Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках

Summary

Здесь мы представляем протокол для измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, который позволил бы пользователю оценить индуцированные наркотиками возмущения сложной динамики eIF4F в форматах скрининга.

Abstract

Было показано, что формирование комплекса eIF4F является ключевым нисходящим узелом для конвергенции сигнальных путей, которые часто подвергаются онкогенной активации у людей. eIF4F является комплексом, связывающим крышку, участвующим в этапе набора мРНА-рибосомы для начала перевода. Во многих клеточных и доклинических моделей рака дерегулирование eIF4F приводит к увеличению перевода конкретных подмножего мРНК, которые участвуют в распространении и выживании рака. eIF4F - это гетеро-тримерный комплекс, построенный из подразделительного подразделения eIF4E, вертолетного шкафа eIF4A и строительного подразделения eIF4G. Критически важным для сборки активных комплексов eIF4F является белково-белковое взаимодействие между белками eIF4E и eIF4G. В этой статье мы описываем протокол для измерения сборки eIF4F, который отслеживает состояние взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках. Анализ взаимодействия белково-белковой системы eIF4e:4G также позволяет точно и надежно оценивать вызванные препаратом изменения в комплексной целостности eIF4F. Мы предполагаем, что этот метод может быть применен для проверки деятельности коммерчески доступных соединений или для дальнейшего скрининга новых соединений или методов, которые эффективно нарушают образование комплекса eIF4F.

Introduction

Контроль экспрессии генов играет ключевую роль в правильном исполнении клеточных программ, таких как пролиферацию роста и дифференциацию. Механизм регулятивного контроля может осуществляться либо на уровне транскрипции генов, либо на уровне перевода мРНК. В последнее десятилетие становится все более очевидным, что трансляционный контроль путем модуляции процесса инициации, а не более поздних шагов удлинение и прекращение может тонко регулировать синтез конкретных подмножего белков, которые играют широкий спектр биологических функций.

Увеличение перевода мРНК, участвующих в выживании, антиавтофагических и анти-апоптотических ответов были вов....

Protocol

Линия клеток HEK293 была использована для протокола и была откощена в модифицированной иглой Dulbecco, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамином и 100 U/mL пенициллином/стрептомицином. Клетки были выущены при 37 градусах Цельсия с 5% CO₂ во влажной среде.

1. Количественная оценка комплексного сбоя eIF4F с помощью анализа дополнений eIF4E:eIF4G^604-646

1. Культура клеток и преходящая трансфекция анализа дополнений eIF4E:eIF4G^604-646
   1. Используйте свежеоттая клетки с менее чем 20 проходами для всех экспериментов. На 1 день определите номер ячейки с помощью стан....

Results

Для проверки чувствительности системы дополнения eIF4E:eIF4G^604-646 при посредничестве 4EBP1 было оценено ингибирование комплексной сборки eIF4F с помощью ингибиторов mTOR. Путем ингибирования mTORC1 киназы зависимого фосфорилирования 4EBP белка семьи, mTOR ингибирование повышает 4EBP1 ассоциации с eIF4E и, следовательно, eIF4F разборки¹⁵. Были протестированы два класса механистически разных ингибиторов мТОР киназы: рапалогов (например, рапамицин), котор.......

Discussion

Метод, описанный в этой статье, использует анализ дополнения на основе люциферазы для количественного мониторинга комплексной сборки eIF4F путем прямого измерения взаимодействия eIF4G-eIF4E в живых клетках. Мы предоставили подробную информацию для использования системы дополнения eIF4E-eIF4G, и мы также показали, что система является чрезвычайно точной в измерении наркотиков индуцированной 4EBP1-опосредованной диссоциации взаимодействия eIF4E-eIF4G¹⁶. Для того, чтобы облегчить пропускную способнос.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT клетки	Thermo Fisher Scientific	R70007
Микропланшет для клеточной культуры 96 лунок, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Титр клеток Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	неприменимый
Finnpipette F2 Многоканальные пипетки 12-канальные 30-300 мл	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Многоканальные пипетки 12-канальные 5-50 мл	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Стартовые системы	PROMEGA	N2014
Optimem I Восстановленная сыворотка Mediun, без фенола красного	Thermo Fisher Scientific	11058021
Орбитальный шейкер	Eppendorf	неприменим&
гамма;-Аминофенил-м<суп>7ГТФ (C<суб>10-спейсер)-Агароза	Jena Bioscience	AC-155S