Ковалентное присоединение одиночных молекул для спектроскопии силы на основе AFM

С момента своего изобретения в 1980-х^{годах 1}, атомной силы микроскопа (AFM) стал одним из наиболее важных методов визуализации в естественных науках с участием суб-нанометров пространственного разрешения, под-piconewton силовое разрешение и возможность измерения в различных условиях растворителя и температуры^2,3,4,5,6,7.

Помимо изображения^8,,9, AFM используется для выполнения одной^{молекулярной}силовой спектроскопии (SMFS), дающей представление о клеевом взаимодействии между одним полимером и поверхностями, физических свойствах одного полимера и разворачивающихся механизмов белков^{7,,10,,11,12,13,,14,,15,16}. В регулярном эксперименте SMFS, функционализированный кончик кантилевера вводятся в контакт с поверхностью так, что полимер на AFM cantilever наконечник физиорбирует на этой поверхности. Путем втягивать кончик cantilever AFM от поверхности, изменение в отклонении cantilever AFM преобразовано в усилие водя к кривой усилия-расширения^4. Физические параметры, такие как растяжения силы, силы desorption и длина desorption может быть определена как зависит от различных параметров, таких как скорость вытягивания, время пребывания на поверхности, глубина отступа в поверхность, температура, растворитель^17,18 и различные поверхности, как твердые субстраты, полимерные пленки или поддерживается липидных двухслойных^19,20,21,22. Кроме того, полимер может быть исследован в различных пространственных направлениях, таким образом, исследуя фрикционные свойства полимера^{23,,24,,25,26}.

Ковалентное крепление исследуемого полимера к наконечнику кантилевера AFM имеет важное значение для таких исследований. Таким образом, высокая доходность событий одной молекулы с одним и тем же полимером, привязанным к наконечнику AFM cantilever, предотвращает любые предубеждения результатов из-за калибровки весенней константы AFM cantilever^27,28, различных точек крепления²⁹ или различных полимеров (с различной длиной контура), таких как в случае экспериментов по наноловищему^30,31,32. Кроме того, взаимодействие с другими полимерами, а также усреднения эффекты могут быть широко предотвращены^18,28. Для ковалентного крепления полимера к наконечнику aFM cantilever могут быть применены различные типы химических модификаций, многие из которых обобщены в книге Хермансона³³. Амин и тиол основе ссылок реакций, а также нажмите химии представляют собой наиболее часто используемые методы в AFM cantilever отзыв функционализации^{34,35,36,37,38,39,40,41,42}. Becke et al.⁴⁰ показывают, как использовать 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)/NHS химии прикрепить белок к aFM кантилевер наконечник. Тем не менее, указанные функциональные группы, как правило, перекрестные ссылки, что приводит к потере функциональности^43,44. Также карбодиимиды демонстрируют склонность к быстрому гидролизу в растворе^43. Группы малимид и тиол, как правило, более стабильны и не проявляют перекрестных реакций. Представленный протокол представляет собой оптимизацию ранее опубликованных протоколов, приведенных в ссылках^35,,39.

Здесь представлен надежный протокол функционализации, который может быть легко приспособлен к большому количеству различных полимеров, независимо от таких свойств, как длина контура или гидрофобность. На примере были выбраны три различных полимера: гидрофильный полиэтиленгликоль (PEG) и поли(N-изопропилакриламид) (PNiPAM), а также высокой молярной массы гидрофобного полистирола (ПС). Для того, чтобы обеспечить ковалентную связывающую способность с соответствующей молекулой связующего, три полимера были выбраны для показа телехелика тиол муати в качестве функциональной конечной группы. Сама молекула связующим звеном, как правило, является коротким полимером ПЭГ с двумя активными участками, группой силана на одном конце и группой маеймида на другом конце. Первый позволяет ковалентное вложение к наконечнику кантилевера AFM, а второе является связывающей реакцией с группой тиола функционализированного полимера высокой молярной массы. Кроме того, неактивные молекулы связующих PEG служат в качестве пассивации слоя для предотвращения нежелательных взаимодействий между зондом полимера и AFM кантилевер отзыв, а также между AFM кантилевер отзыв и основной поверхности.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для схематического обзора.

1. Установка реагента

ПРИМЕЧАНИЕ: Полимеры, используемые для этого протокола являются: маеймид-полиэтилен гликоль-триэтоксизилан (силан-PEG-mal, 5 кДа), тиол-полиэтилен гликол-тиол (HS-PEG-SH, 35 kDa), тиол прекращается поли(N-изопропилакриламид) (PNiPAM-SH, 637 kDa) и тиол прекращается полистирол (PS-SH, 1,3 мДа).

1. Подготовка четко определенных и высокой молярной массы PNiPAM-SH через атом передачи радикальной полимеризации, а затем преобразование и сокращение функциональной конечной группы для введения тиол moiety, как описано в литературе¹⁸. Пожалуйста, смотрите рисунок 1 для подробных структур.
2. Для хранения химических веществ, подготовить меньшие aliquots в сухой системе перчаточные ящики с азотной атмосферой, чтобы избежать воздействия атмосферного кислорода и влаги. PEG и PNiPAM являются гигроскопические^45,46 и функциональных конечных групп PEG, PNiPAM и PS, как известно, легко окисляется при хранении в условиях окружающей среды^33,47,48. Все химические вещества должны храниться при -20 градусах Цельсия.
3. Используйте аналитические растворители класса или выше. Кроме того, используйте ультрачистую воду для промывки AFM cantilevers чипов и стеклянной посуды, потому что эксперименты одной молекулы очень чувствительны ко всему загрязнению.

2. Установка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пинцет и стаканы из нержавеющей стали или стекла. Используйте перевернутый пинцет для безопасного сцепления (например, модель R3 SA, имеющая низкую весеннюю константу).

1. Приготовьте раствор RCA (ультрачистая вода, перекись водорода и аммиак (5:1:1)) для очистки стеклянной посуды и пинцета.
2. Положите сосуды в стакан и заполните его RCA до тех пор, пока стеклянная посуда или пинцет полностью покрыты.
3. Нагрейте стакан со ступени 2.2 на 1 ч при температуре 80 градусов по Цельсию.
4. Промыть сосуды впоследствии с ультрачистой водой, пока не едкий запах не становится выяснен больше (по крайней мере в три раза).
5. Сухая стеклянная посуда и пинцет в духовке (120 градусов по Цельсию).

3. Функционализация наконечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены в дымовой капот, чтобы избежать вдыхания органических паров. Кроме того, перчатки, лабораторное пальто и защита глаз не требуется. Используйте нитрила или латексные перчатки для каждого шага, чтобы избежать загрязнения. Носите растворитель устойчивых перчаток при использовании толуол. Все шаги, если не указано иное, выполняются на RT. Используйте свежее оборудование и перчатки для каждого шага, чтобы избежать возможного перекрестного загрязнения.

1. Выполните активацию поверхности, применяя кислородную плазму к чипу AFM cantilever MLCT-Bio-DC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность плазменной обработки для дальнейшей функционализации шаги масштабируется с содержанием кислорода в плазменной камере.
   1. Используйте свежеочищенные пинцеты для размещения чипов aFM cantilever в плазменной камере (40 кГц, 600 Вт).
   2. Используйте пользовательскую программу активации: эвакуация (0,1 мбар) - затопление кислородом до давления: 0,2 мбар (4 мин) - плазменный процесс (мощность: 40%, продолжительность: 2 мин, давление процесса: 0,2 мбар).
   3. Вентилировать камеру и вести с шагом 3.2.2 немедленно для того, чтобы предотвратить любые адсорбции загрязняющих веществ для AFM кантилевер чипы из воздуха.
2. Силанизация и PEGylation
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки является критическим параметром между шагами. Подготовьте решения как можно более свежие во время ожидания. Группы малимид ы могут подвергаться гидролизу в ваквистых носителях, а тиоллегко окисляются до дисульфидов в растворе^33,47 препятствующих реакции функционализации наконечника AFM.
   1. Приготовьте силан-ПЕГ-маль-раствор в толуол (1,25 мг/мл) в растворителе устойчивых пластиковых или стеклянных трубках и залейте 6 мл раствора в плоские блюда Петри, по 3 мл каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте SMFS наблюдается связывание нескольких зондных полимеров, смешивание силана-ПЕГ-мала с нефункциональным силан-ПЕГ может уменьшить количество точек крепления. Для регулировки пассивного слоя ПЭГ с различными массами (т.е. длины контура) можно использовать^27.
   2. Инкубировать чипы AFM cantilever сразу после шага 3.1.3 в силане-PEG-mal растворе (до 10 фишек за чашку Петри) по 3 ч при 60 C³⁵.
   3. Возьмите блюда Петри из духовки и дайте раствору остыть в течение по крайней мере 10 мин.
   4. Тщательно промыть каждый чип AFM cantilever. Уменьшите влияние капиллярных сил на aFM cantilever при прохождении интерфейса с растворителем воздуха, например, наклоняя эти фишки немного при погружении в решение.
      1. Для PEG и PS полимеров, промыть три раза с толуолом.
      2. Для полимера PNiPAM, промыть один раз с толуолом и дважды с этанолом.
   5. Выберите по крайней мере две фишки AFM cantilever в качестве управления чипами AFM cantilever, пропустив шаг 3.3 и промойте их следующим образом, чтобы увеличить полярность растворителя:
      1. Для ПЕГ и PS полимеров, промыть дважды с этанолом и один раз с ультрачистой водой.
      2. Для полимера PNiPAM промыть дважды ультрачистой водой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль AFM кантилевер чипы прошли через все этапы функционализации, кроме полимерного вложения (шаг 3.3). Они служат для доказательства чистоты процесса функционализации, системы держателя чипов AFM, поверхностей и растворителей, используемых для эксперимента SMFS.
3. Ковалентное полимерное крепление
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что aFM кантилевер отзыв, как ожидается, будет полностью покрыта группами малимид, Есть только несколько связывающих сайтов для одного полимера зонда, потому что maleimide проходит гидролиз в воде, что приводит к неактивным PEGs⁴⁷. Эти неактивные ПЭГ действуют как пассивный слой, как описано выше.
   1. Инкубировать aFM кантилевер ные фишки сразу после шага 3.2.5 в одном из следующих полимерных растворов в 3 мл блюд Петри. Если соответствующий полимер не растворяется должным образом, используйте водяную ванну 40 градусов и хорошо перемешайте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как использование тиол прекращено полимеров может привести к образованию дисульфидных связей препятствует реакции с группами maleimide силан-PEG-mal, сокращение агента рекомендуется, в частности, если шаг 3.3 применяется в вакученных буферов для водорастворимых полимеров³³.
      1. Для ПЕГ и PS полимеров, используйте концентрацию 1,25 мг/мл в толуол для 1 ч при 60 градусах Цельсия.
      2. Для полимеров PNiPAM используйте концентрацию 1,25 мг/мл в этаноле в течение 3 ч на RT.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте SMFS наблюдается связывание нескольких зондных полимеров, концентрация полимера должна быть снижена.
   2. Тщательно промыть каждый чип AFM cantilever.
      1. Для PEG и PS полимеров, промыть дважды с толуол, дважды с этанолом и один раз с ультрачистой водой после 10 минут остыть.
      2. Для полимеров PNiPAM промыть дважды этанолом и дважды ультрачистой водой.
   3. Храните каждый чип AFM cantilever отдельно в небольшой (1 мл) Петри блюдо заполнено ультрачистой водой при 4 градусах Цельсия до использования в эксперименте.

4. Подготовка поверхности

1. Силиконовая оксидовая
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поверхность была использована для SMFS с PEG и PNiPAM.
   1. Разрежьте оксида кремния на мелкие кусочки с помощью алмазного ножа.
   2. Положите кусочки оксида кремния отдельно в микроцентрифуговых трубках и заполните эти трубки этанолом.
   3. Снотировать кусочки оксида кремния в течение 10 мин.
   4. Промыть кусочки оксида кремния этанолом дважды и тщательно высушить их под потоком азота. Используйте кусочки оксида кремния немедленно.
2. Самосборный монослой гидрофобного алкана тиола на золоте (SAM)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поверхность была использована для SMFS с PS. Подробнее о SAM читайте в^{материале 39,49.}
   1. Для выполнения шагов 4.1.1 - 4.1.4) используйте кремниевую пластину с золотым покрытием (A 100, 5 нм титана, 100 нм золота).
   2. Инкубировать поверхностные части в растворе 1-додеканттиола (2 мМ) на 18 ч.
   3. Промыть свежеприготовленные SAMs в этанол дважды.
   4. Сухие ЗАД с потоком азота для прямого использования или хранить их в этаноле до 4 дней для последующего использования.

5. Приобретение данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Все измерения, показанные здесь, были выполнены в ультрачистой воде с помощью Cypher ES AFM с использованием стадии нагрева и охлаждения образца для изменения температуры. Как правило, все AFMs, обеспечивающие возможность измерения в жидкостях, могут быть использованы.

1. Вставьте функционалированный чип AFM cantilever в AFM.
2. Клей подготовленную поверхность в держатель образца, который подходит для измерения в жидкостях (например, репликационное соединение высокого разрешения 101RF или УФ-излечимый клей).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти связующие агенты очень инертны и устойчивы к большому количеству полярных растворителей. Устойчивость клея к неполярным растворителям (например, толуену или гексану) или высокие температуры должны быть проверены перед использованием.
3. Погрузите чип AFM cantilever и образец зонда в жидкость, здесь: ультрачистая вода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Падение растворителя (около 100 л) может быть отложено на держатель чипа AFM cantilever. Покрытие чипа AFM cantilever с растворителем уменьшает капиллярные силы, которые в противном случае действуют на aFM cantilever при приближении к поверхности образца, проходящей через воздухорастворительинтерфейс.
4. При необходимости отрегулируйте температуру и дайте системе уравновеситься.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения температуры могут привести к отклонению aFM кантилевер из-за биметаллического эффекта для AFM кантилеверов со светоотражающим покрытием, как алюминий или золото. Равновесие должно выполняться вдали от поверхности (несколько мкм) до тех пор, пока не будет наблюдаться дальнейшее изменение сигнала отклонения (до 15 мин для MLCT-Bio-DC).
5. Изменяйте температуру случайным образом, чтобы исключить любые последствия старения функционализации. Убедитесь, что применяемые температуры не приводят к необратимому изгибу кантилевера AFM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любое влияние температуры на свойства растворителя (например, испарение или изменение вязкости) может помешать вашим экспериментам. В представленных примерах температура варьировалась в диапазоне до 40 К в шагах от 10 K с водой в качестве растворителя (например, от 278 K до 318 K).
6. Подойдите к поверхности, чтобы определить InvOLS (обратная оптическая чувствительность рычага), взяв кривые силового расширения на твердую поверхность (например, оксид кремния). Для этого возьмите сигнал отклонения фотодетектора (в V) против пьезо расстояния и определить наклон части, представляющей отступ наконечника aFM кантилевер в основной поверхности (отталкивающий режим) с помощью линейной функции. Чтобы уменьшить количество ошибок, возьмите среднее значение не менее пяти значений, чтобы получить окончательное значение InvOLS. Для получения более подробной информации,^,39см.⁴
   ПРИМЕЧАНИЕ: InvOLS может быть надежно определен только на твердых поверхностях. В случае экспериментов на мягких поверхностях или интерфейсах убедитесь, что вы поместите твердую поверхность близко к мягким поверхностям. Затем калибровка InvOLS может быть проведена до или после экспериментов на мягкой поверхности без необходимости разборки установки AFM.
7. Для весны постоянн определение, переместить AFM кантилевер на высоту ни с привлекательными, ни отталкивающим взаимодействия между AFM cantilever кончик и поверхность (несколько мкм). Затем запишите тепловой шумовой спектр, где проецируется спектральная плотность мощности (PSD) против частоты. Следующие шаги обычно выполняются автоматизированными встроенными функциями в коммерческом программном обеспечении AFM: во-первых, приобретенный тепловой шумовой спектр анализируется путем установки функции на PSD, например, простой гармонический осциллятор (SHO). Пригонка делается до минимума между первым и вторым резонансом. Во-вторых, определяется область под установленной частью участка PSD против частоты, представляющая среднее квадратное смещение кантилевера AFM в вертикальном направлении. Наконец, теорема экипировки используется для получения силы AFM cantilever^{постоянной 28,50}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий диапазон частот должен быть использован, включающий первый резонансный пик кантилевера AFM. Чтобы получить удовлетворительное соотношение сигнала к шуму, необходимо накопить не менее 10 PSD с максимально возможным разрешением частоты.
8. Начните эксперимент. Записывающие карты силы, принимая кривые силового расширения в сетке, как мода (например, 10 х 10 точек на площадь 20 х 20 мкм^2),чтобы избежать каких-либо локальных поверхностных эффектов (например, примесей, вывихов) и в среднем различных областях поверхности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичными параметрами являются скорость вытягивания 1 мкм/с и скорость отбора проб 5 кГц для обеспечения достаточного разрешения. Коэффициент отбора проб должен быть адаптирован, когда скорость вытягивания различна. Расстояние убирания должно быть адаптировано к контуру или длине обезвоживания измеренного полимера (приблизительно в два раза больше ожидаемой длины).
9. Используйте и изменяем время пребывания к поверхности, чтобы один полимер прилипнуть к поверхности (обычно 0 - 5 с).
10. Повторите определение InvOLS и весенней константы в конце эксперимента, чтобы проверить последовательность и стабильность системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сильной слипания между полимером и поверхностью, калибровка может быть сделана после фактического эксперимента, чтобы сохранить функционализацию.

6. Оценка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки данных для выполнения следующих шагов использовалось специально написанное программное обеспечение на основе Igor Pro.

1. Преобразуйте необработанный сигнал отклонения (в Вольтах) в значения силы (в Ньютонах) путем умножения с записанными InvOLS и определенной константой пружины.
2. Вычтите отклонение кантилевера AFM (после умножения необработанного сигнала отклонения с InvOLS) с расстояния, управляемого элементами пьезо в вертикальном направлении, чтобы получить истинное расширение (расстояние наклона поверхности)⁴.
3. Исправьте кривые форс-расширения, полученные для дрейфа, подойдя линейную функцию к исходной линии после последнего события и вычитая то же самое из кривой форс-расширения. Приспособленная часть должна представлять собой достаточное расширение от поверхности, где ни привлекательные, ни отталкивающим взаимодействия не наблюдаются между наконечником AFM cantilever и основной поверхностью. Затем базовая линия устанавливается на нулевую ось.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае измерений на высоко отражающих поверхностях, таких как золото, могут появиться помехи. Они являются результатом частичного отражения лазерного луча с поверхности и с обратной стороны кантилевера AFM. Таким образом, полученные кривые силового расширения могут показать синусоидальный артефакт сигнала силы вдоль вертикального расширения. Это артефакт, который препятствует значениям конечной силы. Для того, чтобы все еще принимать эти кривые силы расширения во внимание, возможна коррекция(рисунок 2).
4. Если помехи появляются в кривых форс-расширения, выберите репрезентативную кривую force-extension (кривая опрокидывания), не показывающую никаких других событий, кроме возможно пика неспецифической слипки и того же синусоидального артефакта (т.е. амплитуды и фазы) (Рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гладкая репрезентативной кривой форс-расширения для получения низкочастотной модели помех.
5. Выберите кривую силового расширения, которая должна быть исправлена(рисунок 2B).
6. Накладывай обе кривые силового расширения со ступеней 6.4. и 6,5. чтобы убедиться, что оба показывают тот же синусоидальный артефакт (т.е. амплитуда ифазы) (рисунок 2C).
7. Вычесть (сглаженную) репрезентативную кривую силы-расширения из кривой форс-расширения, которая будет исправлена, что приведет к прямой, а не синусоидальной базовой линии (рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы пик неспецифической адгезии репрезентативной кривой отличался от любых событий одной молекулы, появляющихся в кривых для коррекции. На самом деле, выбор репрезентативной кривой имеет решающее значение для надлежащей коррекции.

Следующие примеры показывают результаты растяжения и растяжения одной молекулы полимеров PEG, PNiPAM и PS. Все советы AFM cantilever были функционализированы с протоколом, приведенным выше. PEG и PNiPAM были измерены на SiOx с изменением температуры. Для детального обсуждения в результате температуры зависимых вытяжек кривых для PEG и PNiPAM, см Kolberg et al.18 Другой мотив силового расширения плато плато постоянной силы (например, при desorbing PS от самособранных монослойных метиловых тиол на золоте (SAM) в воде4,27,39,51).

Пример 1: Растяжка ПЭГ и ПНИПАМ в воде
Температурно-зависимое поведение растяжения в воде было измерено с помощью одного PNiPAM и PEG полимеров ковалентно связаны с AFM кантилевер наконечник на одном конце и physisorbed на поверхности SiOх на другом конце. После калибровки и экспериментов по очистке контроля (менее 2% кривых силового расширения показывают события одной молекулы), по крайней мере две силовые карты были записаны для каждого кантилевера AFM. Эксперимент, зависящий от температуры, был проведен путем записи по крайней мере одной силовой карты при каждой температуре. Когда появилось всего несколько событий растяжения, соответствующий кантилевер AFM был отброшен и следующий кантилевер AFM чипа был взят (обычно в порядке C, B, D и E MLCT-Bio-DC). По примеру, данные PEG, одно событие растяжения наблюдалось в 95 из 500 измеренных кривых форс-расширения (19%). Для PNiPAM, 252 из 600 кривых силового расширения показали растяжения картины (42%). Для лучшего сравнения кривых силового расширения была создана одна кривая для каждой температуры. Для этой цели были выбраны только те кривые с растяжением события по крайней мере до 500 pN, где конформационные колебания и эффекты растворителя незначительны, были выбраны52. Окончательное количество участков, принятых во внимание было 3 на 278 K, 7 на 298 K и 4 на 318 K для ПЭГ и 4 на 278 K, 3 на 298 K и 3 на 318 K для PNiPAM18.

Процедура генерации мастер-кривых приведена на рисунке 3. Выбранные кривые силового расширения(рисунок 3A)перемасштабируются в длину L0 (расширение силой 500 pN), см. Рисунок 3B. Пик стыковки показывает большое изменение неспецифической стычки между поверхностью и наконечником aFM cantilever, но не влияет на поведение растяжения полимера. После слияния перемасштабированных кривых силового расширения они усреднились путем биномнального сглаживания, представленного на рисунке 3C. Для этого гауссийский фильтр совмещеет данные с нормализованными коэффициентами, полученными из треугольника Паскаля на уровне, равном параметру сглаживания 2053. Наконец, мастер кривая получается для каждой температуры, как удается на рисунке 3D. Масштабирование показывает диапазон, в котором влияние температуры на поведение силового расширения наиболее выражено.

Сравнение температурного поведения PEG(A)и PNiPAM (B) можно найти на рисунке 4. Для ПЭГ наблюдалось снижение силы растяжения с повышением температуры. При повышении температуры с 278 до 318 К наблюдалось увеличение примерно на 5% перемасштабирования на 100 pN. Для PNiPAM может быть выявлен противоположный температурно-зависимый сдвиг. Снижение примерно на 1% перемасштабированного расширения на 100 pN наблюдалось, когда температура была увеличена с 278 до 328 K. Кроме того, растяжение свободной энергии может быть получено из силовых выдвижения мастер кривых путем определения области под кривой для любого данного значения силы. Это может быть использовано для извлечения энергичных и энтропических вкладов растяжения свободной энергии с помощью молекулярной динамики (MD) моделирования18.

Пример 2: Отчаяние PS с поверхности SAM в воде
Обезборки PS с поверхности SAM в воде может быть использован для определения силы и длины десонции и тем самым количественно гидрофобного взаимодействия. После калибровки, по крайней мере две карты силы были записаны в двух различных точках поверхности. Когда полимерное крепление было успешным, кривые силового расширения показали плато постоянной силы, как характерная особенность, см. Рисунок 5А и Рисунок 5C. Плато-как desorption наблюдается, когда динамика зондированных облигаций гораздо быстрее, чем потянув скорость AFM кантилевер наконечник (квази-равновесие). Силы desorption плато-как кривые форсирования сразу обеспечивают adhesion свободные энергии путем интегрировать след силы-расширения54. Они были использованы для определения электростатических, дисперсивных и гидрофобных взаимодействий, а также фрикционных свойств одиночных полимеров на поверхностях в жидкой среде22,4,,23,,51,,54,,55.

Каждое плато постоянной силы было оснащено сигмоидальной кривой для определения силы desorption и длины desorption, которые затем были построены в гистограммах. Гистограммы были оснащены гауссианским, чтобы извлечь максимальное значение и стандартное отклонение. Для лучшего обзора, сила desorption и значения длины были показаны вместе в рассеянии сюжет, как указано на рисунке 5B и рисунок 5D.

Для полистирола на SAM в воде, определенные силы десурбации соответствуют ранее полученным значениям19,23. Поскольку длина desorption коррелирует с длиной контура полимера51,распределение длины desorption может быть использовано в качестве доказательства ковалентного связывания соответствующего полимера с наконечником aFM cantilever через его функциональную конечную группу. Таким образом, длина desorption служит отпечатком пальца.

Для более чем одного полимера, прикрепленного к наконечнику aFM cantilever, каскады плато (дискретные шаги) можно наблюдать в кривых форс-расширения56. Каждое плато представляет собой опреснение полимера при другом расширении. Эксперимент, приведенный на рисунке 5C и рисунке 5D, показал типичный случай двух полимеров, прикрепленных к наконечнику кантилевера AFM в то же время. При установке окончательного разрыва можно найти бимодальное распределение по длине desorption, в то время как сила desorption показала узкое распределение. В этом случае, меньшая длина desorption может быть найдена в 90% кривых силового расширения, либо в качестве одного плато или в качестве дополнительного плато на более длинном плато, как удается на рисунке 5C. Более высокая длина desorption была найдена в 37% полученных кривых форс-расширения. Таким образом, распределение длины desorption может быть использовано для определения количества различных полимеров, прикрепленных к наконечнику aFM cantilever. В целом, узкое распределение значений длины desorption является хорошим показателем того, что один и тот же один полимер был исследован в полученных кривых форс-расширения. В то же время, суперпозиция соответствующего силы-расширения может быть использована для принятия решения о том, был ли измерен один и тот же один полимер.

После доказательства ковалентной связывания одного полимера PS, дальнейшие эксперименты с этим полимером PS могут быть выполнены из-за различных субстратов (твердая поверхность, а также полимерные пленки), условия растворителя, температура, скорость вытягивания или время пребывания.

Рисунок 1: Схематический обзор процесса функционализации наконечников. Включает в себя химическую модификацию наконечника aFM cantilever после (1)активации плазмы (2)силанизации / PEGylation и (3)полимерного крепления. Кроме того, показаны подробные химические структуры используемых полимеров, а именно PEG, PNiPAM и PS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Устранение помех в кривых силового расширения. (A) Найти силу расширения кривой показаны синусоидальной силы сигнала артефакт вдоль расширения, но не имея одной молекулы растяжения события. (B) Выберите кривую форс-расширения с одной молекулы событие, которое должно быть исправлено из синусоидального артефакта. (C) Наложить кривые для контроля, если синусоидальные артефакты кривых действительно совпадают. (D) Вычитая кривой форс-расширения (A) от (B) кривая форс-расширения с прямой базовой линией получена. Хотя пик адгезии не может быть использован для дальнейшего анализа, кривая форс-расширения теперь корректируется для артефакта, ведущего к гораздо более точным значениям силы в области события одной молекулы (здесь: 0,2 мкм расширения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Определение мастер-кривых из кривых расширения силы ПЭГ на уровне 298 K. (A)Экспериментальные данные на 298 K, используя 7 кривых силового расширения. После переквалификации в длину L0 силой 500 pN (B), кривые силового расширения могут быть объединены и усреднен биномального сглаживания получения мастер кривой(C). Перемасштабированные кривые приводятся в виде точек, в то время как мастер-кривая показана как сплошная линия. Наконец, полученные мастер кривые для различных температур можно сравнить (D). Масштабирование указывает диапазон, в котором влияние температуры на поведение силового расширения наиболее выражено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Сравнение температурно-зависимых мастер-кривых PNiPAM и PEG. Для ПЭГ увеличение перемасштабирования расширения на 100 pN (средней силы диапазона) наблюдается при повышении температуры (A), в то время как для PNiPAM противоположный температурно-зависимый сдвиг выявлено (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Анализ кривых силы расширения PS на SAM в воде. (A) Образцовая кривая форс-расширения (синий) с сигмоидальным припадком плато (фиолетовый). Кроме того, стрелки отмечают определенную силу (красную) и длину (зеленый) плато. Сила desorption и значения длины desorption полученные сигмоидальными припадками показаны в графике рассеяния и результирующей гистограммы приспособлены с Gaussian. (B) Определяется средняя сила desorption и desorption значения длины (112 и 6) pN и (659 х 7) нм, в котором 93% из силы расширения кривых показать такие отдельные события плато. (C) Образцовая кривая силы-расширения (синий) для двух полимеров, прикрепленных к наконечнику кантилевера AFM в то же время. Здесь сила desorption показывает unimodal распределение со средним значением силы (117 и 5) pN, в то время как бимодальное распределение можно найти для длины desorption, ведущей к средним значениям длины (656 и 9) нм и (1050 и 16) нм. (D) 90% пробных кривых силового расширения показывают только одно плато событий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующих финансовых интересов.