Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов в vitro

6.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60952

⸱

20 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Clinical Medicine Center of Tissue Engineering and Nerve Injury Repair, Nantong University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод очищения фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов in vitro.

Аннотация

Основными клетками периферической нервной системы являются клетки Шванн (СК) и фибробласты. Обе эти клетки отчетливо выражают сенсорные и моторные фенотипы, участвующие в различных моделях экспрессии генов нейротрофического фактора и других биологических процессов, влияющих на регенерацию нервов. В настоящем исследовании установлен протокол для получения высокоочищенных крыс сенсорных и моторных ОВ и фибробластов быстрее. Вентральный корень (моторный нерв) и спинной корень (сенсорный нерв) неонатальных крыс (7-дней) были разобщены и клетки были культивируются в течение 4-5 дней, а затем изоляции сенсорных и моторных фибробластов и SC путем сочетания дифференциального пищеварения и дифференциальных методов последовательно. Результаты иммуноцитохимии и анализа цитометрии потока показали, что чистота сенсорных и моторных ОК и фибробластов составила 90%. Этот протокол может быть использован для получения большого количества сенсорных и моторных фибробластов / SCs быстрее, способствуя исследованию сенсорной и регенерации моторных нервов.

Введение

В периферической нервной системе нервные волокна в основном состоят из аксонов, клеток Шванн (СК) и фибробластов, а также содержит небольшое количество макрофагов, микрососудистых эндотелиальных клеток и иммунных клеток1. SCs обернуть аксоны в соотношении 1:1 и заключены с помощью слоя соединительной ткани, называемого эндонеуриум. Аксоны затем в комплекте вместе, чтобы сформировать группы, называемые fascicles, и каждая фасцикля завернутый в слой соединительной ткани, известный как промежности. Наконец, все нервное волокно завернуто в слой соединительной ткани, который называется эпинеури. В эндонеуриум, вся популяция клеток состоит из 48% ОК, и значительная часть оставшихся клеток включает фибробласты2. Кроме того, фибробласты являются важными компонентами всех нервных отсеков, включая эпинеуриум, промежную и эндонеуриум3. Многие исследования показали, что ХК и фибробласты играют решающую роль в процессе регенерации после травмы периферического нерва4,,5,,6. После трансекции периферического нерва, проницаемые фибробласты регулируют сортировку клеток через эпирин-B/EphB2 сигнальный путь между ОК и фибробластами, дальнейшее руководство аксональным отрастанием через раны5. Периферические нервные фибробласты выделяют белок тенасцин-С и усиливают миграцию ХК во время регенерации нервов через сигнальный путь71-интегрин. Тем не менее, ТС и фибробласты, используемые в вышеуказанных исследованиях, были получены из седалищного нерва, который включает в себя как сенсорные, так и моторные нервы.

В периферической нервной системе сенсорные нервы (афферентные нервы) проводят сенсорную сигнализацию от рецепторов к центральной нервной системе (ЦНС), в то время как моторные нервы (эфферентные нервы) проводят сигналы от ЦНС к мышцам. Предыдущие исследования показали, что РК выражают различные моторные и сенсорные фенотипы и выделяют нейротрофические факторы для поддержки периферической регенерации нервов8,,9. Согласно недавнему исследованию, фибробласты также выражают различные двигательные и сенсорные фенотипы и влияют на миграцию SCs10. Таким образом, изучение различий между моторными и сенсорными фибробластами нервов/ТС позволяет нам изучать сложные основные молекулярные механизмы периферической регенерации нервов.

В настоящее время существует множество способов очищения ОВ и фибробластов, включая применение антимитических агентов, антител-опосредованного цитолиза11,,12,последовательного иммунопанирования13 и ламинина субстратом14. Однако все вышеперечисленные методы удаляют фибробласты и сохраняют только НК. Высоко очищенные РК и фибробласты могут быть получены с помощью технологии сортировки цитометриипотока 15,но это трудоемкая и дорогостоящая техника. Таким образом, в этом исследовании, простой дифференциальный пищеварения и дифференциального присоединения метод для очистки и изоляции сенсорных и моторных фибробластов нерва и РС был разработан для того, чтобы получить большое количество фибробластов и ОВ быстрее.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было проведено в соответствии с Руководящими принципами институционального ухода за животными Университета Нантонга. Все процедуры, включая животных субъектов были этически одобрены Административным комитетом экспериментальных животных, провинция Цзянсу, Китай.

1. Изоляция и культура двигательных и сенсорных фибробластов нерва и НК

  1. Используйте семидневных крыс Sprague-Dawley (SD) (n'4), предоставленных Экспериментальным центром животных Нантонгского университета Китая. Поместите крыс в бак, содержащий 5% изофлуран в течение 2-3 минут, дайте животным медленно дышать и не имеют самостоятельной деятельности, а затем дезинфицировать с помощью 75% этанола до обезглавливания.
  2. Используйте ножницы, чтобы сократить заднюю кожу около 3 см и удалить позвоночник. Откройте позвоночный канал тщательно, чтобы разоблачить спинной мозг.
  3. Поддерживайте спинной мозг в 60 мм чашке Петри с 2-3 мл сбалансированным солевым раствором D-Hanks (HBSS).
  4. Основываясь на анатомической структуре, отведение вентральный корень (моторный нерв), а затем спинной корень (сенсорный нерв) под рассекающим микроскопом. Затем поместите их в ледяной раствор соли D-Hanks (HBSS).
  5. После удаления HBSS, нарезать нервы на 3-5 мм штук с ножницами и переварить с 1 мл 0,25% (w/v) трипсин при 37 градусов по Цельсию в течение 18-20 мин. Далее, дополнение с 3-4 мЛ DMEM содержащие 10% плода бычьей сыворотки (FBS), чтобы остановить пищеварение.
  6. Pipette смесь вверх и вниз осторожно около 10 раз и центрифуги на 800 х г в течение 5 минут. После этого отбросьте супернатант и приостановите осадку в 2-3 мл DMEM, дополненном 10% FBS.
  7. Фильтр клеточной подвески с помощью фильтра 400 сетки, а затем привить клетки в 60 мм Петри блюдо и культуры при 37 градусов по Цельсию в присутствии 5% CO2. После 4-5 дней культивирования, изолировать проход 0 (p0) фибробластов и ОВ после достижения 90% слияния.
  8. Изоляция и культура ТС(рисунок 1)
    1. Вымойте клетки один раз с помощью 1x PBS. Добавьте 1 мл 0,25% (w/v) трипсина (37 градусов по Цельсию) на 60 мм чашку Петри, чтобы переварить клетки в течение 8-10 с при комнатной температуре. После этого, добавить 3 мЛ DMEM дополняется 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
    2. Аккуратно взорвать смесь, чтобы отсоединить SCs с пипеткой. Затем собирайте и центрифужщите SCs при 800 х г в течение 5 минут.
    3. Отбросьте супернатант и приостановите осадок в 3 мл DMEM с 10% FBS, 1% пенициллином/стрептомицином, 2 мл форсколина и 10 нг/мл HRG, а затем привить клетки в неокрашенной 60 мм чашке Петри. После культивирования при 37 градусах в течение 30-45 мин фибробласты (несколько фибробластов перевариваются с помощью ОК) прикрепляются к нижней части блюда.
    4. Перенесите супернатант (включая SCs) в другой поли-L-лизин (PLL) со покрытием среднего блюда и культуры при 37 градусов по Цельсию в течение 2 дней.
  9. Изоляция и культура фибробластов(рисунок 1)
    1. После удаления ТС (как показано в шаге 1.8), мыть оставшиеся фибробласты в блюдах с 1x PBS, а затем добавить 1 мл 0,25% (w/v) trypsin переварить фибробласты в течение 2 минут при 37 градусов по Цельсию.
    2. Добавить DMEM дополнен 10% FBS, чтобы положить конец пищеварению. Удар фибробластов с помощью пипетки, а затем собирать и центрифуг их на 800 х г в течение 5 минут.
    3. Отбросьте супернатант, приостановите осадок с 2 мЛ DMEM, содержащим 10% FBS, а затем привить клетки в неокрашенном 60 мм чашке Петри. Фибробласты после культивирования в течение 30-45 мин при 37 градусах Цельсия прикрепляются к нижней части блюда. Откажитесь от супернатанта (в том числе нескольких номеров SCs). Затем добавьте 3 мЛ DMEM, дополненный 10% FBS в блюдо фибробластов и культуры при 37 градусов по Цельсию в течение 2 дней.
  10. Прохождение ячеек p1 до тех пор, пока они не достигнут 90% слияния. Затем очистить их дифференциальным пищеварением и дифференциальным присоединением снова, как описано в разделах 1.8 и 1.9.
  11. Переварить p2 фибробластов и СК после культивирования в течение 2 дней, а затем собирать клетки, считать и прививать в 1 х 105 чисел / хорошо на PLL покрытием слайды для иммуноцинохимии (ICC).

2. МУС для определения чистоты клеток

  1. Культура клеток для 24 ч при температуре 37 градусов по Цельсию и выполнять ICC окрашивания после дифференциального пищеварения и дифференциального соблюдения двигательных и сенсорных фибробластов и SCs.
  2. Вымойте двигательные и сенсорные фибробласты и SCs с 1x PBS и исправить их в 200 мл/ хорошо 4% параформальдегида (рН 7,4) в течение 18 мин при комнатной температуре.
  3. Блокируйте образец SCs с блокирующим буфером (0.1% Triton X-100 в 0.01 M PBS, содержащий 5% козью сыворотку) и блокируйте образец фибробластов с блокирующим буфером (0.01 M PBS, содержащим 5% козьей сыворотки) в течение 45 минут при 37 градусах после мытья их с помощью PBS трижды.
  4. Удалите блокирующий буфер, и инкубировать со следующими первичными антителами: мышь моноклональных анти-CD90 антитела (специфический маркер для фибробластов) (1:1000) для фибробластов и мыши анти-S100 антитела (специфический маркер для SCs) (1:400) для SCs на 4 кк ночь.
  5. Откажитесь от первичных антител, мыть с PBS трижды, и инкубировать со следующими вторичными антителами: Alexa Fluor 594 козы анти-мышеловки IgG (1:400) для фибробластов и 488-конъюгированных коз анти-мышь IgG (1:400) для SCs при комнатной температуре для 1,5 ч.
  6. Вымойте образцы трижды с PBS, и пятно ядер с 5 мкг / мл Hoechst 33342 красителя в течение 10 минут при комнатной температуре. Вымойте образец с 1x PBS трижды и смонтировать их с помощью монтажа среды (20 мл/ слайд) на стеклянной слайде.
  7. Возьмите фотографии клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа в трех случайных полях для каждого колодца. Оцените общее количество ядер и CD90-положительных клеток, S100-положительных клеток, а затем рассчитать процент CD90-положительных клеток и S100-положительных клеток, соответственно. Выполните окрашивание в трипликате.

3. Анализ цитометрии потока (FCA) для определения чистоты клеток

  1. Оцените чистоту моторных и сенсорных фибробластов и ОК, как описано ранее FCA16. Кратко переварить p2 двигатель и сенсорные фибробласты и SCs с 0,25% (w/v) трипсин, повторно клеточных гранул и инкубировать их в среде фиксации при комнатной температуре в течение 15 мин.
  2. Инкубировать клетки с permeabilization среды и зонда с помощью мыши моноклональных анти-CD90 антитела (0,1 мкг/106 клеток, 200 мл) для фибробластов и мыши анти-S100 антитела (1:400, 200 мл) для SCs при комнатной температуре в течение 30 мин, соответственно.
  3. Инкубировать клетки с 488-конъюгированных коза анти-мышь IgG в течение 30 мин. Используйте калибр FACS для выполнения потока цитометрии, и анализировать данные с помощью программного обеспечения Cell Квест.
  4. Инкубировать клетки только с 488-конъюгированных коз анти-мышей IgG (фибробласты группы) и мыши IgG1 каппа (MOPC-21) (FITC) - Изотип управления (группа ТС), который служит в качестве отрицательного контроля.

4. Статистический анализ

  1. Представить все данные в качестве средства - SEM. Оцените статистические различия в данных с помощью неспаренных т-тестовс помощью GraphPad Prism 6.0. Установить статистическую значимость на уровне р-л;0,05. p Выполните все анализы в трипликате.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Световое микроскопическое наблюдение
SCs и фибробласты являются двумя основными группами клеток, полученных в первичной клеточной культуре из нервных тканей. После прививки на 1 ч, большинство клеток придерживались нижней части блюда, и морфология клетки изменилась от круглого к овальному. После культивирования в течение 24 ч, РК выставлены биполярной или триполской морфологии и длина этих варьировалась от 100 до 200 мкм. После 48 ч произошло агрегирование и пролиферац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Две основные популяции клеток периферических нервов включали ХК и фибробласты. В первую очередь культивируемые фибробласты и ТЦ могут точно помочь в моделировании физиологии фибробластов и ОК во время развития и регенерации периферических нервов. Исследование показало, что P7 крысиный седалищный нервный клеток содержит около 85% S100-положительных ХК, 13% OX7-положительных фибробластов и только 1,5% OX42-положительных макрофагов13. Хотя число фибробластов меньше, чем ХК, первоначальный уровень рас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (Грант No 2017YFA010104703), Национальным природным фондом Китая (Грант No 31500927).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG(H+L)Life TechnologiesA11005Разведение: 1:400
CoraLite488-конъюгированный Affinipure Goat Anti-mouse IgG(H+L)ProteintechSA00013-1Разведение: 1:400
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопLeica MicrosystemsTCS SP5
Cell Quest программное обеспечениеBecton Dickinson Biosciences
Сбалансированный солевой раствор D-HankGibco14170112
DMEMCorning10-013-CV
Препарирующий микроскопOlympusSZ2-ILST
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10099-141C
ForskolinSigmaF6886-10MG
Флюорощит Монтажная средаAbcamab104135
Среда фиксации/Среда для пермеабилизацииMulti Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTDGAS005
Проточная цитометрияBecton Dickinson BiosciencesFACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Контроль изотипаAbcamab106163Разведение: 1:400
Мышиное моноклональное антитело против CD90Abcamab225Разбавление: 1:1000 для ICC, 0,1 и микро; g для 106 клеток для Flow Cyt
Mouse anti-S100 антителоAbcamab212816Разведение: 1:400
Polylysine (PLL)SigmaP4832
Рекомбинантный человеческий NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain ProteinR& D Systems396-HB-050
0,25% (w/v) трипсинGibco25200-072

Ссылки

  1. Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
  2. Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
  3. Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
  4. Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
  5. Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
  6. Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
  7. Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
  8. Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
  9. Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
  10. He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).
  11. Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
  12. Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
  13. Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
  14. Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
  15. Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
  16. He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
  17. Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Изоляция фибробластовочистка шванновских клетокдифференциальное перевариваниедифференциальная адгезияанализ методом проточной цитометриииммуноцитохимическое окрашиваниеконфокальная микроскопиярегенерация нервовсенсорные нервы
Очистка фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов в vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.