и увеличивает плотность капилляров 4 недели после MI12. Более недавнее исследование сообщило улучшение сердечной функции после MI с применением модРНК VEGFA в модели свиней10.

Таким образом, с ростом популярности модРНК в области сердца, необходимо разработать и оптимизировать протокол для доставки модРНК в сердце пост-MI. Здесь есть протокол, описывающий подготовку и доставку очищенной и оптимизированной модРНК в биосовместимой цитрат-солевой формулировке, которая обеспечивает надежное, стабильное выражение белка без стимулирования иммунного ответа. Метод, показанный в этом протоколе и видео демонстрирует стандартную хирургическую процедуру мыши MI путем постоянной перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD), а затем три участка интракардовых инъекций модРНК. Целью данной работы является четкое определение высокоточного и воспроизводимого метода доставки модРНК в муринский миокард, чтобы сделать применение модРНК широко доступным для сердечной генной терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для животных, изложенные здесь, были одобрены Медицинской школой Икан в Комитете по институциональной помощи и использованию Маунт-Синай.

1. Синтез модРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Детали синтеза модРНК можно найти в Кондрат и др.13.

  1. Закажите шаблоны плазмиды(Таблица материалов)и создайте чистый продукт PCR для использования в качестве шаблона мРНК.
  2. Подготовка modRNAs транскрипции в пробирке с индивидуальным рибонуклеозид смесь изследующих( Таблица Материалов ): T7 транскрипции комплект, 6 мМ анти-обратный колпачок аналог (ARCA) 30-O-Me-m7G (50) ppp (50)G, 75 мМ гуанозин трифосфат, 75 мМ аденозинтрифосфат, 75 мМ цитидин трифосфат, 100 мм псевдоуридин-5-трифосфат, и T7 DNase фермент.
  3. Очистите модРНК, сделанный в шаге 1.2 с комплектом очистки транскрипции(Таблица материалов)и лечить антарктическим фосфатазой. Затем выкупить модРНК с комплектом очистки транскрипции и количественно его с помощью спектрофотометра.
  4. Осаждать модРНК этанолом и ацетатом аммония и резуспенетесь в 10 мм Трис-HCl и 1 mM EDTA.
  5. Сосредоточьте модРНК для доставки in vivo с помощью центробежных фильтров и измерьте качество с помощью автоматизированной платформы электрофореза(Таблица материалов).

2. Подготовка инъекций модРНК для доставки in vivo

  1. Рассчитайте объем, необходимый для 100 мкг люциферазы (Luc)/Cre modRNA инъекции на основе концентрации модРНК.
  2. Смешайте расчетный объем модРНК с равными частями раствора сахарозы, подготовленного в нуклеазной свободной воде (0,3 г/мл) и 0,1 М цитратовом растворе (рН No 7) (20 мл каждый рекомендуемый).
  3. Доведите окончательный объем инъекции до 60 мл, добавив солевой раствор.

3. Инфаркт миокарда

  1. Анестезия и подготовка животного
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование использует мужчин и женщин CFW мышей 8-12 недель.
    1. Обезболить мышь с 2% изофлуран с помощью индукционной камеры и поместите животное на спину в спинной позиции с масками над носом и ртом, чтобы сохранить анестезию. Поддерживайте анестезию с помощью механической вентиляции с помощью респиратора, оснащенного трубкой дыхательных путей 7–8 мм и фильтром.
    2. Чтобы обездвижить мышь на хирургической платформе, закрепите ее конечности хирургической лентой. брить область шеи и левой стороны грудной клетки и дезинфицировать с помощью 70% этанола и йода повидитого. Повторите дезинфекцию шаг дважды. Проверьте его рефлексы, щипать хвост и задние ноги, чтобы оценить глубину анестезии.
    3. Непрерывно отслеживайте и поддерживайте температуру тела ядра при нормотермии (37,5–38 градусов по Цельсию).
    4. Поддерживайте открытые дыхательные пути, выполняя интрачецию. Для этого поместите мышь в брюшное положение с ртом, обращенным к экспериментатору, и аккуратно вытащите язык. Отрегулируйте угол шеи и выпрямите траекторию интубации и нажмите в интубации канюли.
    5. В случае, если животное не может дышать через него, трахеостомия может быть выполнена. Выполните разрез шейки матки вдоль средней линии изоляции кожи, мышц и тканей с изложением трахеи с помощью микроскопа. Когда трахея хорошо видна, вставьте эндотрахеальную трубку в ткань между двумя кольцами картриджа ниже glottis, сделав небольшое отверстие и удерживая черепную часть трахеи с помощью микрохирургических щипцов.
    6. Наблюдайте грудное движение мыши, чтобы убедиться, что оба легких получают кислород. Частота дыхания (ОР) должна быть примерно 120 вдохов в минуту, с давлением 17-18 см H2O.
  2. Левая передняя нисходящая (LAD) перевязка артерий
    1. Чтобы выполнить перевязку LAD, включите мышь осторожно, чтобы она лежала на правой стороне. Поднимите кожу и выполнить левую сторону торакотомии между 3-м и 4-м ребро и вскрыть ткани и мышцы тщательно. Используйте прижигательу, чтобы предотвратить кровотечение.
    2. Открыть грудную клетку тщательно и, как только она открыта, найти сердце, не касаясь легких с любым острым предметом. Поместите втягивающие части в разрез, чтобы сохранить грудную полость открытой и иметь четкое представление о сердце. Теперь переместите легкие к краю разреза и удалите часть перикардиального мешка, который покрывает сердце, чтобы получить доступ к передней поверхности сердца.
    3. Тщательно определите LAD, который можно рассматривать как глубокий светло-красный сосуд, расположенный между легочной артерией и левой ушной раковиной. Ligate LAD проксимальный с одним швом 7-0 шелкового шва. Поместите грудную трубку (28 Г, венальный катетер), между 4-м и 5-м ребро.
    4. Закройте грудной разрез слоями. Используйте 6-0 шелковых ходовых швов, чтобы адаптировать ребра и использовать 5-0 шелковых ходовых швов, чтобы закрыть кожу. Убедитесь в том, чтобы оставить надлежащее окно для будущих эхокардиографических измерений.
    5. Тщательно процедить грудную клетку теплым изотоническим раствором (9 г хлорида натрия в 1 л воды) с помощью шприца 2 мЛ. Поместите мышь на спину. При выполнении трахеостомии, принять эндотрахеальной трубки и с помощью 7-0 шелковых швов адаптировать трахеальные кольца картриджа с одним стежком. Поместите маску для лица на мышь и закройте кожу с помощью 5-0 шелковых ходовых швов.
    6. Для фазы восстановления отключите интубацию канюлы от аппарата искусственной вентиляции легких и допускаем спонтанное дыхание. Поместите животное под тепловую лампу, пока оно не достигнет сознания. Не оставляйте животное без присмотра после операции, пока оно не полностью не проснется.
    7. Управление обезболивающей терапии с buprenophine на 0,1 мг/ кг массы тела, вводят подкожно в течение следующих 3 дней с интервалом 12 ч.

4. Сердечная доставка модРНК

  1. Доставка в общей сложности 60 МЛ модРНК, подготовленных в шаге 2.3 внутримышечно (IM) с помощью инсулина шприц (31 G) после И.В.
    1. Введите 20 МЛ модРНК в трех различных участках сердечной мышцы, окружающей инфарктную область (два по обе стороны от перевязки и один в вершине). Выполните инъекции сразу после LAD, перед закрытием груди.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные изображения сайтов инъекций модРНК можно увидеть на рисунке 1.

5. Проверка экспрессии белка в сердце после MI

  1. Выражение модРНК Люциферазы с помощью системы визуализации биолюминесценции
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 100 мкг Люк мРНК, приготовленные в 60 МЛ сахарозы цитрат буфера непосредственно вводится в сердце мышей CFW после MI.
    1. На 24 ч после MI и модРНК инъекции, анестезировать мышей с 2% изофлурана с помощью индукционной камеры и интраперитонально вводить люциферин (150 мг/ г массы тела) для проверки сигнала Luc in vivo.
    2. Изображение мышей с помощью биолюминесценции системы визуализации каждые 2 минуты, пока сигнал Luc достигает насыщения.
    3. Количественная оценка собранных данных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Используйте мышей, впрыснутых с физиологическим раствором только в качестве базового чтения для выражения Luc и вычесть фоновый сигнал, собранный из солевого впрыскиваемого мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал Luc выражен в p/s/cm2/sr x 106.
  2. Иммуносхвайтинг для проверки трансфекциона Cre
    1. Для проверки трансфекции с Cre, жертвовать животных 24 ч постинджекция с помощью интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина с последующим вывихом шейки матки. Перед тем, как сделать разрез, дезинфицировать грудь и живот с помощью 70% спирта тампон.
    2. Откройте грудную полость, сделав поперечный разрез на 1 см ниже грудины и двигай ножницами к голове, прорезая грудную клетку.
    3. Откройте грудную клетку и введите 1 мЛ стерильных PBS в правой желудочковой камере, чтобы удалить избыток крови. Акциз сердце немедленно и поместите его в стерильные PBS, чтобы смыть оставшуюся кровь.
    4. Зафиксировать сердце в 4% параформальдегида (ПФА) в течение 24 ч, а затем ночь инкубации в 30% раствора сахарозы при 4 кк. На следующий день встраивайте сердца в оптимальную температурную среду резки и разделите их толщиной 10 мкм с помощью криостата.
    5. Окрашивайте участки первичным антителом против сердечного тропонина I (cTNI) и маркировать их флуоресцентными вторичными антителами. Чтобы определить ядро, пятно с 4',6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI) в течение 5 мин. Изображение слайдов с помощью флуоресцентного микроскопа.

6. Статистический анализ

  1. Участок бар график, основанный на выражении Luc в солевой и Люк-инъекционных мышей и сообщить значения, как среднее - SEM. Сравните две группы с помощью непарлаченного т-тест (P q lt; 0.0001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

От восьми до десяти недель мышей были анестезированы изофлураном и интубированы. После того, как животное находилось под наркозом, левая грудная область была выбрита и стерилизована этанолом, а сердце было выставлено на перевязку LAD. Левая коронарная артерия была окклюдированной, прочно завязав шов под артерией (диаграмма представления Рисунок 1A). После успешного инфаркта (показано на поблеконом левой стены желудочка свободной), прямое введение 100 мкг Luc или Cre modRNA растворяется в сах...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Генная терапия показала огромный потенциал для значительного продвижения лечения сердечных заболеваний. Тем не менее, традиционные инструменты, используемые в первоначальных клинических испытаниях для лечения HF показали ограниченный успех и связаны с тяжелыми побочными эффектами. Модифицированная РНК представляет собой невирусную доставку генов, которая постоянно набирает популярность как инструмент передачи генов в сердце. МодРНК не требует ядерной локализации генов для перевода, и, таким образом, предлагает эффективно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают Анну Ану Курян за ее помощь с этой рукописью. Эта работа была профинансирована за счет гранта запуска кардиологии, присужденного лаборатории Занги, а также грантом NIH R01 HL142768-01

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АденозинтрифосфатИнвитрогенAMB13345входит в состав набора Megascript
Антарктическая фосфатазаNew England BiolabsM0289L
Anti-reverse cap аналог, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)GTriLink BiotechnologiesN-7003
Биолюминесценсная система визуализацииPerkin Elmer124262IVIS100 система визуализации устройства с зарядовой связью
Тупые ретракторыFST18200-09
Сердечный тропнин IAbcam47003
ЦитидинтрифосфатИнвитрогенAMB13345Входит в комплект Megascript
Двойная анестезиологическая системаГарвардский аппарат75-2001
Щипцы - AdsonFST91106-12
Щипцы - Dumont #7FST91197-00
ГуанозинтрифосфатInvitrogenAMB13345входит в комплект Megascript
Набор для транскрипции in vitroInvitrogenAMB133455X MEGAscript T7 Набор
интубацииГарвардский аппарат
Megaclear LifeTechnologies
Аппарат искусственной вентиляции легких для мышейГарвардский аппарат73-4279
N1-метилпсевдоуридин-5-трифосфатTriLink BiotechnologiesN-1081
NanoDrop спектрометрThermo Scientific
Olsen гегар иглодержатель со шваминожницы FST12002-12
Плазмидные шаблоныGeneArt, Thermo Fisher Scientific
остроконечные ножницы для пресеченияFST14200-12
СтереомикроскопZeiss
Шовные материалыEthiconY433H5.00
Шовные материалыEthiconY432H6.00
Шовные материалыEthicon7733G7.00
T7 Фермент ДНКазыInvitrogenAMB13345Входит в комплект Megascript
Tape stationAligent4200
Набор для очистки транскрипцииInvitrogenAM1908Megaclear
Ultra-4 центробежные фильтры 10kAmiconUFC801096
для

Ссылки

  1. Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
  2. Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  3. Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).
  4. Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
  5. Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
  6. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  7. Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
  8. Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
  9. Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
  10. Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
  11. Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
  12. Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
  13. Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
  14. Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Доставка модифицированной мРНКмодель инфаркта миокардавнутрисердечная инъекцияперевязка передней нисходящей артериибиолюминесцентная визуализацияраствор цитрата сахарозыинтратрахеальная интубацияэкспрессия модифицированной мРНК Creэкспрессия белка люциферазытрансгенные мыши ROSA26
Доставка модифицированной мРНК в модели мыши инфаркта миокарда
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.