Здесь мы представляем протокол для измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, который позволил бы пользователю оценить индуцированные наркотиками возмущения сложной динамики eIF4F в форматах скрининга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Было показано, что формирование комплекса eIF4F является ключевым нисходящим узелом для конвергенции сигнальных путей, которые часто подвергаются онкогенной активации у людей. eIF4F является комплексом, связывающим крышку, участвующим в этапе набора мРНА-рибосомы для начала перевода. Во многих клеточных и доклинических моделей рака дерегулирование eIF4F приводит к увеличению перевода конкретных подмножего мРНК, которые участвуют в распространении и выживании рака. eIF4F - это гетеро-тримерный комплекс, построенный из подразделительного подразделения eIF4E, вертолетного шкафа eIF4A и строительного подразделения eIF4G. Критически важным для сборки активных комплексов eIF4F является белково-белковое взаимодействие между белками eIF4E и eIF4G. В этой статье мы описываем протокол для измерения сборки eIF4F, который отслеживает состояние взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках. Анализ взаимодействия белково-белковой системы eIF4e:4G также позволяет точно и надежно оценивать вызванные препаратом изменения в комплексной целостности eIF4F. Мы предполагаем, что этот метод может быть применен для проверки деятельности коммерчески доступных соединений или для дальнейшего скрининга новых соединений или методов, которые эффективно нарушают образование комплекса eIF4F.
Введение
Контроль экспрессии генов играет ключевую роль в правильном исполнении клеточных программ, таких как пролиферацию роста и дифференциацию. Механизм регулятивного контроля может осуществляться либо на уровне транскрипции генов, либо на уровне перевода мРНК. В последнее десятилетие становится все более очевидным, что трансляционный контроль путем модуляции процесса инициации, а не более поздних шагов удлинение и прекращение может тонко регулировать синтез конкретных подмножего белков, которые играют широкий спектр биологических функций.
Увеличение перевода мРНК, участвующих в выживании, антиавтофагических и анти-апоптотических ответов были вов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Линия клеток HEK293 была использована для протокола и была откощена в модифицированной иглой Dulbecco, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамином и 100 U/mL пенициллином/стрептомицином. Клетки были выущены при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 во влажной среде.
1. Количественная оценка комплексного сбоя eIF4F с помощью анализа дополнений eIF4E:eIF4G604-646
- Культура клеток и преходящая трансфекция анализа дополнений eIF4E:eIF4G604-646
- Используйте свежеоттая клетки с менее чем 20 проходами для всех экспериментов. На 1 день определите номер ячейки с помощью стан....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для проверки чувствительности системы дополнения eIF4E:eIF4G604-646 при посредничестве 4EBP1 было оценено ингибирование комплексной сборки eIF4F с помощью ингибиторов mTOR. Путем ингибирования mTORC1 киназы зависимого фосфорилирования 4EBP белка семьи, mTOR ингибирование повышает 4EBP1 ассоциации с eIF4E и, следовательно, eIF4F разборки15. Были протестированы два класса механистически разных ингибиторов мТОР киназы: рапалогов (например, рапамицин), котор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, описанный в этой статье, использует анализ дополнения на основе люциферазы для количественного мониторинга комплексной сборки eIF4F путем прямого измерения взаимодействия eIF4G-eIF4E в живых клетках. Мы предоставили подробную информацию для использования системы дополнения eIF4E-eIF4G, и мы также показали, что система является чрезвычайно точной в измерении наркотиков индуцированной 4EBP1-опосредованной диссоциации взаимодействия eIF4E-eIF4G16. Для того, чтобы облегчить пропускную способнос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана основным бюджетом от p53lab (BMSI, АЗХАРД) и ГРАНТА JCO VIP (АЗСТА).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 293FT клетки | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Микропланшет для клеточной культуры 96 лунок, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Титр клеток Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | неприменимый | |
| Finnpipette F2 Многоканальные пипетки 12-канальные 30-300 мл | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Многоканальные пипетки 12-канальные 5-50 мл | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Стартовые системы | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Восстановленная сыворотка Mediun, без фенола красного | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Орбитальный шейкер | Eppendorf | неприменим& | |
| гамма;-Аминофенил-м<суп>7ГТФ (C<суб>10-спейсер)-Агароза | Jena Bioscience | AC-155S |
Ссылки
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
