Этот протокол описывает процесс изготовления липидных сетей нанотрубок с использованием скользящей подвижности кинезина в сочетании с гигантскими одноламеллярными липидными везикулами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сети липидных нанотрубок (LNT) представляют собой модельную систему in vitro для изучения молекулярного транспорта и биофизики липидов с отношением к вездесущим липидным канальцам, обнаруженным в эукариотических клетках. Тем не менее, in vivo LNT являются высоко неравновесными структурами, которые требуют химической энергии и молекулярных двигателей для сборки, обслуживания и реорганизации. Кроме того, состав in vivo LNT является сложным, состоящим из нескольких различных видов липидов. Типичные методы экструзии ЛНТ являются трудоемкими и трудоемкими, и они требуют оптического пинцета, микрошариков и микропипеток для принудительного извлечения нанотрубок из гигантских липидных пузырьков. Здесь представлен протокол для анализа подвижности скольжения (GMA), в котором крупномасштабные сети LNT быстро генерируются из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием подвижности микротрубочек на основе кинезина. Используя этот метод, сети LNT формируются из широкого спектра липидных составов, которые имитируют сложность биологических LNT, что делает их все более полезными для исследований in vitro липидной биофизики и мембранно-ассоциированного транспорта. Кроме того, этот метод способен надежно производить сети LNT за короткое время (<30 мин) с использованием широко используемого лабораторного оборудования. Характеристики сети LNT, такие как длина, ширина и липидное разделение, также настраиваются путем изменения липидного состава ГУВ, используемых для изготовления сетей.
Введение
Изготовление липидных нанотрубочных сетей (ЛНТ) представляет все больший интерес для исследования in vitro неравновесных липидных структур 1,2,3. Клетки используют липидные канальцы для диффузного транспорта белков4 и нуклеиновых кислот5, а также межклеточной связи 6,7. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи особенно интересны, так как эти мембранно-связанные органеллы являются основными местами синтеза липидов и белков, а также транспорта этих интегральных биомо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление стоковых растворов микротрубочек
ВНИМАНИЕ: Защитные очки, перчатки и лабораторное пальто должны всегда носиться на протяжении всего протокола.
- Приготовьте 5x буфер BRB80: добавьте 24,19 г PIPES (пиперазин-N,N'-бис[2-этанесульфоновая кислота]) и 0,38 г EGTA (этиленгликоль-бис[β-аминоэтиловый эфир]-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту) в стеклянную бутылку объемом 1 л. Добавьте 1 мл 1 MMgCl2 и отрегулируйте рН до 6,9 с KOH. Добавьте деионизированную воду, чтобы довести раствор до конечного объема 500 мл.
- Приготовьте 100 мМ запаса раствора ГТФ: взвесьте 52 мг ГТФ и суспендируйте в 1 мл дистиллированно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сети LNT (рисунок 4) были изготовлены с использованием описанного протокола, в котором используется работа, выполняемая кинезин-транспортом микротрубочек для экструзии ЛНТ из ГУВ. Вкратце, ГУВ готовили с использованием регидратации агарозного геля с использованием раствора сахарозы, а микротрубочки полимеризовали в растворе GPEM и стабилизировали в BRB80T. Затем кинезиновые двигатели вводили в проточную ячейку, образуя активный слой двигателей на поверхности покровного листа. Затем вводили м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сети LNT являются полезным инструментом для исследований in vitro свойств мембран и транспорта биомолекул, таких как трансмембранные белки. Кроме того, использование сложных липидных составов для изготовления сетей LNT позволяет проводить более биологически значимые исследования. В других исследованиях по изготовлению использовались либо 1) простые липидные составы и многоламеллярные везикулы, либо 2) более громоздкие методы подвижности для изготовления сетей из ГУВ, состоящих из сложных липидных составов. Метод, описанн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Sandia National Laboratories - это многоцелевая лаборатория, управляемая и управляемая National Technology & Engineering Solutions of Sandia, LLC., дочерней компанией Honeywell International, Inc., для Национального управления по ядерной безопасности Министерства энергетики США по контракту DE-NA-0003525. В данной работе описываются объективные технические результаты и анализ. Любые субъективные взгляды или мнения, которые могут быть выражены в документе, не обязательно отражают взгляды Министерства энергетики США или правительства Соединенных Штатов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Министерством энергетики США, Управлением фундаментальных энергетических наук, Отделом материаловедения и инженерии (BES-MSE). Синтез кинезина и флуоресцентная микроскопия были выполнены в рамках пользовательского проекта (ZIM) в Центре интегрированных нанотехнологий, пользовательском объекте Управления науки, управляемом для Управления науки Министерства энергетики США (DOE).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100x/1.4 Числовая апертура Масляный иммерсионный объектив | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Масляный объектив Infinity Corrected, RMS резьба рабочее расстояние 0,12 мм |
| 3,0 ND фильтр | Olympus | нейтральной плотности фильтр | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-имидоаденозин 5′-трифосфат) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Аденозин 5'-трифосфат динатрия соль гидрат BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 набор фильтров | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | Набор фильтров BrightLine Pinkel, оптимизированный для DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 и другие подобные флуорофоры, подсвечиваемые светодиодными источниками света |
| Казеин | Sigma-Aldrich | 22090 | Гидролизат казеина для микробиологии |
| Каталаза | Sigma-Aldrich | C9322 | Каталаза из печени крупного рогатого скота |
| Хлороформ | Sigma-Aldrich | 288306 | Хлороформ безводный содержит 0,5-1,0% этанола в качестве стабилизатора |
| Холестерин | Avanti | 700000P | холестерин (овечья шерсть, >98%) (порошок) |
| D-глюкоза | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-порошок глюкозы, биореагент, подходит для клеточной культуры, подходит для культуры клеток насекомых, подходит для культуры растительных клеток, ≥ 99,5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (в хлороформе) |
| DOPE-биотин | Avanti | 870282C | 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(биотинил) (натриевая соль) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (порошок) |
| DPPE-биотин | Avanti | 870285P | 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(биотинил) (натриевая соль) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-дитиотреитол раствор 1 М |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, эгтазовая кислота, этилен-бис(оксиэтилененитрило)тетрауксусная кислота, гликолевый эфир диаминтетрауксусная кислота |
| глюкозооксидаза | Sigma-Aldrich | G6125 | Глюкозооксидаза из Aspergillus niger типа II, ≥ 10 000 единиц/г твердого вещества (без добавления кислорода) |
| Глицерин | Fisher | G33 | Глицерин (сертифицированный ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Гуанозин 5′-трифосфат натрия соль гидрат |
| IX-81 Olympus Микроскоп | Olympus | N/A | IX81 Инвертированный микроскоп от Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | калия Гидроксид |
| хлорида магния | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 М раствор хлорида магния |
| Orca Flash 4.0 Цифровая камера | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Цифровая CMOS камера |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Дигексадеканоил-sn-Glycero-3-Фосфоэтаноламин |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Паклитаксел (эквивалент таксола) - для использования только в исследованиях |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-пиперазин дитансульфоновая кислота, Пиперазин-1,4-бис (2-этансульфоновая кислота), Пиперазин-N,N′-бис (2-этансульфоновая кислота) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoil-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Триэтиламмониевая соль |
| Trolox | Сигма-Олдрич | 238813 | (±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота |
| тубулин, биотин | цитоскелет | T333P | Тубулин белок (биотин) свиной мозг |
| тубулин, Hy-Lite 488 | цитоскелет | TL488M | тубулин белок (флуоресцентный HiLyte 488) |
| свиной мозг тубулин, немеченый | цитоскелет | T240 | тубулин белок свиного мозга |
Ссылки
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
