Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60850

⸱

1 мая 2020 г.

 ,  , 
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, который позволил бы пользователю оценить индуцированные наркотиками возмущения сложной динамики eIF4F в форматах скрининга.

Аннотация

Было показано, что формирование комплекса eIF4F является ключевым нисходящим узелом для конвергенции сигнальных путей, которые часто подвергаются онкогенной активации у людей. eIF4F является комплексом, связывающим крышку, участвующим в этапе набора мРНА-рибосомы для начала перевода. Во многих клеточных и доклинических моделей рака дерегулирование eIF4F приводит к увеличению перевода конкретных подмножего мРНК, которые участвуют в распространении и выживании рака. eIF4F - это гетеро-тримерный комплекс, построенный из подразделительного подразделения eIF4E, вертолетного шкафа eIF4A и строительного подразделения eIF4G. Критически важным для сборки активных комплексов eIF4F является белково-белковое взаимодействие между белками eIF4E и eIF4G. В этой статье мы описываем протокол для измерения сборки eIF4F, который отслеживает состояние взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках. Анализ взаимодействия белково-белковой системы eIF4e:4G также позволяет точно и надежно оценивать вызванные препаратом изменения в комплексной целостности eIF4F. Мы предполагаем, что этот метод может быть применен для проверки деятельности коммерчески доступных соединений или для дальнейшего скрининга новых соединений или методов, которые эффективно нарушают образование комплекса eIF4F.

Введение

Контроль экспрессии генов играет ключевую роль в правильном исполнении клеточных программ, таких как пролиферацию роста и дифференциацию. Механизм регулятивного контроля может осуществляться либо на уровне транскрипции генов, либо на уровне перевода мРНК. В последнее десятилетие становится все более очевидным, что трансляционный контроль путем модуляции процесса инициации, а не более поздних шагов удлинение и прекращение может тонко регулировать синтез конкретных подмножего белков, которые играют широкий спектр биологических функций.

Увеличение перевода мРНК, участвующих в выживании, антиавтофагических и анти-апоптотических ответов были вовлечены в несколько видов рака, а также были причинно связаны либо с аномальной активации или за выражение факторов инициацииперевода 1.

Комплекс eIF4F является мастер-регулятором инициирования перевода. Связывая кап-структуру на 5' конце мРНК, eIF4F является движущей силой первоначального набора мРНА-рибосомы и, в свою очередь, повышает эффективность перевода мРНК слабо переведенных эукариотическихмРНК 2. eIF4F опосредованное перевод связанных с раком mRNAs было сообщено для многих моделей рака укрывательство аномальной активации RAS / MAPK или АКТ / ТОР пути, предполагая, что раковые клетки upregulate eIF4F для повышения их собственной про-неопластической активности. Нарушение этой кормовой петли путем ингибирования комплексного формирования eIF4F является, таким образом, очень перспективной терапевтическойстратегией 3,4.

Комплекс eIF4F состоит из (i) eIF4E, кап-связывающего подразделения eIF4F, которое взаимодействует со структурой крышки, найденной в 5' UTR mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase и (iii) eIF4G, белок эшафота, который взаимодействует как с eIF4A, так и с eIF4E и который в конечном итоге набирает 40S рибосомныйсубъедин. eIF4G ассоциация с eIF4E является ограничивающим скорость шагом для сборки функциональных комплексов eIF4F и негативно регулируется связывающими белками eIF4E (4EBPs, члены 1, 2 и 3))6. Конкурируя с eIF4G, связывающим eIF4E через интерфейс, который состоит из канонических и неканонических eIF4Eсвязывающих последовательностей 7,8,9 (регион, охватывающий aa 604-646 на человеческом eIF4E), 4EBP уменьшает пул eIF4E, активно участвующих в переводе и предотвращении комплексного формирования eIF4F. Взаимодействие этих белково-белковых взаимодействий в основном регулируется целью млекопитающих рапамицина (mTOR)-опосредованного фосфорилирования 4EBP. При митогенных стимулах mTOR непосредственно фосфорилатирует членов семьи белков 4E-BP, уменьшая их связь с eIF4E и тем самым способствуя взаимодействию eIF4E-eIF4G и формированию функциональных комплексов eIF4F10.

Несмотря на большие усилия по разработке соединений, ориентированных на сложную целостность eIF4F, отсутствие анализов, измеряя прямое нарушение взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, ограничило поиск клеточных активных пораженных соединений. Мы применили анализ люциферазы на основе аналога коэнтеразина (например, анализ дополнений на основе Nanoluc) для мониторинга в режиме реального времени состояния целостности eIF4F через взаимодействие eIF4E-eIF4G. Белковая система дополнения люциферазы состоит из фрагмента белка 18 кДа (SubA) и 11 аминокислот пептидного фрагмента (SubB), оптимизированного для минимальной самоа ассоциациии стабильности 11. После того, как выражается как продукт синтеза с человеческой полной длины eIF4E и eIF4E взаимодействия домена от человека eiF4G1 (аа 604-646), два взаимодействующих белков принесет SubA и SubB фрагмент в непосредственной близости друг от друга и будет вызывать образование активной люциферазы, что, в присутствии ячейки проницаемый субстрат, в конечном итоге генерировать яркий люминесцентный сигнал (Рисунок 1). Мы сообщали в других местах о строительстве и проверке системы дополнения eIF4E:eIF4G604-646 16.

Здесь мы описываем, как система дополнения eIF4E:eIF4G604-646 (доступна по запросу) может быть применена для точного измерения нарушения работы 4EBP1 при посредничестве eIF4E-eIF4G в живых клетках. Кроме того, мы демонстрируем его полезность, измеряя эффекты нескольких ингибиторов mTOR, которые в настоящее время находятся под клиническими испытаниями в качестве потенциальных терапевтическихпрепаратов рака 12. Поскольку внецелеспособные эффекты часто маскируют деятельность, связанную с наркотиками, мы также описываем, как универсальность измерения системы eIF4E:eIF4G604-646 может быть расширена с помощью ортогональных измерений клеточной жизнеспособности с учетом этих данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Линия клеток HEK293 была использована для протокола и была откощена в модифицированной иглой Dulbecco, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамином и 100 U/mL пенициллином/стрептомицином. Клетки были выущены при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 во влажной среде.

1. Количественная оценка комплексного сбоя eIF4F с помощью анализа дополнений eIF4E:eIF4G604-646

  1. Культура клеток и преходящая трансфекция анализа дополнений eIF4E:eIF4G604-646
    1. Используйте свежеоттая клетки с менее чем 20 проходами для всех экспериментов. На 1 день определите номер ячейки с помощью стандартного счетчика ячеек и подсчитайте общие жизнеспособные ячейки с помощью метода исключения trypan blue13.
    2. Семена 6-хорошо пластин с 0,9 - 1,2 х 106 HEK 293 клеток на колодец в 2 мл стандартной среды роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучшей эффективности трансфекции в клеточных линиях, указанных выше, убедитесь, что поцароченные клетки 70-90% стечения на следующий день после посева.
    3. Утром 2-го дня, совместно трансфектные клетки с SubA-eIF4E и eIF4G604-646-SubB плазмид с использованием липидной трансфекции реагент (см. Таблицу материалов), как описано ниже.
      1. Разбавить 9 МКЛ раствора на основе липосомы в трубке, содержащей 125 МКЛ пониженной среды сыворотки без фенола красного цвета (см. Таблицу материалов)для каждой трансфекции и инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут.
      2. Подготовка мастер смесь ДНК путем разбавления 3 мкг каждой плазмиды в 125 МКЛ уменьшенной среде сыворотки для каждой трансфекции трубки.
      3. Добавьте 12 йл реагентов усилителя в трубку смеси мастера ДНК, хорошо перемешайте и немедленно добавьте ДНК: усилитель мастер-микс к каждой трубке разбавленных липосом в соотношении 1:1. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
      4. Добавьте к каждому хорошо ДНК-липидный комплекс и инкубировать клетки в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 в течение 24 ч.
    4. Утром 3 дня, промыть каждый колодец с 1 мл PBS.
    5. Удалите PBS и инкубировать клетки в каждом хорошо с 0,3 мл трипсина в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию.
    6. Нейтрализовать трипсин, добавив 2 мл уменьшенной среды сыворотки без фенола красного, содержащего 0% FCS в каждой хорошо и передачи трансфицированных клеток в 15 мл трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный может вмешиваться в активность люциферазы; таким образом, клетки должны быть обработаны с этого шага вперед в среде без фенола красного цвета.
    7. Спин вниз клетки в течение 5 мин на 290 х г и аспирировать среды. Resuspend клетки в 2 мл уменьшенной среды сыворотки без фенола красный, содержащий 0% FCS. Подсчитайте, как описано в шаге 1.1.
    8. Семена трансфицированных HEK 293 клеток в 96 хорошо непрозрачных пластин при плотности 30000 клеток на колодец в 90 йл среды без фенола красный, содержащий 0% FCS. Для того, чтобы получить 3 технических репликаций в рамках одного и того же эксперимента для 3 различных соединений, семена 60 скважин пластин с клетками, исключая скважины по краям.
    9. Сразу же после посева трансфицированных клеток добавьте 10 МКЛ из 10% раствора соединения DMSO (см. шаг 1.2).
  2. Соединение подготовки
    1. Подготовка 1 мМ комплекс фондовых решений путем растворения соединения интереса в 100% DMSO (v/v). Для того, чтобы иметь 3 репликации для каждого соединения titration, используйте 8 йл из 1 мМ комплекс запасов раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 1 мМ фондового соединения используется больше, чем это необходимо. Это делается с учетом ошибок трубопроводов, если таковые имеются.
    2. Выполните 2-кратное серийное разбавление раствора соединения запасов с 4 йл запаса 1 мм в 4 МКЛ 100% DMSO для каждой точки титрования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного соединения titration, выполнить 9 серийных разбавления из стартового запаса в 100% DMSO. Если несколько соединений должны быть проверены, используйте 96 пластины и многоканальный пипетку для облегчения этого шага и последующих разбавлений.
    3. Добавьте 36 л стерильной воды класса HPLC для каждой точки 2-кратного серийного разбавления, чтобы подготовить 40 л 10-кратного рабочего решения в 10% DMSO (v/v) (т.е. От 100 МКМ до 0,39 МКМ 10% DMSO фондовой серии приведет к окончательному решению от 10 МКМ до 0,039 МКМ, в 1% DMSO при добавлении к ячейкам). Что касается контроля очистки, также подготовить 10% DMSO только фондовый раствор в HPLC класса стерильной воды.
    4. Добавьте 10 МКЛ 10-х рабочих растворов к клеткам в 96 хорошо непрозрачной пластине для того, чтобы дать предназначенную окончательную концентрацию с остаточной концентрацией DMSO 1% (v/v) в общем объеме 100 МКЛ и инкубировать в течение 3 ч при 37 градусах Цельсия с 5% v/v атмосферной CO2.
  3. Luciferase дополнения и жизнеспособности анализа
    1. После 3 ч употребления наркотиков начните готовить субагент люциферазы, объединив 1 том субстрата с 19 томами разбавляемого реагента (см. инструкции производителя).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ люциферазы выполняется с использованием коммерчески доступного комплекта (см. таблицу материалов).
    2. Используйте многоканальный пипетку, чтобы немедленно добавить 25 МКЛ субстрат-реагента.
    3. Встряхните пластину при 350 об/мин в течение 50 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
    4. Оцените люминесценцию с помощью считыватель пластин. Для этого установите зеркальный считыватель на люминесценцию и фильтр выбросов на 455. Используйте измеримую высоту 6,5 мм со временем измерения 1 с.
    5. Для того, чтобы ослов жизнеспособности клеток, добавить 33 йл жизнеспособности анализа реагента, а затем повторно измерить люминесценцию снова после 15 мин при комнатной температуре, используя пластины читателя.
    6. Оцените люминесценцию с помощью считыватель пластин, установив зеркальный считыватель на люминесценции и фильтр выбросов на 600 нм. Используйте измеримую высоту 6,5 мм со временем измерения 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность оценивается путем измерения внутриклеточного уровня АТФ при лизе клеток в соответствии с инструкциями производителя. Мультиплексирование возможно в этом случае, так как жизнеспособность анализа использует различные люциферазы с другой длины волны излучения.
    7. Используйте данные для определения значений IC50 каждого соединения по кривой, подходящей для данных в уравнение кривой 4 параметра:
      Y (A-D)/(1"(x/C))
      Числовые значения D и A должны быть ограничены в процессе установки кривой:
      D - люминесцентное значение на оси Y для минимального асимптота кривой или минимального теоретического уровня реакции, ожидаемого от анализа дополнения eIF4E:4G.
      - люминесцентное значение на оси Y для максимального асимптота кривой или ответа максимального теоретического уровня, ожидаемого от анализа дополнения eIF4E:4G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение для минимального ответа вытекает из 1% DMSO (v/v) контрольной обработки и значение для максимального ответа происходит от максимальной реакции ингибитора mTOR высокой сродства, который плато без какого-либо влияния на жизнеспособность клеток.

2. Корреляция eIF4E:eIF4G604-646 ингибирование анализа с комплексным нарушением eIF4F в клетках

  1. Чтобы подтвердить, что сигнал, измеряемый анализом, соответствует физическому нарушению взаимодействия eIF4E-eIF4G соединением, семенные клетки, описанные в шаге 1.1.
  2. На следующий день заменить средний с 1 мл уменьшенной среде сыворотки, не содержащей фенол красный и инкубировать в течение 4 ч с соединением интереса. Обеспечить остаточную концентрацию DMSO 1% (v/v) в общем объеме 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы легко позволить корреляцию с результатом, использовать соединения концентраций в начале, средней точке и конечной точке измеренной кривой титрации анализа дополнения.
  3. Lyse клетки ивыполняется м 7GTP тянуть вниз, чтобы изолировать eIF4F и eIF4E:4EBP1 комплексов. Подробные процедуры о том, как выполнить m7GTP стащить эксперимент можно найти в другомместе 14.
  4. Обнаружитьм 7GTP связанных eIF4G, eIF4E и 4EBP1 белковых уровней по западному анализу пятно, а затем коррелируют с eIF4F сложных нарушений с ингибированием анализа добавок сигнала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для проверки чувствительности системы дополнения eIF4E:eIF4G604-646 при посредничестве 4EBP1 было оценено ингибирование комплексной сборки eIF4F с помощью ингибиторов mTOR. Путем ингибирования mTORC1 киназы зависимого фосфорилирования 4EBP белка семьи, mTOR ингибирование повышает 4EBP1 ассоциации с eIF4E и, следовательно, eIF4F разборки15. Были протестированы два класса механистически разных ингибиторов мТОР киназы: рапалогов (например, рапамицин), котор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный в этой статье, использует анализ дополнения на основе люциферазы для количественного мониторинга комплексной сборки eIF4F путем прямого измерения взаимодействия eIF4G-eIF4E в живых клетках. Мы предоставили подробную информацию для использования системы дополнения eIF4E-eIF4G, и мы также показали, что система является чрезвычайно точной в измерении наркотиков индуцированной 4EBP1-опосредованной диссоциации взаимодействия eIF4E-eIF4G16. Для того, чтобы облегчить пропускную способнос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана основным бюджетом от p53lab (BMSI, АЗХАРД) и ГРАНТА JCO VIP (АЗСТА).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
293FT клеткиThermo Fisher ScientificR70007
Микропланшет для клеточной культуры 96 лунок, F-Bottomgreiner bio-one655083
Титр клеток Glo 2.0PROMEGAG9241
Envision Multilabel ReaderPerkinElmerнеприменимый
Finnpipette F2 Многоканальные пипетки 12-канальные 30-300 млThermo Fisher Scientific4662070
Finnpipette F2 Многоканальные пипетки 12-канальные 5-50 млThermo Fisher Scientific4662050
FUGENE6PROMEGAE2692
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015
NanoBiT PPI Стартовые системыPROMEGAN2014
Optimem I Восстановленная сыворотка Mediun, без фенола красногоThermo Fisher Scientific11058021
Орбитальный шейкерEppendorfнеприменим&
гамма;-Аминофенил-м<суп>7ГТФ (C<суб>10-спейсер)-АгарозаJena BioscienceAC-155S

Ссылки

  1. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
  3. Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
  4. Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
  5. Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
  6. Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
  7. Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
  8. Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
  9. Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
  10. Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
  11. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  12. Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
  14. Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
  15. Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819(2013).
  16. Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40(2019).
  17. Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ белок-белковых взаимодействийвизуализация живых клетоклюциферазный репортерный анализскрининг ингибиторов mTORклетки HEK 293вестерн-блот-анализm7GTP-пулл-даунанализ жизнеспособности клетокпротокол серийного разведения
Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.