Методическая статья

Синтез функциональных магнитных наночастиц, их спряжение с Siderophore Фероксамин и его оценка для обнаружения бактерий

DOI:

10.3791/60842

⸱

16 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Departamento de Química, Facultade de Ciencias, Universidade da Coruña, 2Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Unidad de Comunicación y Divulgación, Universidade da Coruña, 3Department of Microbiology and Parasitology, Institute of Aquaculture, Universidade de Santiago de Compostela

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа описывает протоколы для подготовки магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) и его спряжения с deferoxamine с помощью succinyl moiety в качестве связучателя. Глубокое описание структурной характеристики и анализ бактерий захвата с помощью Y. enterocolitica для всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгированный также описаны в деталях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящей работе, синтез магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) и его спряжение с deferoxamine, боковой дрофор признан Yersinia enterocolitica, используя succinyl moiety в качестве связувателя описаны.

Магнитные наночастицы (MNP) магнетита (Fe3O4) были подготовлены solvothermal методом и покрыты SiO2 (MNP@SiO2) с использованием процесса Стёбер следуют функционализации с APTES (MNP@SiO2@NH2). Затем, фероксамин был конъюгированных с MNP@SiO2@NH2 карбодиимид соединения дать MNP@SiO2@NH2@Fa. Морфология и свойства конъюгированных и промежуточных были изучены восемью различными методами, включая дифракцию порошкового рентгеновского излучения (XRD), фурье трансформировать инфракрасную спектроскопию (FT-IR), спектроскопию Романа, рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), микроскопию электронов передачи (TEM) и энергетическую дисперсию X-Ray. Эта исчерпывающая характеристика подтвердила формирование конъюгата. Наконец, для того, чтобы оценить емкость и специфичность наночастиц, они были протестированы в захвате бактерий анализа с помощью Yersinia enterocolitica.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы обнаружения бактерий с использованием MNP основаны на молекулярном распознавании антител, апгтемеров, биопротеинов, углеводов, спряженных к MNP патогенными бактериями1. Принимая во внимание, что siderophores признаются конкретных рецепторов на внешней мембране бактерий, они также могут быть связаны с MNP, чтобы увеличить их специфичность2. Siderophores являются небольшие органические молекулы, участвующие в Fe3 "поглощение бактериями3,4. О подготовке спряжений между бокофорами и МНП наряду с их оценкой для улавливания и изоляции бактерий пока не сообщалось.

Одним из важнейших шагов в синтезе конъюгированных магнитных наночастиц с небольшими молекулами является выбор типа связи или взаимодействия между ними для обеспечения того, чтобы небольшая молекула была прикреплена к поверхности MNP. По этой причине, процедура подготовки конъюгировать между магнитными наночастицами и фероксамином- siderophore признанных Yersinia enterocolitica-была сосредоточена на генерации модифицируемой поверхности MNP, чтобы увязать его ковалентно в siderophore карбодиимицидной химии. Для того, чтобы получить единый наночастицы магнетита (MNP) и улучшить нуклеацию и контроль размера, реакция solvolysis с бензиловым спиртом была проведена в тепловом блоке без встряхивания5. Затем кремнеземное покрытие было сгенерировано методом Стёбера для защиты и повышения устойчивости подвески наночастиц в aqueous media6. Принимая во внимание структуру фероксамина, введение аминь групп необходимо для производства подходящих наночастиц (MNP@SiO2@NH2),чтобы быть сопряжены с siderophore. Это было достигнуто путем конденсации (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) с алкогольными группами, присутствующими на поверхности кремнезема модифицированных наночастиц (MNP@SiO2) с использованием метода соль-геля7.

Параллельно комплекс фероксаминов железа (III) был подготовлен комплексом коммерческого дефероксамина с ацетонатом железа ацетилата в аквеевом растворе. N-succinylferoxamine, подшипник succinyl групп, которые будут выступать в качестве связунов, был получен реакцией фероксамина с сукциническим ангидридом.

Спюгация между MNP@SiO2@NH2 и N-succinylferoxamine дать MNP@SiO2@NHиФа была проведена через карбодииимид химии с использованием в качестве соединения реагентов бензорифотризол-1-й дифологтиуфос -оксофторофос (BOP) и 1-гидроксибензотриазол (HOBt) в мягком базовом носителе для активации терминальной кислотной группы в N-succinylferoxamine8. N

После того, как MNPs были охарактеризованы, мы оценили возможности голых и функциональных магнитных наночастиц для захвата дикого типа (WC-A) и мутант Y. enterocolitica не хватает фероксамина рецептора FoxA (FoxA WC-A 12-8). Равнины MNPs, функционализуемые MNPs и конъюгированных MNP@SiO2@NHФабыло разрешено взаимодействовать с каждым Y. enterocolitica штамма. Бактерии-конъюгированные агрегаты были отделены от бактерий подвески путем применения магнитного поля. Разделенные агрегаты дважды промывались фосфатным буферизированным физраствором (PBS), повторно приостанавливались в PBS для подготовки серийных разбавлений, а затем, они были покрыны для подсчета колоний. Этот протокол демонстрирует каждый шаг синтеза MNP@SiO2@NH@Fa, структурную характеристику всех промежуточных и конъюгированных, а также анализ захвата бактерии как простой способ оценить специфику спряжения по отношению к промежуточным. 9 9

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакций, выполняемых в условиях инертной атмосферы, вся стеклянная посуда была ранее высушена в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию, запечатана резиновой перегородкой и трижды продувается аргоном.

1. Синтез магнитных наночастиц, конъюгированных с фероксамином

  1. Синтез наночастиц магнитного синтеза Fe3O4 (MNPs)
    1. Добавьте 0,5 г Fe (acac)3 в стеклянный флакон 20 мл, а затем смешайте с 10 мЛ бензилового спирта.
    2. Sonicate эту смесь в течение 2 мин, затем передать в отопительный блок и тепла при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 72 ч.
    3. После завершения реакции дайте флаконам остыть, промыть наночастицы 96% этанолом и центрифугой при 4000 х г в течение 30 мин. Повторите центрифугирование не менее двух раз.
    4. Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита неодимия (NdFeB) и отбросить остаточный растворитель.
    5. Промыть с 96% этанола повторяя шаг 1.1.4. и отбросить супернатант, чередующийся с звуковой в ванне в течение 1 мин при 40 кГц, пока растворитель не будет выглядеть ясным.
  2. Магнитные наночастицы SiO2 покрытие (MNP@SiO2)
    1. Подготовьте подвеску 2 г МНП в 80 мл изопропанола, а затем добавьте 4 мл 21% аммиака, 7,5 мл дистиллированной воды и 0,56 мл тетраэтил ортилического ортосиликата (TEOS) (в этом порядке) в круглую нижнюю колбу с магнитной решеткой.
    2. Нагрейте смесь при температуре 40 градусов по Цельсию при непрерывном перемешивании, а затем sonicate в течение 1 ч.
    3. Отделить MNP с магнитом, отбросить супернатант, и разогнать его в 30 мл изопропанола.
    4. Повторите шаги 1.2.1. и 1.2.2.
    5. Удалить и вымыть магнитного перемешать бар с 96% этанола, чтобы восстановить весь материал.
    6. Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита.
    7. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
    8. Высушите наночастицы при вакууме при комнатной температуре в течение 12 ч.
  3. Функционализации MNP@SiO2 с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES)
    1. Промыть 500 мг MNP@SiO2, полученных от предыдущего шага с N,N-диметилформамид (DMF) под инертной атмосферой, а затем sonicate в течение 1 мин на 40 кГц. Затем отбросьте супернатант и повторите этот процесс три раза.
    2. Повторно приостановить частицы в круглой нижней колбе, под перемешиванием с магнитной бар перемешать и добавить 9 мл APTES.
    3. Перемешать смесь при 60 градусов по Цельсию на 12 ч.
    4. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
  4. Синтез фероксамина
    1. Растворите 100 мг (0,15 ммоль) соли дефоксамина мезилата и 53,0 мг (0,15 ммоль) Fe (acac)3 в 5 мл дистиллированной воды и перемешайте смесь на ночь при комнатной температуре.
    2. Вымойте полученный продукт три раза с 20 мл EtOAc в разделительной воронке, а затем удалить органический растворитель под вакуумом с помощью вращательного испарителя.
    3. Заморозить-сухой aqueous фазы позволить себе фероксамин, как красный твердый.
  5. Синтез N-сукцинильфероксимин
    1. Добавьте 350 мг (3,50 ммоль) сучцинического ангидрида в раствор 100 мг (0,17 ммоль) фероксамина в 5 л пиризина в 50-м л круглой нижней колбе под инертной атмосферой.
    2. Перемешать полученную смесь при комнатной температуре в течение 16 ч. По истечении этого времени, удалить избыток пиридин под пониженным давлением в ротатор испаритель, чтобы дать темно-красный твердый.
    3. Растворите реакцию сырой в 3 мл метанола.
    4. Перенесите метаноловый раствор в колонку Sephadex (20 см Sephadex в столбе диаметром 20 мм) и elute на 0,5 м/мин.
    5. Соберите красную фракцию и удалите метанол под вакуум с помощью ротатора испарительного.
  6. Синтез сопряженного MNP@SiO2@NH@Fa
    1. Промыть 30 мг сухого MNP@SiO2@NH2 дважды с DMF и sonicate наночастицы в 100 мл Erlenmeyer колбу в течение 30 минут под инертной атмосферой.
    2. Приготовьте раствор NN-succinylferoxamine (200 мг, 0,30 ммоль), бензотриазол-1-ил-окс-трис-(диметиламино)-фосфоний гексафторосфат (БОП, 173 мг, 0,45 ммоль), 1-гидроксибензотриоз (HOBt, 46 мг, 0,39 ммоль) и N,N-diisopropythylamine (DIPEA, 128,8 мг, 1,21 ммоль) в 10 ммл DMF (Mix A) в 50 мЛ круглое дном в атмосфере.
    3. Приостановить ранее промыть MNP@SiO2@NH2 в 3 мЛ DMF под sonication в сухих в условиях, свободных от кислорода с использованием аргона газовой атмосферы (Mix B).
    4. Добавить смесь А, чтобы смешать B dropwise.
    5. Встряхните окончательную смесь с помощью орбитального шейкера при комнатной температуре на ночь.
    6. Отделите полученную конъюгированную (MNP@SiO2@NH@Fa) от подвески с помощью магнита.
    7. Промыть полученный твердый, а затем, sonicate его пять раз с 10 мл этанола.
    8. Высушите твердое тело под вакуумом на 24 ч.

2. Бактериальный анализ с штаммами Y. enterocolitica для количественной оценки улавливания патогенных бактерий с помощью наночастиц

  1. Подготовьте суспензию всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгации в PBS на 1 мг/мл в стерильных 2 мЛ трубках.
  2. Приготовьте культуру Y. enterocolitica в 5 мл бульона Лурия Бертани (LB) ночью инкубации при 37 градусов по Цельсию.
  3. Приготовьте 5 мл железа дефицитный триптический соевый бульон (TSB), добавив 50 мл 10 мМ 2,2'-bipyridyl.
  4. Прививайте 5 мл железа дефицитным TSB с 50 мл ночной культуры Y. enterocolitica, а затем, инкубировать при 37 градусов по Цельсию с агитацией до тех пор, пока не будет достигнут OD600 и 0.5'u20120.8.
  5. Возьмите 100 мл культуры, полученной в шаге 2.4 и разбавляйте в трубке 2,0 мл, содержащей 900 мл PBS, чтобы получить первое разбавление 1/10. Затем подготовьте разбавление 1/100 от первого разбавления с помощью той же процедуры, чтобы получить концентрацию бактериальных клеток на 1 х 106 колонии Формация единиц (CFU)/mL примерно.
  6. Добавьте 100 мл наночастиц суспензии при 1 мг/мл до 1 мл от 1/100 разбавления бактериальной подвески в трубке 2,0 мл и гомогенизировать вихрем.
  7. Инкубировать культуру при 20 градусов по Цельсию на 1 ч.
  8. Разделите агрегаты MNP/bacteria с помощью магнита и тщательно отбросьте супернатант.
  9. Промыть разделенные наночастицы дважды с 1 mL PBS с помощью вихря.
  10. Приостановите наночастицы в 1 мл PBS, чтобы подсчитать количество бактериального захвата в CFU/mL.
  11. Подготовка четырех последовательных 1/10 разбавления от бывшей подвески до 1 х 10-4 разбавления достигается.
  12. Плита 10 мл каждого разбавления на пластины агара TS и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
  13. Фотография пластины с гелевым диджитализатором в эпи-белом режиме. Обработайте изображение с соответствующим программным обеспечением для усиления пятна для подсчета количества отдельных колоний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый промежуточный MNP был охарактеризован для наблюдения за ходом синтеза. Во-первых, голые депутаты были изучены XRD, чтобы проверить кристаллическую структуру. Затем, FT-IR спектр каждого промежуточного был запущен, чтобы проверить изменения, которые произошли в соответствующей реакции. Был также проведен анализ спектроскопии каждого промежуточного анализа Романа, с тем чтобы подтвердить выводы, сделанные из спектра FT-IR. Анализ TGA позволил оценить вес потери промежуточных веществ, несущих органический материал в его структуре. Морфология и размер каждого промежуточного были изучены TEM. Наконец, анализ XPS имеет решающее значение для определения состояния окисления атома на каждой промежуточной поверхности МНП и подтверждения образования ковалентных связей в конъюгированном MNP@SiO2@NH@Fa.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения морфологии и свойств каждого промежуточного и окончательного спряжения проводится исчерпывающая структурная характеристика. Для этого для демонстрации формирования конъюгации используются методы XRD, FT-IR, Рамановской спектроскопии, TGA, TEM, EDX mapping и XPS. Состояния окисления атомов на поверхности наночастиц, приобретенные рентгеновской фотоэлектронной спектроскопией (XPS), являются наиболее актуальными данными, подтверждающими образование ковалентных связей между наночастицами и бокофором. В соотве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает синтез спряжения между магнитными наночастицами и бокофором фероксамином путем ковалентной связи. Синтез магнетита был проведен с использованием протокола, о которого сообщает Pinna et al.5 с последующим кремнеземным покрытием для защиты магнитного ядра коррозии в аквеи, чтобы свести к минимуму агрегацию и обеспечить подходящую поверхность для функционализации6. Был изменен процесс кремнеземного покрытия. Вместо того, чтобы проводить три покрытия, ка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы с благодарностью признают профессора Клауса Хантке (Университет Тюбингена, Германия) за любезное снабжение штаммов Yersinia enterocolitica, используемых в этой работе. Эта работа была поддержана грантами AGL2015-63740-C2-1/2-R и RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) от Государственного агентства по исследованиям (AEI) Испании, финансируемого программой FEDER от Европейского союза. Работа в Университете Сантьяго-де-Компостела и Университете А Корунья также была поддержана грантами GRC2018/018, GRC2018/039 и ED431E 2018/03 (стратегическая группа CICA-INIBIC) от Сюй-де-Галиции. Наконец, мы хотим поблагодарить Нурия Кальво за ее большое сотрудничество делать голос-офф этого видео-протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-гидроксибензотриазола гидрат
HOBT		Acros300561000
2,2′-бипиридилсигма ОлдричD216305
3-аминопропилтриэтоксисилан 99%Acros151081000
раствор гидроксида аммония 28% NH<суб>3сигма Олдрич338818
Бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)-фосфоний гексафторфосфат BOP РеагентAcros209800050
Бензиловый спиртSigma Aldrich822259
Дефероксамина мезилатная соль >92,5% (TLC)Sigma AldrichD9533
Этанол, безводный, 96%Panreac131085
этилацетат, экстра чистый, SLR, Fisher Chemical
Ацетилацетонат железа (III) 97%Sigma AldrichF300
LB бульон (Lennox)Sigma AldrichL3022
N,N-диизопропилэтиламин, 99,5+%, AcroSealAcros459591000
N,N-диметилформамид, 99,8%, экстра сухой, AcroSealAcros326871000
пиридин, 99,5%, экстра сухой, AcroSealAcros
Sephadex LH-20Sigma AldrichLH20100
Янтарный ангидрид >99%Sigma Aldrich239690
Тетраэтилортосоликат >99,0%Sigma Aldrich86578
339421000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
  2. Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
  4. Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
  5. Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
  6. Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
  7. Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
  8. El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
  9. Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
  10. Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
  11. Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
  12. González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
  13. Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
  14. You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
  15. Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
  16. Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
  17. Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
  18. Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
  19. Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Yersinia enterocolitica

Похожие статьи