Методическая статья

Простой литографии-бесплатно одноклеточных микропаттернинга с помощью лазерной-Cut stencils

DOI:

10.3791/60888

⸱

3 апреля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, 3Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 4Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, 5German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол вводит метод микропаттернирования без литографии, который прост и доступен для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт. Этот метод использует индивидуальные лазерно-вырезанные трафареты для микропаттернвальных внеклеточных матричных белков в форме, представляющих интерес для модуляции морфологии клеток. Процедура микропаттернирования продемонстрирована с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы микрошаблонирования широко использовались в клеточной биологии для изучения влияния контроля формы и размера клеток на определение судьбы клеток при разрешении одной клетки. Современные современные методы микропаттернирования одноклеточных элементов включают мягкую литографию и микроконтактную печать, которая является мощной технологией, но требует подготовленных инженерных навыков и определенной поддержки объектов в микрофабрикации. Эти ограничения требуют более доступной техники. Здесь мы описываем простой альтернативный метод, свободный от литографии: шаблон на основе трафаретов на основе одной ячейки. Мы предоставляем пошаговые процедуры, включая конструкцию трафарета, изготовление гидрогеля полиакриламидов, внеся белковое включение на основе трафаретов, а также клеточное покрытие и культуру. Этот простой метод можно использовать для шаблона массива до 2000 ячеек. Мы демонстрируем узор кардиомиоцитов, полученных из одного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с различными формами клеток, от 1:1 квадрата до 7:1 взрослых кардиомиоцитов, как прямоугольник. Этот трафаретный одноклеточный узор без литографии, технически прочный, удобный, недорогой и, самое главное, доступный для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Появление hiPSCs и последующее развитие протоколов для их направленной дифференциации на различные типы клеток позволили изучить развитие и болезни на молекулярном и пациент-специфическом уровне, в частности, с использованием кардиомиоцитов iPSC (iPSC-CMs) для моделирования кардиомиопатий1,2. Однако основным ограничением для изучения развития и физиологии с использованием системы iPSC и других моделей in vitro является отсутствие структурированной микросреды. На месте клетки подвергаются ограничениям внеклеточной матрицы (ECM), а также соседних клеток. Особый биохимический состав и жесткость этих микросред дик....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление отрицательного шаблона полиимидных трафаретов

  1. Создайте шаблон(рисунок 2A) в формате .dxf с помощью программного обеспечения для проектирования с помощью компьютера (например, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
    1. Создайте круг (диаметр ю 22 мм) для разграничения границы трафарета.
    2. Нарисуйте твердую форму или желаемый узор.
    3. Включите хиральную букву (например, R), чтобы отметить переднюю сторону трафаретов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, массив квадратов и прямоугольников генерируется для шаблона iPSC-CMs на одноклеточных и клеточных парах. Файлы проектирования доступны (....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было продемонстрировано изготовление трафаретов, содержащих массив квадратов или прямоугольников(рисунок 4A). Следуя этому протоколу, мы получили узорчатые матричные протеиновые острова(рисунок 4B и рисунок 5A)и клетки(рисунок 4C). Концентрация субоптимального матричного белкового раствора привела к неоптимальному паттерну(рисунок 5В). Очень важно использовать переднюю стор.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод микропаттернирования на основе литографии, который позволяет эффективно узорить клетки адептов. В этом протоколе мы демонстрируем узорство hiPSC-CMs в различных соотношений длины и ширины путем микропаттернинга подвальной мембранной матрицы белковых островов на гидрогелях полиакриламидов с физиологически- или патологически значимыми щипчинтами тканей или кремниевыми эластомерными субстратамами. Этот метод является относительно простым и очень доступным для любых исследователей, в том числе тех, кто име.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана постдокторской стипендией от Стэнфордского научно-исследовательского института здоровья детей (CHRI) и Национального института здравоохранения (1F32HL142205-01) в S.L. NIH Офис Директора Pioneer Award (LM012179-03), Американская ассоциация сердца учрежденных следователя премии (17EIA33410923), Стэнфордский сердечно-сосудистый институт, Хоффманн и Шрёпфер Фонда, и Стэнфордский отдел сердечно-сосудистой медицины, Департамент медицины S.M.W , Награды От Национального института здравоохранения (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) и программа исследований заболеваний, связанных с табаком (TRDRP 27IR-0012) в J.C.W....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Аминоэтилметакрилата гидрохлорид (порошок)Sigma-Aldrich516155
Раствор акриламида 40% (раствор)Sigma-AldrichA-4058-100mL
Настольная УФ-лампа 365 нмUVPUVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex культуральная пластинаFLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Берлингтон, Северная Каролина6-луночная пластина с подложкой из силиконового эластомера
Бис-акриламид раствор 2% (раствор)Sigma-AldrichM1533-25mL
Corning чехол для очков квадратный, No2, Вт × L 22 мм и раз; 22 ммSigmaCLS285522
Irgacure (2-гидрокси-4′-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон) (порошок)Sigma-Aldrich410896
MatrigelCorning356231раствор белка базальной мембраны
Метилсульфоксид, 99,7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS OrganicsAcros Organics326881000
фильтр Millex (13 мм) блок с мембраной DuraporeMilliporeSLGV013SL
50 мл Steriflip (0,22 &; m)Трафареты Fisher ScientificSCGP00525
Potomacиндивидуальный дизайн
Sulfo-SANPAHThermoFisher Scientific22589
TrypLE Select 10xThermoFisher ScientificA1217702 Фермент используется для очистки трафаретов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sulfo SANPAH

Похожие статьи