Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка внутриклеточных белковых сенсоров в клетках млекопитающих

2.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28 апреля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для инженерии генетически кодируемых внутриклеточных белковых сенсорных актуаторов. Устройство специфически обнаруживает целевые белки через внутриклеточные антитела (интратела) и реагирует на это включением транскрипционного выхода генов. Общая структура построена для быстрой замены интрател, что позволяет быстро обнаруживать любой желаемый белок без изменения общей архитектуры.

Аннотация

Белки могут функционировать как биомаркеры патологических состояний, таких как нейродегенеративные заболевания, инфекции или метаболические синдромы. Инженерия клеток для восприятия и реагирования на эти биомаркеры может помочь в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе патологий, а также в разработке новых клеточных методов лечения. Несмотря на то, что было разработано несколько систем, которые обнаруживают внеклеточные белки, модульная структура, которую можно легко перепроектировать для распознавания различных внутриклеточных белков, отсутствовала.

В этой статье мы описываем протокол реализации модульной генетической платформы, которая распознает внутриклеточные белки и активирует определенный клеточный ответ. Устройство работает с внутриклеточными антителами или малыми пептидами для определения с высокой специфичностью интересующего белка, запуская транскрипционную активацию выходных генов через модуль активации на основе протеазы TEV (TEVp). TEVp представляет собой вирусную протеазу, которая избирательно расщепляет короткие родственные пептиды и широко используется в биотехнологии и синтетической биологии благодаря своей высокой ортогональности к сайту расщепления. В частности, мы разработали устройства, которые распознают и реагируют на белковые биомаркеры вирусных инфекций и генетических заболеваний, включая мутировавший гентингтин, серин-протеазу NS3, белки Tat и Nef для выявления инфекций болезни Хантингтона, вируса гепатита С (HCV) и вируса иммунодефицита человека (HIV) соответственно. Важно отметить, что система может быть вручную настроена для желаемого функционального результата «вход-выход», такого как флуоресцентное считывание данных биосенсоров, стимуляция презентации антигена для иммунного ответа или инициирование апоптоза для уничтожения нездоровых клеток.

Введение

Изучение и модуляция клеточных реакций с помощью управляемых инженерных генных цепей являются основными целями в синтетической биологии 1,2,3 для разработки перспективных инструментов с соответствующими биологическими или медицинскими приложениями при раке4, инфекциях5, метаболических заболеваниях6 и иммунологии7.

Перепрограммирование клеточных функций в ответ на определенные сигналы требует разработки интеллектуальных интерфейсов, которые связывают обнаружение внеклеточных или внутриклеточных динамических изменений (входа) с последующей обработкой, запуская специфический выход либо в диагностических целях (т.е. репортерные гены), либо для перестройки клеточного ответа (терапия). Входными данными, обнаруживаемыми сенсорным модулем, могут быть малые аналиты8, белки 9,10,11 или микроРНК 11,12,13, специфичные для начала или прогрессирования заболевания. Кроме того, регуляция сложной схемы может быть достигнута за счет многократной обработки входной информации, увеличивающей жесткий контроль над экспрессией трансгена в ответ на определенные условия 14,15,16. Например, сенсоры на основе микроРНК могут идентифицировать определенные типы клеток, такие как раковые клетки, индуцируя их клиренс с помощью экспрессии апоптотического гена13. Поскольку микроРНК легко реализуются в синтетических схемах модульным способом, они представляют собой широко используемый вход для генетически кодируемых биосенсоров 12,13,17. Белки также являются действительным биомаркером генетических мутаций, рака и инфекций, и действительно, сообщалось о ряде внеклеточных устройств, чувствительных к белкам.

Многие схемы, которые обнаруживают внеклеточные белки, основаны на использовании сконструированных рецепторов, которые связывают фактор транскрипции (TF) с мембраной, слитой с TEVp-чувствительным сайтом расщепления (TCS). Основным преимуществом TEVp является специфичность расщепления и отсутствие помех в процессинге эндогенных белков. В этих системах TEVp сливается со вторым пептидом, который взаимодействует с сконструированным рецептором при связывании внеклеточных молекул. Таким образом, внешние входы индуцируют TEVp-опосредованное расщепление и высвобождение TF. Системы, которые функционируют с этим механизмом, — это Tango/TEVp18, светоиндуцированная20 и модульная внеклеточная сенсорная архитектура (MESA)19. Несмотря на прогресс в обнаружении внеклеточных белков, технология модульного зондирования внутриклеточных белков никогда ранее не была реализована, с ограничением в прохождении множества итераций по сборке и тестированию для отдельных устройств, реагирующих на конкретный белок.

Наша система является первой платформой для внутриклеточного зондирования белков21. Модульность гарантируется использованием интрател, которые определяют специфичность к мишени, в то время как перепрограммирование клеток опосредовано TEVp. В частности, одно внутреннее тело связывается с мембраной и сливается с С-концом с флуоресцентным белком mKate, TCS и TF (гибридный белок 1); второй внутриорганный раствор слит с TEVp и расположен в цитозоле (гибридный белок 2) (рис. 1).

Таким образом, взаимодействие между двумя внутренними телами и белком-мишенью происходит в цитоплазме и приводит к расщеплению TCS по TEVp, что приводит к транслокации TF в ядро для активации функционального выхода. Чувствительно-исполнительное устройство было успешно протестировано для четырех внутриклеточных белков, специфичных для заболевания: сериновой протеазы NS3, экспрессируемой вирусом HCV22, белков Tat и Nef из ВИЧ-инфекции 23,24 и мутировавшего гентингтина (HTT) болезни Хантингтона25. Выходная экспрессия включает флуоресцентные репортеры, ген апоптоза (hBax)26 и иммуномодуляторы (XCL-1)27. Мы показываем, что система также может нарушать патологическую функциональность своих мишеней. Например, Nef-чувствительное устройство препятствует распространению вирусной инфекции путем секвестрации целевого белка и обратного подавления рецептора HLA-I на инфицированных Т-клетках24. Описанная сенсорно-активирующая платформа является первой в своем роде для обнаружения внутриклеточных белков и потенциально может быть реализована для обнаружения аномальной экспрессии белков, посттрансляционных или эпигенетических модификаций, в диагностических и терапевтическихцелях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Принципы проектирования конструкции и испытания сенсорно-исполнительного устройства

  1. Выберите интересующий вас белок.
    Примечание: Мы разработали систему для белков, расположенных в цитоплазме или перемещающихся между цитоплазмой и другими компартментами.
  2. Выберите два внутренних тела, связывающих разные эпитопы белка-мишени. В нашем исследовании мы отобрали белки, для которых интратела уже были разработаны и протестированы 28,29,30,31. Когда интратела недоступны, их следует разрабатывать заново.
    Примечание: Альтернативой интрателтам могут быть другие молекулы, которые взаимодействуют с интересующим белком. Например, сенсорное устройство Nef включает в себя одно внутрительное устройство (sdAb19) и домен SH3 протеинтирозинкиназы p59fyn32.
  3. Дизайн in silico плазмид с последовательностями ДНК, кодирующими гибридные белки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для проектирования плазмид доступно бесплатно или может быть приобретено.
    1. Генерируйте последовательности, включающие следующие модули: мембранная метка, флуоресцентный маркер (например, mKate), intrabody, TCS и TF для гибридного белка 1 и intrabody и TEVp для гибридного белка 2.
      Примечание: Построение новой архитектуры, основанной на взаимодействии нескольких компонентов, требует внимания к параметрам, которые могут максимизировать активацию сигнала при обнаружении целевого белка. В частности, мы сосредоточились на активности TEVp и гибкости химерных белков для облегчения белок-белкового взаимодействия (табл. 1). Все эти особенности указаны в следующих пунктах.
    2. Вставьте гибкий глицин-сериновый линкерный домен (LD) между внутрителовым TCS и/или TEVp-внутрителовым соединением. ЛД может иметь переменную длину (0, 10 или 15 аминокислот-АА).
    3. Гибридный белок 1: Варианты дизайна, включающие высокоаффинный TCS (S) или низкоаффинный TCS (L) для регуляции активности расщепления TEVp. Выражение этого конструкта управляется конститутивным промотором. Включите GAL4VP16 фактор транскрипции в С-конце TCS, чтобы обеспечить транслокацию в ядро при расщеплении TEVp.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали промотор hEF1a, но можно выбрать и другие конститутивные промоторы.
    4. Слитый белок 2: Используйте конститутивный (hEF1a) или индуцируемый доксиклицином (pTET) промотор для настройки транскрипции TEVp. Используйте домен деградации (DD), регулируемый низкомолекулярным экраном, для модуляции стабильности белка.
      Примечание: Потенциально могут быть выбраны другие индуцируемые системы, которые настраивают экспрессию белка.
    5. Результат: Поместите репортерный ген ниже промотора UAS, который реагирует на GAL4VP16 фактор транскрипции. Выберите выход в соответствии с назначением прибора (например, флуоресцентный белок, цитокин и т. д.).
  4. Выполняйте клонирование с любой предпочитаемой стратегией. Здесь мы создали плазмиды с технологиями золотых ворот или шлюзов.
  5. Протестируйте различную конфигурацию устройства в нужных клеточных линиях с помощью транзиентной трансфекции. Котрансфектировать клетки полученными плазмидами для слияния белков 1 и 2 и флуоресцентного репортерного гена, такого как UAS-EYFP. Гибридный белок 1 включает красный флуоресцентный белок (мкат), используемый в качестве трансфекционного маркера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с простых для трансфекции клеточных линий, таких как HEK293FT клеток, для тестирования устройств.
    1. Трансфекция в HEK293FT клетки. Засейте 2 x 105 клеток в 24-луночный планшет с 500 μл DMEM. Трансфектировать клетки с 300 нг общей ДНК с помощью трансфекционного реагента, сделать смесь вихревой и инкубировать при ЛТ в течение 20 минут.
      1. Поместите клетки в инкубатор с температурой 37 °C/5%CO2 . Добавьте свежую питательную среду через 24 ч после трансфекции.
    2. Трансфекция в клетки Юрката. Используйте 3 x 105 клеток в 500 мкл среды для культивирования клеток RPMI для 24-луночного планшета. Проводите электропорацию в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 2-4 г общей ДНК для каждого образца. Добавьте 500 мкл свежей питательной среды для клеточных культур через 24 ч после трансфекции.
      1. Во время электропорации поместите клетки и смесь ДНК на лед. Затем поместите клетки в инкубатор с температурой 37 °C / 5%CO2 .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Различные клеточные линии и методы трансфекции могут быть выбраны в соответствии с конкретным применением устройства.
  6. Получение изображений с микроскопа для получения качественного представления о функциональных возможностях устройства. Подтвердите мембранную локализацию гибридного белка 1 путем обнаружения флуоресцентного сигнала (мкат) в непосредственной близости от клеточной мембраны. Визуализируйте флуоресцентный выход (EYFP) в присутствии или отсутствии (negative control-NC) целевого белка.
    1. Используйте систему визуализации клеток, оснащенную световыми кубами Tx Red и GFP, для обнаружения флуоресцентных белков mKate и EYFP. Используйте объектив 10x или 20x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нетрансфицированные клетки, чтобы убедиться в отсутствии аутофлуоресценции.
  7. Проанализируйте трансфекцию с помощью проточной цитометрии (FACS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки образцов см. Протокол 2.
    1. Оцените устройства в присутствии целевого белка. Создать экспериментальную матрицу, которая сочетает в себе варианты гибридного белка 1 и 2, модулируя TEVp с (i) конститутивным промотором hEf1a, (ii) индуцируемым доксициклином промотором TET и (iii) экраном для стабильности белка. Добавьте доксициклин и защитите в концентрациях (0-1000 нМ).
    2. Выполните анализ FACS для сравнения индукции EYFP в зависимости от уровня индукции EYFP между образцами с интересующим белком или без него.
      Примечание: Наибольшая кратная индукция соответствует наибольшей входной чувствительности в режиме ON (присутствие целевого белка) по сравнению с режимом OFF (отсутствие целевого белка).
  8. Протестируйте функциональность устройства с учетом нужных приложений.
    1. Проведите анализ FACS для измерения уровней выходных белков или апоптоза, или других соответствующих анализов.
    2. Проводите анализ методом ОТ-ПЦР, если выходная часть устройства регулирует уровни экспрессии генов-мишеней. Рассчитайте 2-ddCT по отношению к домашнему гену (GAPDH или эквиваленту) и сравните кратное изменение выходной экспрессии в режимах ON и OFF.

2. Пробоподготовка для анализа проточной цитометрии

  1. Количественный анализ белковых устройств проводят с помощью проточного цитометра (FACS) через 48 ч после трансфекции.
    1. Аспирируйте среду DMEM и промойте HEK293FT ячейки 300 μл PBS. Добавьте 100 μL трипсина и оставьте в инкубаторе с температурой 37 °C/5%CO2 на 2-4 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Джурката не требуют трипсина.
    2. Добавьте 400 мкл среды DMEM без фенолового красного и ресуспендируйте клетки, чтобы избежать образования комков. Перенос в трубках FACS.
    3. Используйте проточный цитометр, оснащенный лазерами с длиной волны 405, 488 и 561 нм.
    4. Соберите 30 000 – 100 000 событий, отобранных из популяции живых клеток, используя следующие настройки цитометра: лазер 488 нм и полосовой фильтр 530/30 нм для EYFP/EGFP, лазер 561 нм и фильтр 610/20 нм для mKate, а также лазер 405 нм, фильтр 450/50 для EBFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки проточного цитометра включите в него нетрансфицированные клетки и клетки, трансфицированные одиночными флуоресцентными белками.
    5. Выполняйте анализ собранных образцов с помощью предпочитаемого программного обеспечения (например, программного обеспечения DIVA, Flowjo или метода TASBE33).

3. Определение характеристик сенсорно-исполнительного устройства HCV

  1. Выберите внутренние тела для обнаружения белка NS3. scFv35 и scFv162 связываются с двумя разными эпитопами и поэтому были выбраны.
  2. Разработка и тестирование вариантов NS3-чувствительного устройства в соответствии с обоснованием, описанным в шаге 1.3 (например, гибридный белок 1: мембранная метка, mKate, одноцепочечный фрагмент внутрителового scFv35, LD0, TCS-L и TF GAL4VP16; Гибридный белок 2: одноцепочечный фрагмент внутрителового scFv162, LD0 и TEVp; Выход: UAS-EYFP или UAS-hBax (апоптоз); NS3 (см. таблицу 2)).
  3. Протестируйте конструкции в HEK293FT ячейках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента установите отрицательный контроль, то есть подачу устройства и количественное определение на выходе в отсутствие интересующего белка.
    1. Испытайте устройства на TEVp под действием конститутивного промотора в присутствии или отсутствии NS3. Проводите трансфекцию гибридного белка 1 (шаг 1.3.3), гибридного белка 2 (шаг 1.3.4) и этапа выхода EYFP (1.3.5) в HEK293FT клетках, как описано в шаге 1.5.1. Проанализируйте образцы через 48 ч после трансфекции путем измерения флуоресцентного репортера (EYFP) с помощью проточной цитометрии (протокол 2).
    2. Оцените взаимодействие внутрител-NS3 с помощью колокализации mKate и BFP с использованием гибридного белка BFP-NS3. Трансфектируйте клетки со слитым белком 1, который включает mKate, и с BFP-NS3. Через 48 ч после трансфекции наблюдайте за клетками под конфокальным микроскопом (объектив 63x) для проверки на колокализацию флуоресцентных белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте BFP (не сросшийся с NS3) в качестве отрицательного контроля. В этом состоянии BFP должна демонстрировать диффузную клеточную локализацию и не должна колокализоваться с мембраносвязанной mKate.
    3. Протестируйте устройства на ТЭВП под промотором пТЭТ в присутствии или отсутствии NS3. Сравните EYFP по отсутствию и наличию NS3. Ко-трансфектируют клетки со слитым белком 1 (шаг 1.3.3), гибридным белком 2 (шаг 1.3.4) и выходом EYFP (шаг 1.3.5) с использованием протокола, описанного в шаге 1.5.1. Трансфекции проводятся при наличии или отсутствии NS3. Проанализируйте образцы через 48 ч после трансфекции путем измерения флуоресцентного репортера (EYFP) с помощью проточной цитометрии (протокол 2).
  4. Тестовое уничтожение ячейки управляется устройством NS3.
    1. Замените выход EYFP на апоптотический ген hBax.
    2. Повторите шаг 3.3.3. Соберите клетки через 48 ч после трансфекции и промойте PBS перед началом анализа.
    3. Проводят анализ на апоптоз с помощью Аннексина V в конъюгированном с Pacific Blue. Окрашивают клетки маркером апоптоза Аннексин V (конъюгированный с 2,5 мкл тихоокеанского лабя) разведенным в связывающем буфере (объемное отношение 1:20) в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Анализируйте клетки с помощью проточной цитометрии. Рассчитайте уровень апоптоза в популяции как количество положительных клеток Pacific-Blue (Annexin V).

4. Характеристика Nef-чувствительного сенсорно-исполнительного устройства на ВИЧ

  1. Выберите интратела, которые связываются с Nef. Были выбраны однодоменные внутрителовые sdAb19 и SH3, поскольку они связываются с разными эпитопами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SH3 является не внутриорганом, а доменом тирозинкиназы протеина p59fyn, который физиологически взаимодействует с Nef.
  2. Разработка и тестирование вариантов Nef-чувствительного устройства в соответствии с рациональным обоснованием, описанным в шаге 1.3 (например, Fusion protein 1: membrane tag, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L и GAL4-VP16; Гибридный белок 2: SH3, LD0 и TEVp; Выход: UAS-EYFP; Nef (см. таблицу 3)).
  3. Протестируйте устройства в Т-клетках HEK293FT и Jurkat.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента мы устанавливаем отрицательный контроль, то есть подачу устройства и количественное определение на выходе в отсутствие интересующего белка
    1. Трансфекция HEK293FT: Следуйте процедуре, описанной в шаге 1.5.1, при наличии или отсутствии Nef.
    2. Трансфекция Т-клеток Jurkat: Следуйте процедуре, описанной в шаге 1.5.2, в присутствии или в отсутствие Nef.
    3. Через 48 часов после трансфекции проанализируйте образцы с помощью проточного цитометра, как описано в Протоколе 2.
  4. Инфицирование клеток Jurkat штаммами ВИЧ LAI для выявления ВИЧ.
    1. Подготовьте вирусные акции не менее чем за 48 ч до эксперимента. Используйте вирус, полученный в результате трансфекции клеток HEK-293T с инфекционными молекулярными клонами (программа реагентов NIH AIDS) и коммерческими реагентами в соответствии с инструкцией производителя. Концентрируйте вирус через 40 ч с помощью ультрацентрифугирования в течение 1 ч, 64,074 x g, 4°C на 20% сахарозе, чтобы избежать попадания вирусных белков без частиц. Титр вирусных акций с ВИЧ-1 p24 ИФА.
    2. Инфицировать клетки штаммами ВИЧ-1 500 нг инокулюма p24. Через 40 ч после инфицирования количественно оценить процент инфицированных клеток путем обнаружения вирусного белка p24 с конъюгированным антителом KC57-FITC и проведения анализа проточной цитометрии.
    3. Окрашивайте клетки клоном конъюгированных антител W6/32 AlexaFluor 647 против HLA-A, B, C. Фиксируйте клетки и анализируйте на проточном цитометре. Nef опосредованное понижение модуляции HLA-I в Т-клетках Jurkat в присутствии или отсутствии устройства белкового сенсора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Архитектура для модульного обнаружения внутриклеточных белков
Как показано на рисунке 1, устройство состоит из: 1) внутрикорпусного 1, соединенного с мембранно-привязанным флуоресцентным маркером (mKate) и сайтом расщепления TEVp (TCS), за которым следует активатор транскрипции GAL4VP16 (TF); 2) внутрител 2 слитый с ТЭВ протеазой (ТЭВр), свободный в цитозоле; 3) синтетический промотор, реагирующий на GAL4VP16, управляющий экспрессией репортерного гена. Модульность гаранти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

До недавнего времени опрос клеток на основе внутриклеточной среды проводился с помощью систем, разработанных de novo для конкретных мишеней. Настоящий протокол описывает пример самого современного подхода клеточной инженерии для обнаружения и активации белка в одном устройстве, которое может быть быстро адаптировано к новым желаемым биомаркерам.

Эта новаторская система распознает внутриклеточные белки и обеспечивает определенный выход для обнаружения или нейтр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Итальянским институтом технологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AlexaFluor 647 мышиный клон антител HLA-A, B, C антитела W6/32Biolegend311414антитела
Аннексин VLifeTechnologiesA35122маркер апоптоза
аттрактенQiagen301005реагент для трансфекции
BD Falcon круглодонные трубкиBD Biosciences352053FACS пробирки
DoxycyclineClonetech-Клеточная культура: Препараты
модифицированной среды Dulbecco Eagle Cellgro10-013-CMКлеточная культура: Medium
Evos Cell Imaging SystemLife TechnologyEVOS M5000Imaging systems; Инфекционные молекулярные клоны
FACSDiva8 программное обеспечениеBD Biosciences659523программное обеспечение FACS
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR реакция
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Клеточная культура: Medium
Gateway SystemLifeTechnologies-Плазмидная конструкция Golden
Gate Системасобственногопроизводства Плазмидная конструкция
HEK 293FTInvitrogenR70007Клеточная культура: Система
клонирования инфузииClonetech638920Плазмидная конструкция
Реагент JetPRIME ТрансфекцияPolyplus 114-15Трансфекционный реагент
Jurkat CellsATCCTIB-152Культура клеток: Клетки
L-глутаминSigma-AldrichG7513-100MLКлеточная культура: средний
липофектамин LTX с реагентомPlus Thermo Fisher Scientific15338030реактив для трансфекции
LSR Fortessa проточный цитометр (405, 488 и 561  nm лазеры)BD Biosciences649225Проточный цитометр
MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшет (0.1  mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR реакция
Неоновая трансфекционная системаLife TechnologiesMPK10025Реагент для трансфекции
Заменимые аминокислотыHyCloneSH3023801Клеточная культура: среда
Opti-MEM I с восстановленной сывороткой СредаLife Technologies31985070Трансфекционная среда
Пенициллин/СтрептомицинSigma-AldrichP4458-100MLКлеточная культура: средний
набор для обратной транскрипции QuantiTectQiagen205313Rev набор для транскриптазы
RNeasy Mini KitQiagen74106Набор для экстракции РНК
RPMI-1640ATCCATCC 30­ 2001Клеточная культура: Medium
ShieldClonetech632189Клеточная культура: Препараты
SpheroTech RCP-30-5-A ШарикиSpherotechRCP-30- 5A-2Компенсационная установка
StepOnePlus 7500 Fast machineApplied Biosystems4351106реакцию qPCR
клеток

Ссылки

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Протеаза TEVгенетическая платформасенсорика на основе антителраспознавание пептидовтранскрипционная активацияболезнь Гентингтонавирус гепатита Cдетекция ВИЧ

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.