Методическая статья

Поколение олигодендроцитов и олигодендроцитов-кондиционированных средних для совместно-культурных экспериментов

DOI:

10.3791/60912

⸱

9 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом виде мы демонстрируем эффективный метод очистки олигодендроцитов и производства олигодендроцитов, которые могут быть использованы для совместно-культурных экспериментов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В центральной нервной системе олигодендроциты хорошо известны своей ролью в аксонной миелинации, что ускоряет распространение потенциалов действия через солейную проводимость. Кроме того, все большее число сообщений свидетельствуют о том, что олигодендроциты взаимодействуют с нейронами за пределами миелинации, в частности, за счет секреции растворимых факторов. Здесь мы представляем подробный протокол, позволяющий очищать олигодендроглиальные линии клеток от глиальных клеточных культур, также содержащих астроциты и микроглиальные клетки. Метод опирается на ночь встряхивания при 37 градусов по Цельсию, что позволяет селективного отряда надлежащих олигодендроглиальных клеток и микроглиальных клеток, а также ликвидации микроглии дифференциальной сливки. Затем мы описываем культуру олигодендроцитов и производство олигодендроцитов кондиционированной среды (OCM). Мы также предоставляем кинетику лечения OCM или олигодендроцитов дополнение к очищенным гиппокампа нейронов в совместной культуры экспериментов, изучение олигодендроцитов нейронов взаимодействий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Олигодендроциты (Ол) являются глиальными клетками центральной нервной системы (ЦНС), которые генерируют миелин, обертывающий вокруг аксонов. Ол сходят на из олигодендроцитов клеток-предшественников (ОПК), которые размножаются в желудочковых зонах эмбриональной ЦНС, а затем мигрируют и дифференцируются в полностью зрелые Ол (т.е. миелин-образующие клетки)1. OPCs в изобилии во время раннего развития, но и сохраняются во взрослом мозге, где они представляют собой основные пролиферативной популяции клеток2. Один OL ensheathes несколько аксонов в невозбудимых разделов (т.е. межузлов), и край каждого цикла миелина прикрепляетс....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Уход и использование крыс в этом эксперименте соответствует институциональной политике и руководящим принципам (UPMC, INSERM и Директива Совета Европейского сообщества 86/609/EEC). Для стандартного помета из 12 щенков установлен следующий протокол.

1. Подготовка колб (5 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги за день до вскрытия в ламинарном капоте потока в стерильных условиях.

  1. Пальто 150 см2 колбы (T150) с крышкой фильтра (1 колба для 2 щенков) с использованием 5 мл полиэтиленина (PEI, 100 мг/ л, см. протокол в дополнительном файле 1).
  2. Храните фляги при 4 градуса....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе, OL линии клеток очищаются от глиальных культур, стряхивая астроцитов и микроглии. Чистоту и фенотипическое исследование OL-культур можно оценить с помощью иммунодефицита с глиальными маркерами15. Анализ экспрессии различных маркеров показал, что OL-культуры были в основном предварительно OLs с 90% и 4% от O4- клетки, 85% и 7%NG2 - клетки, и 4,7% - 2,1% от PLP- клетки, в то время как 7,2% - 2,5% клеток были Астроцит.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предоставляем подробный протокол для получения высокообогащенных олигодендроглиальных клеточных культур из смешанных глиальных культур, адаптированных из ранее опубликованного метода16, и последующего производства OL-кондиционированной среды. Этот метод встряхивания не является дорогостоящим, может быть повторен три раза и является оптимальным для получения большого количества очищенных Ол, как клетки культивируются в Боттенштейн-Сато (BS) среда, содержащая PDGF' размножаться. Глиальные к.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни один из авторов не имеет конкурирующих интересов или противоречащих друг другу интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Реми Ронзано за мудрый совет по редактированию рукописей. Эта работа финансировалась ICM, INSERM, грантом фонда ARSEP NSF и ценой Буве-Лабруйер.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-фтордезоксиуридинSigmaF0503
B27 добавкаThermoFisher17504044
D-(+)-раствор глюкозыSigmaG8769
DNаза (дезоксирибонуклеаза I)WorthingtonLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
этанол 100% Sigma32221-M Этанол
70%VWR Chemicals83801.360
Сыворотка плода теленкаThermoFisher10082147
L-цистеинSigmaC7352
НейробазалThermoFisher21103049
папаинWorthingtonLS003126
пенициллин-стрептомицин пенициллин-стрептомицинThermoFisher15140122
Фосфатный буферный физиологический раствор без кальция и магнияThermoFisherA1285601
Полиэтиленимин(PEI)SigmaP3143
Тетраборат декагидратSigmaB9876
ТрипсинSigmaSigma
UridineSigmaU3750
<стронг>Боттенштейн-Сато (BS) медиа
апо-трансферрин человеческийSigmaT1147
BSA (бычья сыворотка альбумин)SigmaA4161
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
инсулинSigmai5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Пенициллин-стрептомицинThermoFisher15140122
прогестеронаSigmaP8783
Путресцина дигидрохлоридSigmaP5780
Селенит натрияSigmaS5261
T3 (3,3',5-Трийодо-L-тиронин натриевая соль)SigmaT6397
T4 ( L-тироксин)SigmaT1775
Co-culture media
apo-Transferrin humanSigmaT1147
B27 добавкаThermoFisher17504044
биотинSigmaB4639
BSA (бычья сыворотка альбумин)SigmaA4161
ЦерулоплазминSigma239799
модифицированный Dulbecco's Eagle MediumThermoFisher31966021
гидрокортизонSigmaH4001
ИнсулинSigmaI5500
N-ацетил-L-цистеинSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Пенициллин-стрептомицинThermoFisher15140122
прогестеронSigmaP8783
ПутрескинSigmaP5780
Рекомбинантный человеческий CNTFSigma450-13
Селенит натрияSigmaS5261
T3 (3,3',5-трийодо-L-тиронин натриевая соль)SigmaT6397
Витамин B12SigmaV6629
Tools
0.22 µ m фильтрSartorius514-7010
мл шприцTerumo1611127
100 мм чашка ПетриDutscher193100
15 мл тубаCorning Life Science734-1867
50 мл тубаCorning Life Science734-1869
60 мм чашка ПетриDutscher067003
70 & микро; m фильтрMiltenyi Biotec130-095-823
Бинокулярный микроскопOlympusSZX7
Изогнутые щипцыFine Science Tools11152-10
Тонкие щипцыFine Science Tools91150-20
Большие хирургические ножницыFine Science Tools14008-14
СкальпельSwann-morton233-5528
ШейкерInfors HT
Малые хирургические ножницыFine Science Tools91460-11
Маленькая хирургическая ложкаBar Naor LtdBN2706
T150 см<суп>2 колба с фильтрующим колпачкомDutscher190151
Animal
P2 Wistar крысаЖанвьеRjHAn:WI
1

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
  2. Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
  3. Sherman, D. L., Broph....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bottenstein SatoO4NG2

Похожие статьи