Методическая статья

Метод скрининга для выявления гетерохроматина-пропагандирующих наркотиков с использованием дрозофилы

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60917

⸱

12 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of California San Diego

В этой статье

Краткое содержание

Дрозофила является широко используемой экспериментальной моделью, подходящей для скрининга препаратов с потенциальными приложениями для терапии рака. Здесь мы описываем использование drosophila пестрые фенотипы цвета глаз в качестве метода для скрининга малых молекул соединений, которые способствуют образованию гетерохроматина.

Аннотация

Дрозофила является отличной моделью организма, которые могут быть использованы для проверки соединений, которые могут быть полезны для терапии рака. Описанный здесь метод является экономически эффективным методом in vivo для выявления гетерохроматина, продвигающих соединения с помощью дрозофилы. DX1 штаммА Drosophila, имея пестрый фенотип цвета глаз, который отражает масштабы образования гетерохроматина, тем самым обеспечивая инструмент для гетерохроматина содействия наркотиков экрана. В этом методе скрининга, разновидность глаз количественно на основе поверхности красной пигментации, занимающей части глаза и забил по шкале от 1 до 5. Метод скрининга прост и чувствителен и позволяет тестировать соединения in vivo. Скрининг на наркотики с помощью этого метода обеспечивает быстрый и недорогой способ выявления гетерохроматина содействия препараты, которые могут иметь благотворное влияние в терапии рака. Выявление соединений, способствующих образованию гетерохроматина, также может привести к открытию эпигенетических механизмов развития рака.

Введение

Гетерохроматин является конденсированной формой ДНК, которая играет центральную роль в экспрессии генов, в регуляции хромосомой сегрегации во время деления клеток, а также в защите от нестабильности генома1. Гетерохроматин считается регулятором генных репрессий и защищает целостность хромосомы при клеточном митозах2,,3. Это связано с ди- и три-метилирования гистон H3 лизин 9 (H3K9me) во время линии обязательств4,5. Кроме того, набор хетерохроматин Белок 1 (HP1) хромодоменов белков также считается связанным с гетерохроматин и эпигенетическое подавление экспрессии генов6. Эти белки являются важными компонентами и маркерами гетерохроматина формирования.

Поскольку геномная нестабильность позволяет клеткам приобретать генетические изменения, которые способствуют канцерогенезу, гетерохроматин становится все более признанным в развитии рака и может быть направлена на лечение рака7,8. В настоящее время нет препаратов, которые хорошо зарекомендовали себя в оказании помощи гетерохроматин формирования. Здесь мы представляем простой и быстрый, но эффективный метод скрининга маломолекулярных соединений, способствующих образованию гетерохроматина. Скрининг проводится путем лечения дрозофилы с библиотекой маломолекулярных препаратов. Этот метод использует пестрый фенотип цвета глаз в штамме DX1Drosophila, который находится под влиянием уровня гетерохроматина. Мухи DX1 содержат тандемный массив из семи трансгенов P'lac-w, которые имеют пестрое выражение/депрессию в зависимости от гетерохроматинизации, поэтому степень разнозения цвета глаз отражает уровень гетерохроматина. В частности, увеличение гетерохроматина может быть обнаружено ростом доли пестрый цвет глаз (белый глаз). Напротив, снижение гетерохроматина будет обнаружено ростом доли трансгенного выражения P'lac-w (красный глаз)9,10,11,12.

Таким образом, мы пользуемся этой системой Transgene Drosophila, которая производит пестрый фенотип цвета глаз, так как его выражение напрямую коррелирует с количеством гетерохроматина настоящее время. При обнаружении соединений, которые, как предполагается, способствуют образованию гетерохроматина, мы можем подтвердить это подозрение, используя другие методы, такие как западная подачка. Эти гетерохроматин-продвигающие вещества могут быть дополнительно разработаны для клинических испытаний у пациентов в будущем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка библиотеки наркотиков

  1. Определить и подготовить библиотеку лекарственных средств для проверки с использованием соответствующего растворителя в нужной концентрации (например, 10 мМ в ДМСО).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретный пример для библиотеки наркотиков является онкология Набор III из Национального института рака (NCI) Программы развития терапии (DTP). Соединения в этом наборе предоставляются в виде 20 мл при 10 мМ в 100% DMSO в двух 96-хорошая PP U-нижних пластин и хранятся при -20 градусов по Цельсию. Карты NCI Plate и основные химические данные каждого препарата можно найти на следующих веб-сайтах:
    Номер NCI 4740
    Номер NCI 4741

2. Экран для гетерохроматина содействия наркотиков с использованием Drosophila

  1. Дрозофила Стратегия разведения(рисунок 1А)
    1. День 1: Крест три ж1118/Y; DX1/CyO самцы мух и три или более девственных w1118 самок летают в пищевом флаконе 25 мм x 95 мм с 9 мл стандартных продуктов питания Drosophila (рецепт Блумингтона). Навяжите три флакона для каждого препарата и один контроль для экрана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DX1 мухи были любезно предоставлены Джеймс Birchler (Университет Миссури)9,13.
    2. День 2 и 3 день: Разрешить мухам откладывать яйца в течение 2 дней при комнатной температуре (22 градусов по Цельсию).
    3. День 4: Используйте короткий всплеск CO2 газа для анестезии родителей мух и распоряжаться родителей мух в "летать морг" (бутылка, содержащая 70% алкоголя).
  2. Кормите препараты Дрозофиле для скрининга.
    1. Разбавить каждое соединение препарата от исходного запаса (20 мЛ при 10 мМ в 100% DMSO в 96-пузыльных PP U-нижних пластинах) до конечной концентрации 10 км с 33% ДМСО в воде. Используйте 33% DMSO в воде без каких-либо наркотиков в качестве контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые препараты плохо растворяются в воде и растворяются в ДМСО. 100% DMSO является токсичным для мух. 33% является терпимым.
    2. День 4: Пипетка 60 л раствора препарата 10 км или контроля на вершине мухи пищи. На данный момент, убедитесь, что родительские мухи были удалены и Есть летать яйца и ползать первого звезды личинок на продукты питания.
    3. День 6: Повторите пайпеттинг 60 зл и того же 10 мкм лекарственного раствора в пищевой флакон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Так как наркотики были добавлены на мухи пищи, верхняя поверхность пищи содержит около 10 мкм концентрации и нижней пищи не может быть полностью проникли. Все мухи откладывают яйца на верхнюю часть пищи и едят верхнюю поверхностную пищу.
  3. Наблюдайте и оценка изменения цвета глаз.
    1. Через два дня после появления мух F1 (примерно на 14-й день) исследуют мух. Используйте короткий всплеск CO2 для обезопачивания f1 мух и удалить мух из их флакона на пористой рассекая площадку с CO2 потягивая через из-под фильтровальной бумаги.
    2. Осмотрите мух на этой площадке под микроскопом вскрытия. Изучите всю муху и определите всех ж1118/Y; DX1 / е гетерозиготных мужчин по их отсутствие CyO доминирующей вьющиеся фенотип крыла.
    3. Оценка цвет глаз каждого из ж1118/Y; Гетерозиготный самец dX1/' летает по шкале от 1 до 5(рисунок 1B). Процент белого цвета глаз был оценен следующим образом:
      1. Злт;5% красный рассеянный глаз общей площади поверхности
      2. 6% - 25% красные пятна глаз общей площади поверхности
      3. 26% - 50% красных пятен глаз общей площади поверхности
      4. 51% - 75% красных пятен глаз общей площади поверхности
      5. 75% красных пятен общей площади поверхности глаз
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, гомогенизировать мухи головы в 100% метанола и использовать спектрометр для измерения пигментации глаз на OD 450 нм. Выберите только мужчин, потому что PEV более pronouced в DX1 мужчин. Оценка более 10 мужчин в каждом флаконе.
    4. Рассчитайте средний цветовой индекс всех самцов с каждого забитого флакона. Выполните триплекаты для каждого соединения(Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку цвет глаз меняется с возрастом, это чувствительный к времени шаг. Цвет глаз должен быть рассчитан в том же возрасте - 2 дней. Обычно в каждом флаконе должны быть забиты 10 мух.
    5. Чтобы подтвердить, что соединения действительно способствуют образованию гетерохроматина, используйте различные методы, такие как западные blotting для проверки (Рисунок 1G).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол был успешно использован для проверки соединений, которые способствуют образованию гетерохроматина в Drosophila, который является эффективным и недорогим in vivo системы для разработки лекарственных средств(рисунок 1). Мы проверили маломолекулярной библиотеки наркотиков, Онкология Set III, которая состоит из 97 FDA авторизованных онкологических препаратов, используя штамм DX1 Drosophila меланогастер (Рисунок 1B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Гетерохроматин является конденсированной формой ДНК, которая играет центральную роль в регулировании экспрессии генов. Он становится все более узнаваемым при раке и может служить потенциальной мишенью для терапии рака15,16,17,18. Малые молекулярные соединения обычно используются в разработке лекарств из-за преимуществ в производстве, сохранении и метаболизме в организме человека. Для выявления ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим Д. Бирчлера, Э. Баха и Блумингтон дрозофила фондовый центр для различных штаммов drosophila; Национальный институт рака (NCI) Программа развития терапии для онкологии Установить маломолекулярной библиотеки наркотиков; СТУДЕНТы UCSD, включая Эми Чанг, Taesik You, Джессика Сингх-Банга, Рейчел Меза, и Алекс Чавес. Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны исследовательским грантом Американского торакального общества J.L. и финансированием от NIH: R01GM131044 до W.X.L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DrosophilaDX1 штаммDX1 мухи были любезно предоставлены Джеймсом Бирчлером (Университет Миссури
)Drosophila пищевыми средамиUCSD fly kitchen
NCI библиотека
Диметилсульфоксид (DMSO)SigmaD2650
Этил спиртSigmaE7023-500ML
Methotrexate лекарств

Ссылки

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaDX1in vivo

Похожие статьи