Методическая статья

Направленная сборка эластиноподобных белков в определенные супрамолекулярные структуры и грузовую инкапсуляцию In Vitro

DOI:

10.3791/60935

⸱

8 апреля 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На стыке органических и aqueous растворителей, с учетом амфифилических эластиноподобных белков, собираемых в сложные надмолекулярные структуры, такие как пузырьки, волокна и коацерваты, вызванные экологическими параметрами. Описанные протоколы сборки дают Белковые Мембраны на основе Сравнения (PMBCs) с настраиваемыми свойствами, что позволяет инкапсуляции различных грузов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Специализированные белковые строительные блоки являются универсальными кандидатами для сборки надмолекулярных структур, таких как минимальные клетки, средства доставки лекарств и ферментные леса. Благодаря своей биосовместимости и тюнике на генетическом уровне, эластиновые белки (ELP) являются идеальными строительными блоками для биотехнологического и биомедицинского применения. Тем не менее, сборка протеиновых надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами и хорошим инкапсуляционным потенциалом остается сложной задачей.

Здесь мы предоставляем два эффективных протокола для управляемой самосборки амфифилических ELPs в надмолекулярные белковые архитектуры, такие как сферические коакерваты, волокна и стабильные пузырьки. Представленные протоколы сборки генерируют белковые мембранные компоненты (PMBCs) на основе ELPs с адаптируемыми физикохимическими свойствами. PMBCs продемонстрировать фазовое поведение разделения и выявить метод зависимых мембранных синтеза и способны инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза. В результате PMBCs имеют высокий потенциал применения в качестве платформы разработки и доставки наркотиков, искусственных клеток, и разрозненные пространства реакции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сборка надмолекулярных структур для биотехнологических применений становится все более важной1,,2,,3,,4,,5. Для сборки функциональных архитектур, таких как коацерваты, пузырьки и волокна с желаемыми физикохимическими свойствами, важно понимать и контролировать физико-химические и конформационные свойства компонентов. Благодаря молекулярной точности молекул, найденных в природе, строительные блоки для надмолекулярных структур все чаще основаны на липидах, нуклеиновых кислотах или белках. По сравнению с синтетическими полимерами, белковые строительные блоки позволяют точно контролировать возникающие надрамолекулярные структуры6 на генетическом уровне. Первичная аминокислота (аа) последовательность отдельных блоков здания протеина внутренне кодирует информацию для их потенциала агрегата от молекулярного до макроскопического уровня также, как трехмерная форма и физические свойства окончательной надмолекулярной структуры7.

Сообщаемые методы сборки различных надмолекулярных структур часто связаны с амфифильные белки, такие как чувствительные к температуре эластиновые белки (ELP)5,8,9, рекомбинантный олеозин10и искусственный белок амфифилов11. Методы срабатывания температуры привели к сборке мицеллей4,10,12Волокон13Листы14и везикулы9,15,16. Применяются методы, связанные с органическими растворителями, для формирования динамических белковых пузырьков8,11,14. До сих пор применяемые протоколы для формирования везикулчастой часто не имеют контроля сборки над сборками размером с микрометр16,17или имеют ограниченный урожай сборки5. Кроме того, некоторые сообщили ELP на основе пузырьков имеют нарушения инкапсуляции потенциал12или ограниченная стабильность с течением времени9. Устранение этих недостатков, представленные протоколы позволяют самосборку микрометра и субмикрометрового размера надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами, хорошим потенциалом инкапсуляции и длительной стабильностью. Специализированные амфифилические ELPs собираются в надмолекулярные структуры, охватывающие диапазон от сферических коацерватов и высоко упорядоченных витой волокна пучки униламеллярных пузырьков в зависимости от прикладного протокола и связанных с ними условий окружающей среды. Большие везикулярные белковые мембранные сосульки (PMBC) выявляют все основные фенотипы, такие как мембранное слияние и поведение фазового разделения, аналогичное липосомам. PMBCs эффективно инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза, которые могут контролироваться с помощью простой эпифлюоресценции микроскопии. Повторяющиеся области ELP, используемые в данном исследовании, являются привлекательными строительными блоками для супрамолекулярных архитектур на основе белка18. ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG), как известно, переносит различные аа, кроме пролина на четвертой позиции (valine, V), сохраняя при этом свои структурные и функциональные свойства19. Конструкция амфифильных ELPs, содержащая отличительные гидрофильные и гидрофобные домены, была реализована путем вставки остатков гостя aa (X) в повтор ЕС VPGXG с ярко выраженной гидрофобичностью, полярностью и зарядом20. Амфифильные области ELP, где оснащены гидрофобных фенилаланин (F) или изолейцин (I), в то время как гидрофильный домен содержал заряженную глутаминовую кислоту (E) или аргинин (R) в качестве остатков гостя. Список подходящих амфифилических конструкций ELP и соответствующих последовательностей aa можно найти в дополнительной информации и ссылках8,21. Все строительные блоки, где оснащены либо небольшими флуоресцентными красителями или флуоресцентными белками для визуализации с помощью флуоресценции микроскопии. mEGFP и другие флуоресцентные белки были N-терминально слиты с гидрофильных доменов амфифилов ELP. Органические красители были спряжены с помощью медь-свободного штамма способствовали алкин-азид цикловуда (SPAAC) в совместное переводно введены неестественные аминокислоты (UAA). Сотрансляционная инкорпорация UAApara-азидофенилаланин (pAzF)22позволяет N-терминал модификации гидрофильных домен ELP. Таким образом, зеленый флуоресцентный краситель BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) или любой небольшой флуоресцентной молекулы с напряженной циклоктин может быть использован в качестве флуоресцентного зонда. Успешное включение UAA pAzF и циклоaddition красителя через SPAAC может быть легко подтверждено с помощью LC-MS/MS благодаря эффективной ионизации соответствующих триптических пептидов8. Этот небольшой органический краситель был применен для расширения выбора растворителя для протоколов сборки, так как флуоресцентные белки несовместимы с большинством органических растворителей. Ниже описаны два наиболее эффективных протокола сборки надмолекулярных структур, разработанных в нашей лаборатории. Метод отеков THF совместим только с органическим красителем модифицированных амфифилических ELP. В отличие от этого, метод экструзии 1-бутанол (BuOH) совместим со многими белками, как флуоресцентный зонд, например, mEGFP, так как описанный метод полностью сохраняет флуоресценцию этих белков синтеза. Кроме того, инкапсуляция малых молекул и везикулярное поведение синтеза лучше всего работает, используя метод экструзии BuOH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и клонирование амфифильных эластиноподобных белков (ELPs)

  1. Клон и дизайн конструкций, как описано в другом месте8,20. Плазмиды доступны по запросу.

2. Выражение белка, очищение и приготовление

  1. Выражение F20E20-mEGFP и F20E20-mCherry
    1. Прививать основную культуру выражения от ночной предкультуры до OD600 из 0,3. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 200 об/мин в стерильной среде LB 400 мл, дополненной присваиваемыми антибиотиками в 2 л колбе.
    2. Подготовьте акционерное решение IPTG (1 M) для индукции культуры экспрессии в ультрачистой воде.
    3. При достижения OD600 0.5-0.8 добавьте IPTG к культуре выражения к конечной концентрации 1 мМ и снижайте температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию. Разрешить выражение при 20 градусах по Цельсию в течение примерно 20 ч при 200 об/мин.
  2. Выражение амфифилического ELP, содержащего UAA pAzF
    1. Прививать основную культуру выражения от ночной E. coli pre-culture, содержащей две плазмиды pEVOL pAzF и, например, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-его до OD600 0.3 (см. дополнительную информацию для аминокислотных последовательностей). Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 200 об/мин в стерильной среде LB 400 мл, дополненной канамицином и хлорамфениколом в 2 л колбе.
    2. Приготовьте 100 мМ пасетного раствора в ультрачистой воде. Для 10 мл бульонного раствора ПАЗФ, весят 206,2 мг ПАЗИ и повторно применяем его в 8 мл ультрачистой воды. Чтобы растворить pAzF поднять рН раствора с 3 M NaOH и тщательно перемешать. При растворении ПАУЗ внимательно опустите рН до 10,5 и добавьте ультрачистую воду до конечного объема в 10 мл. Используйте стерильный фильтр (0,22 мкм) и подайте раствор в 2 мл реакционных труб.
    3. Приготовьте 1 M штуч-раствор IPTG в ультрачистой воде и 20% растворе арабинозы в ультрачистой воде.
    4. При достижения OD600 0.5-0.8 добавьте pAzF к культуре выражения к окончательной концентрации 2 мМ. Инкубировать культуру в течение 10 мин, 37 КВ, 200 об/мин, чтобы обеспечить поглощение ПАЗФ.
    5. Индуцировать экспрессию целевого белка и экспрессию необходимого синтеза tRNA/t-RNA при одновременном добавлении IPTG (1 мМ) и арабинозы (2%) и снизить температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию.
    6. Разрешить выражение при 20 градусах по Цельсию в течение примерно 20 ч при 200 об/мин. Культура выражения урожая при центрифугации при 4 градусах по Цельсию, 4000 х г,40 мин.
  3. Лиза и очистки белка
    1. Отстегивайте пеллеты E. coli в буфере излисебя (10 мл на литр культуры; 50 мМ Tris-HCl pH 8, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 0,25% Triton X-100), содержащие лисозим (0,1 мг/мл) и PMSF (0,1 мл мл). Инкубировать в течение 30 минут на льду и заморозить и оттаивать два раза после этого, погрузив образец в жидкий азот.
    2. Сонифицировать подвеску (30%, 15 раз, 30 с: 10 с перерывом) и очистить лизат через центрифугацию (4 кв.к., 10 000 х г в течение 40 мин).
    3. Очистите белок с помощью хроматографии сродства (например, на колонке никеля 1 мл с помощью системы FPLC, подключенной к сбору фракций; см. Таблица материалов). Вылейте белок с элюционным буфером (50 мм Tris-HCl, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 250-500 мм имидазола) и хранить при 4 градусах Цельсия до дальнейшей обработки.
    4. Проанализируйте эффективность очистки с помощью SDS-PAGE.

3. Краситель-модификация ELPs через SPAAC

  1. Грубо оцените концентрацию раствора ELP.  Поглощение280 для оценки концентрации не является ценным, так как последовательность pAzF-R40F20 не хватает аминокислот, поглощающих в УФ-диапазоне. Таким образом, ранее лиофилизированный и взвешенный амфифил ELP может быть использован в качестве эталона для сравнения полосы SDS PAGE. Путем сравнения суммированных серых значений intesity sDS PAGE полос из ELP решений с известными концентрациями и ваш образец грубой концентрации образца может быть оценена.
  2. Добавьте 1 зллю флуоресцентного красителя BDP-FL-PEG4-DBCO (10 мМ конечной концентрации; 20 мкм конечной концентрации) до 500 л л раствора ELP (20 мкм). Инкубировать реакцию около 10 ч при 15 градусах Цельсия, в то время как встряхивая и защищены от света.
  3. Для дальнейшего использования диализировать реакцию, чтобы удалить чрезмерное BDP.
    1. Равновесие диализа мембраны (например, 12 kDa отсечения) в ультрачистой воде в течение 10 мин. Вырезать диализм мембраны в правильный размер, который будет помещен на верхней части открытия реакции трубки, содержащей нажал ELP раствор. Чтобы исправить диализную мембрану в отверстие, поместите крышку реакционной трубки с пробитым ядром на отверстие, тем самым закрыв трубку.
    2. Поместите реакционную трубку вверх дном в выбранный буфер. Обмен буфера (2-5 L) дважды после диализа, по крайней мере 3 ч каждый раз. Удалите любые пузырьки воздуха, оказавшись между мембраной диализа и буфером, чтобы обеспечить успешный диализ.

4. Протокол отеков THF

  1. Диализ однородный раствор ELP против фосфата или трис-буфера (10 мМ) со стабильным рН 7,5 для удаления солей и оставшихся соединений из его тега очистки.
  2. Приготовьте лиофилизатор и охладите до стартовой температуры для замораживания сушки.
  3. Aliquot диализированный белковый раствор в 1,5 мл реакционных трубок (50-500 л на трубку) и шоковый замораживание жидкого азота. Чтобы избежать нежелательного смешивания различных белковых растворов во время замораживания сушки, шапки с небольшим отверстием можно положить поверх реакционной трубки, чтобы запечатать его частично.
  4. Возьмите замороженные образцы белка из жидкого азота и сразу же поместите их в лиофилизатор, чтобы начать замораживание сушки. Замораживание сушки завершается, когда образец полностью сухой (примерно 24-48 ч). Впоследствии проветривайте лиофилизированные амфифилические ЭЛП с сухим N2,затем сразу же закрывают крышки реакционной трубки, чтобы избежать контакта с влагой воздуха.
  5. Добавьте чистый THF в лиофилизированные образцы (ELP, 5-10 мкм) и поместите раствор в водяной ванне соникатор, содержащий ледяную воду в течение 15 минут, чтобы обеспечить отек ELP в THF.
  6. Разогреть термоциклопер до 30-60 градусов по Цельсию для образования везикул или до 90 градусов по Цельсию для образования волокна и подготовить новые реакционные трубки, содержащие либо ультрачистую воду или буфер (50 мм2PO4/Na2HPO4, 50 мМ NaCl, рН 5-13). Сферические коакерваты собираются преимущественно при 20 градусах по Цельсию в пределах рН 9-13. Формирование Vesicle благоприятствует при 50-60 градусах Цельсия между рН 7 и 9. Образование волокна предварительно индуцированно над 60 c между pH 5 и 12.
  7. После звукового шага поместите раствор ELP/THF, а также подготовленный ультрачистый раствор воды или буфера в термоциклер и нагрейте до нужной температуры в течение 5 мин. При достигаете температуры разогретый раствор ELP/THF должен быть тщательно стратифицирован поверх разогретой ультрачистой воды или буферного раствора. Должно быть видно четкое разделение двух этапов с определенным интерфейсом.
  8. Поместите смесь в термоцикл снова и инкубировать в течение 20 минут, чтобы обеспечить везикул или волокна формирования на интерфейсе. После этого дайте образцам остыть до комнатной температуры в течение 10 минут до анализа с помощью флуоресценции или диализа.
  9. Диализный раствор, содержащий надмолекулярные структуры против ультрачистой воды или буфера (50 мм2PO4/Na2HPO4,50 мМ NaCl, рН 7-10).

5. Протокол экструзии BuOH

  1. Подготовьте раствор ELP 1-50 мм в ультрачистой воде или буфере (50 мм ПБ рН 7,5, 100 мм NaCl, может содержать до 4 М мочевины). Концентрация амфифилических ELP F20R20-mEGFP и раствора F20R20-mCherry можно определить с помощью коэффициентов вымирания моляров (F20R20-mEGFP A280 - 22015 M-1 см-1 и F20R20-mCherry A280 - 34380 M-1 см-1sequencea)
  2. Добавьте 10%-20% (v/v) 1-бутанол и сразу же смешайте раствор, прокладывая трубку вверх и вниз или рисуя его через шприц несколько раз. Можно нанести общий пипетку калибра 100 л или шприц Hamilton, оснащенный иглой 0,25 х 25 мм. Мутность раствора во время смешивания должна увеличиваться, что указывает на образование везикулы. 1-октанол 5%-15% (v/v) также может быть использован для везикулы экструзии вместо 1-бутанола.
  3. Для достижения узкого распределения размеров, выдавливать пузырьки с помощью мини-экструдера через мембрану с размером поры 1 мкм при комнатной температуре. Размер мембраны, используемый для экструзии, определяет верхний размер отсечения пузырьков.
  4. Диализ пузырьков, как описано выше (шаг 3.3), чтобы удалить остаточный 1-бутанол.

6. Инкапсуляция красителя с протоколом экструзии BuOH

  1. Смешайте примерно 40 мл ELP раствор в 10 мм Tris-HCl, рН 8 с 1 L Dextran Texas Red (0,0025 мг/мл конечной концентрации).
  2. Добавьте в раствор 10 кЛ BuOH и выдавливайте 5-10 раз через шприц, оснащенный иглой 0,25 х 25 мм.

7. Анализ надмолекулярных структур с использованием флуоресценции микроскопии

  1. Поместите подкрепление кольцо на стеклянную горку и твердо прижмите клей стороны к стеклу.
  2. Добавьте 5 зл и пилули образца на внутреннюю часть арматурного кольца и поместите крышку скольжения сверху.
  3. Печать образца с лаком для ногтей по краям крышки скольжения, чтобы избежать испарения образца во время анализа.
  4. Провести флуоресценцию микроскопии, как ранее описано8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка протокола для производства везикул
На рисунке 1 описаны два различных метода подготовки везикля. Метод отеков THF на левой стороне состоит из трех последовательных шагов и приводит к различным надмолекулярным сборкам ELP в зависимости от температуры. На изображении эпифлюоресценции на рисунке 1А показаны пузырьки, собранные из BDP-R20F20, и фибрилюлевые структуры, собранные из BDP-R40F20. Метод BuOH, ил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неисправность при следовании описанным протоколам для сборки определенных надмолекулярных структур в основном приводит либо к образованию неспецифических агрегатов(рисунок 2,IV), либо к однородно распределенным ЭЛП-амфифилам. Критические шаги протокола рассматриваются ниже:

Для высокой экспрессии амфифилового ELP оптимальна относительно низкая температура 20 градусов по Цельсию. Для успешного очищения на основе сродства амфифильных ELP концентрация мочевины 4 М в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят BMBF за финансовую поддержку и Центр биологического анализа систем (ЗБСА) за предоставление научно-исследовательского центра. Мы благодарны. Г. Шульцу, TSRI, La Jolla, California, США за предоставление плазмида pEVOL-pAzF. Мы благодарим сотрудников Центра визуализации жизни (LIC) в Центре биологического анализа систем (ЗБСА) Альберта-Людвига-Университета Фрайбурга за помощь в их конфокальной микроскопии ресурсов, а также отличную поддержку в записи изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 & микро; м и 0,2 & микро; m Стериловый фильтрVWR
1,4-дитиотреитолMerck
1-бутанол. >99,5% в год.Roth
2log DNA ladderNEB
2-меркаптоэтанолRoth
50 мл Falcon tubesVWR
79249 Алкин Мега Стоксов красительSigma Aldrich
Уксусная кислота ледниковаяVWR
Ацетонитрил, безводный, 99,8%Sigma-Aldrich
Ампициллин натрия-соль, 99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Bottle Top Filter с мембраной PES (45 &; м, 22 и микро; m)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Camera DS Qi1
5417rEppendorf
Centrifuge 5810rEppendorf
CF-400-Cu квадратная сетка медная сеткаEMS
ХлорамфениколRoth
CompactStar CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 МВт, нейтральныйLife Technologies
Цифровой сонификаторBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Applichem
Dnase IApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
Экологический шейкер Инкубатор ES-20Biosan
Этанол абсолютРота
Раствор бромида этидияРота
Фильтрподдерживает Avanti
Стеклянные пластиныBio-Rad
Глицерин протеомика МаркаАмреско
Глицин Апличем
H4-Azido-Phe-OHБачхем
Нагревательная пластина MR HeiTecHeiTec Heidolph
HindIIINEB
HisTrap FF Колонка для сырой нефтиGE Life SciencesНикелевая колонка
Гидрохлоридная кислота дымообразование, 37%, в год Merck
Illuminator ix 20INTAS
Illuminator LAS-4000Fujifilm
ImidazoleMerck
Immersions масло для микроскопииMerck
Инкубаторы Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG, >99%Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-АрабинозаРот
Лабораторные весы Extend ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSCChrist
Lysozyme, 20000 Ед/мгМикроскоп Roth
CM 100Philips
Микроскоп Eclipse TS 100Чехлы для
(15 x 15 мм)Предметные стекла для
MicrowaveStudio
Набор мини-экструдеровAvanti Polar Lipids
NaCl, >99,5%, годовыхRoth
гранулы натрийгидроксидаRoth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembraneAvanti
PH meter 766 calimaticKnick
Phenylметилсульфонилфторид (PMSF)
(1 мл)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Белковая лестница 10-250 кДаNEB
Рециркуляционный охладитель F12Julabo
Армирующие кольцаHerma
SacI HFNEB
SDS Пеллеты
Натрия дигидрофосфата дигидрат, NaH2PO4VWR
Стерильный шприц фильтр 0,2 мм Ацетат целлюлозыVWR
T4 ДНК ЛигазаNEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-ConjugateMolecularProbes
Термомикс комфортEppendorf
THF, >99,5% годовыхAcros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton from CaseinRoth
Ультразвуковой очистительVWR
Urea p.a.Вакуумный насос Roth
2,5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans регенерированная целлюлозная трубчатая мембрана (12,0 S / 3,5 S / 1,0 В)Roth
Центрифуга Nikon Фильтр Шейкеры микроскопии Nikon микроскопии VWR Полипропиленовые колонки Roth Рот

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163(2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831(2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Elastin like ProteinsProtein AssemblyVesicle FormationFiber FormationCoacervate FormationProtein PurificationFluorescent Cargo EncapsulationDialysis MethodExtrusion TechniqueConfocal Microscopy

Похожие статьи