Адаптируемый угловой стереотаксический подход для универсальных методов нейробиологии

Краткое содержание

Здесь описана стереотаксическая процедура, которая может быть нацелена на сложные и труднодоступные области мозга (из-за пространственных ограничений) с использованием углового коронального подхода. Этот протокол адаптируется как к мышиным, так и к крысиным моделям и может применяться к различным нейронаучным приложениям, включая имплантацию канюли и микроинъекции вирусных конструкций.

Аннотация

Стереотаксическая хирургия является важным инструментом в современной лаборатории неврологии. Тем не менее, способность точно и точно нацеливаться на труднодоступные области мозга по-прежнему представляет собой проблему, особенно при нацеливание на структуры мозга вдоль средней линии. Эти проблемы включают в себя избегание верхнего сагиттального синуса и третьего желудочка и способность последовательно нацеливаться на селективные и дискретные ядра мозга. Кроме того, более продвинутые методы нейробиологии (например, оптогенетика, волоконная фотометрия и двухфотонная визуализация) основаны на целенаправленной имплантации значительного оборудования в мозг, а пространственные ограничения являются общим препятствием. Здесь представлен модифицируемый протокол для стереотаксического нацеливания на структуры мозга грызунов с использованием углового коронального подхода. Он может быть адаптирован к 1) мышиным или крысиным моделям, 2) различным методам нейробиологии и 3) нескольким областям мозга. В качестве репрезентативного примера он включает расчет стереотаксических координат для нацеливания на гипоталамическое вентромедиальное ядро мыши (VMN) для эксперимента по оптогенетическому ингибированию. Эта процедура начинается с двусторонней микроинъекции аденоассиоциированного вируса (AAV), кодирующей светочувствительный хлоридный канал (SwiChR++), в кре-зависимую модель мыши, с последующей угловой двусторонней имплантацией волоконно-оптических канюль. Используя этот подход, результаты показывают, что активация подмножества нейронов VMN необходима для интактных контррегуляторных реакций глюкозы на инсулин-индуцированную гипогликемию.

Введение

Нейронный контроль поведения, кормления и метаболизма включает в себя координацию очень сложных, интегративных и избыточных нейросхем. Движущей целью области нейробиологии является анализ взаимосвязи между структурой и функцией нейронной цепи. Хотя классические инструменты нейробиологии (т.е. поражения, местные фармакологические инъекции и электрическая стимуляция) раскрыли жизненно важные знания о роли конкретных областей мозга, которые контролируют поведение и метаболизм, эти инструменты ограничены отсутствием специфичности и обратимости^1.

Последние достижения в области нейробиологии значительно улучшили способность опрашивать и манипулировать функцией цепи специфическим для клеточного типа способом с высоким пространственно-временным разрешением. Например, оптогенетический^{подходы 2} и хемогенетический^{подходы 3} позволяют быстро и обратимо манипулировать активностью у генетически определенных типов клеток свободно движущихся животных. Оптогенетика включает в себя использование светочувствительных ионных каналов, называемых канальнымиродопсинами, для контроля активности нейронов. Ключом к этой технике является доставка генов канальногородопсина и источник света для активации опсина. Общая стратегия доставки генов заключается в комбинации 1) генетически модифицированных мышей, экспрессирующих cre-recombinase в дискретных нейронах, и 2) cre-зависимых вирусных векторов, кодирующих каналродопсин.

В то время как оптогенетика обеспечивает элегантные, высокоточные средства для контроля активности нейронов, метод зависит от успешной стереотаксической микроинъекции вирусного вектора и волоконно-оптического размещения в определенной области мозга. Хотя стереотаксические процедуры являются обычным явлением в современной лаборатории нейробиологии (и существует несколько отличных^{протоколов,}описывающих эту процедуру)^4,5,6,способность последовательно и воспроизводимо нацеливаться на дискретные области мозга вдоль средней линии (т. Е. Медиобазальный гипоталамус, область мозга, критическая для регуляции гомеостатических функций^7),представляет дополнительные проблемы. Эти проблемы включают в себя избегание верхнего сагиттального синуса, третьего желудочка и прилегающих гипоталамиальных ядер. Кроме того, существуют значительные пространственные ограничения двусторонней имплантации оборудования, которое требуется для исследований ингибирования. Имея в виду эти проблемы, этот протокол представляет собой модифицируемую процедуру нацеливания на дискретные области мозга с помощью углового стереотаксического подхода.

Протокол

Все процедуры были одобрены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения, Руководством по уходу и использованию животных и были одобрены как Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC), так и Гигиеной и безопасностью окружающей среды в Вашингтонском университете.

1. Расчет угловых координат

1. Используя корональный атлас мозга, отметьте прямоугольный треугольник, чтобы гипотенуза проходила через целевую область, которая представляет интерес. В репрезентативном примере(рисунок 1)гипоталамическое вентромедное ядро (VMN) нацелено под углом 15° от средней линии короны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение оси вращения, изображенной на рисунке 1 (и, следовательно, длина стороны C), является произвольным и может быть изменено для нацеливания на любую область мозга. Хотя это может показаться нелогичным, более поздние шаги протокола будут корректировать положение головы на оси Z таким образом, чтобы эта точка выравнивается со стереотаксическим центром вращения (см. раздел 6). Однако рекомендуется не превышать корональный угол поворота 15° из-за физических ограничений аппарата держателя головы.
2. Установите желаемый угол (a) и предполагаемую длину стороны B и используйте тригонометрию для расчета длины сторон A и C. Этот шаг важен для правильного позиционирования головки во время вращения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В примере на рисунке 1линии сетки атласа используются для аппроксимации длины стороны B, в результате чего длина составляет 7,576 мм. Эта информация используется для расчета длины стороны А:
   
   В этом примере 2,03 мм указывает на расстояние R/L от средней линии, на которой волоконно-оптическая канюля входит в мозг, когда голова поворачивается на 15°.
   1. При необходимости вычислите длину стороны C для приближения координат D/V:
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Длина гипотенузы (C) не отражает глубину инъекции, но будет полезна при определении координатЫ D / V, которую, возможно, потребуется отрегулировать, чтобы приспособиться к увеличенной длине по сравнению со стороной B для прямых инъекций. Поэтому рекомендуется выполнять тестовые инъекции для оптимизации координат D/V. 2) В этом примере, нацеленном на VMN, получены два набора координат: один для микроинъекции, которая является неуглированной (A/ P = -1,4, R / L = 0,4 при 0°, D / V = -5,7) и один для угловой волоконно-оптической имплантации (A / P = -1,4, R / L = 0,0 при 15 °, D / V = -5,4).

2. Подготовка стереотакса к угловой процедуре

1. Убедитесь, что стереотаксическая рамка и микроманипулятор были откалиброваны (см. руководство Kopf для полного протокола).
2. Поместите центральный высотомер в гнездо опорной пластины держателя головки.
3. Закрепите центрировку в держателе инструмента, а затем наведите прицел вниз. Отрегулируйте положение микроманипулятора до тех пор, пока перекрестие не будет выровнено и сфокусировано на перекрестии датчиков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе прицел позиционируется в фокальной плоскости центра вращения держателя головы. После создания микроманипулятор не следует перемещать на оставшихся этапах.
4. Поместите ушные вкладыши в держатели и центрируют их так, чтобы линии индикатора с обеих сторон были на уровне 0(рисунок 3A).
5. Используйте медиалально-латеральные и передне-задние ручки на держателе головы(рисунок 2)для выравнивания ушных вкладышей в x- и y-плоскостях над перекрестием центрального высотомера(рисунок 3A).
6. Чтобы выровнять положение ушной балки по оси Z, снимите ушные вкладыши с держателя и снимите центральный высотомер. Замените ушные вкладыши и снова центрите их на 0.
7. Прицел вниз по прицелу. Используйте вертикальную ручку сдвига(рисунок 3B)и ручку коронарного наклона соответственно, чтобы опустить и повернуть ушные вкладыши до тех пор, пока перекрестие прицела прицела не останется центрированным между ушными перекладиками на протяжении коронарного вращения.
8. Стереотакс теперь откалиброван и готов. Не вносите никаких дальнейших корректировок в положение держателя головы.

3. Подготовка материалов для инъекций/имплантации

1. Убедитесь, что все инструменты, хирургические инструменты и материалы стерилизованы и помещены в стерильное хирургическое поле рядом со стереотаксом.
2. Обработка и хранение вирусных конструкций в соответствии с их уровнем биобезопасности и соответствующими институциональными нормативными требованиями в области биобезопасности.
3. Заготовь вирус в шприц, позаботясь о том, чтобы использовать правильную технику обращения и средства индивидуальной защиты.

4. Анестезия

1. Запишите массу тела мыши до операции.
2. Глубоко обезболивают мышь с помощью изофлурана.
3. Убедитесь, что мышь глубоко обезболивается, выполнив тест на защемление носком, пока реакция на вздрагивание не отсутствовает. Если животное продолжает демонстрировать сильные рефлексы, увеличьте концентрацию и/или продолжительность анестезии.
4. Нанесите глазную мазь на каждый глаз, чтобы сохранить его влажным во время операции.
5. Сбрите кожу головы от ушей до глаз с помощью средства для стрижки волос.
6. Обеспечьте мышь анальгетиком, одобренным IACUC.
7. Постоянно наведите наблюдение за животным на протяжении всей хирургической процедуры и обеспечьте тепловую поддержку.

5. Хирургическая процедура

1. Поместите голову в держатель головы, поместив верхние резцы в щель в перекладину укуса, убедившись, что язык находится ниже стойки укуса.
2. Закрепите голову в ушных вкладышах, осторожно вставив ушные вкладыши во внешний слуховой проход, гарантируя, что ушные вкладыши расположены симметрично (обычно от трех до четырех для взрослой мыши). Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения стабильности головки и центрированной для вращения.
3. Асептически подготовьте бритую область разреза тремя чередующимися скрабами бетадина и спиртовых тампонов или с альтернативной институционально одобренной подготовкой хирургического участка.
4. Надень на животное хирургическую драпировку, чтобы сохранить стерильное хирургическое поле и снизить риск послеоперационной инфекции.
5. Обнажите череп, сделав разрез вдоль сагиттальной средней линии кожи головы. Аккуратно соскоблите поверхность черепа, чтобы удалить любую фасцию и обнажить швы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если линии шва трудно визуализировать, перекись водорода может быть нанесена на череп с помощью стерильного аппликатора с хлопковым наконечником для улучшения визуализации шва.
6. Поместите центрировку в держатель и центрите перекрестие на брегме(рисунок 4,левая панель). Ноль микроманипулятора.
7. Переместите перекрестие каудально в лямбду, отметив расстояние брегма-лямбда (B-L).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если шовные линии не следуют прямой линии вдоль средней линии, рекомендуется установить среднюю линию, используя «линию наилучшего соответствия» через брегму и лямбду. Однако, если следовать вышеуказанным шагам, первоначальное размещение прицела должно быть на полпути между ушными вкладышами и близко приближаться к шву средней линии B-L.
8. Если расстояние B-L значительно меньше или больше 4,21 мм, постепенно отрегулируйте назначенную брегму, чтобы получить расстояние B-L 4,21 мм ± 0,2 мм.
9. Замените центрировку индикатором выравнивания. Поместите зонды на лямбду и брегму и отрегулируйте ручку наклона дорсальной части на держателе головы до уровня в сагиттальной плоскости (нос вверх или вниз), затем используйте центрировальный прицел для переназначения брегмы.
10. Используйте индикатор выравнивания для выравнивания в корональной плоскости с помощью ручки коронарного наклона. Измеряйте в нескольких точках по всей ростральной/каудальной оси, чтобы учесть поверхностные деформации в черепе.
11. Обратите внимание на положение на циферблате корональной ручки наклона, так как это положение поворота на 0°.

6. Выравнивание центральных осей вращения для угловых координат

1. Закрепите центрирующую область в держателе инструмента и расположите микроманипулятор к вычисляемой координате из секции 1. Обратите внимание, что координата R/L для угловой имплантации соответствует длине стороны A.
   1. В примере на рисунке 1угловые координаты для волоконно-оптического размещения, нацеленного на VMN, составляют (A/P = -1,4, R/L = [2,03] при коронарном вращении 0°, [0,00] при коронарном вращении 15°, D/V = -5,4).
2. Прицеливание вниз по прицелу и отметка этой координаты (R/L 2,03 мм от средней линии в примере VMN; Рисунок 4,средняя панель). Эта отметка представляет собой точку, в которой канюля войдет в мозг после вращения головы.
3. Переместите микроманипулятор над средней линией (R/L = 0,00). Используйте корональный регулятор наклона для поворота головки на угол, рассчитанный в разделе 1.
   1. Если перекрестие прицела области уже совпадает с отметкой, перейдите к разделу 7.
   2. Если перекрестие прицела не совпадает с контрольной отметкой, отрегулируйте положение головы по оси Z с помощью ручки вертикального сдвига(рисунок 2)до тех пор, пока перекрестие не выстроится как можно ближе к отметке.
4. Поверните голову назад в коронарную позицию на 0°. Если вертикальное смещение было скорректировано на шаге 6.3, переназначьте брегму с помощью центрирования.
5. Повторяйте шаги 6.3 и 6.4 до тех пор, пока перекрестие не достигнет контрольной отметки при повороте головы(рисунок 4C).
6. В этот момент произвольная точка вращения, установленная в разделе 1, теперь должна быть выровнена со стереотаксическим центром вращения.

7. Микроинъекция

1. Поместите стереотаксическую дрель в держатель и переместите микроманипулятор к первой координате впрыска.
   1. Согласно примеру нацеливания на VMN, сверлите при A/P = -1,4 и R/L = 0,4, пока напор находится на одном уровне.
2. Опуньте сверло до тех пор, пока долото не будет чуть выше черепа. Включите дрель и осторожно опуская, пока долото только что не просверлило череп (не дурную оболочку).
3. Повторить для места контралатеральной инъекции.
4. Используйте стерильный игольчатый драйвер для введения изгиба на 90° в иглу 27-30G (например, стерильного инсулинового шприца 0,5 мл) и используйте изогнутую иглу, чтобы осторожно просунуть твердый мозговой оболочку.
5. ПРИМЕЧАНИЕ: При возникновении кровотечения нанесите давление стерильным аппликатором с хлопковым наконечником и очистите стерильной водой до тех пор, пока кровотечение не прекратится.
6. Когда все будет готово к инъекции, аккуратно поместите наполненный шприц Hamilton в стереотаксический держатель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты на микроманипуляторе больше не применяются после переключения на новый инструмент. Используйте центр отверстия заусенцев в качестве новой мишени для инъекции.
7. Осторожно расположите иглу над отверстием заусенцев.
8. Опуститесь иглой до тех пор, пока она не коснется твердой мозговой оболочки в центре отверстия заусенца. КРИТИЧЕСКИЙ: Нулевой микроманипулятор только по оси Z, так что координаты на микроманипуляторе для стереотаксического центрирования и сверла сохраняются.
9. Медленно опустите иглу в мозг, внимательно следя за тем, чтобы игла не отклонялась на краю отверстия заусенцев. Продолжайте опускать до 0,05 мм вентральную до координаты ВПРЫСКА и подождите 1 мин. Этот дополнительный шаг создает небольшой «карман», чтобы свести к минимуму вирусный обратный поток при удалении иглы.
10. Медленно поднимите иглу к координате D/V и начните инъекцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость и объем потока будут варьироваться в зависимости от целевого региона и экспериментального проекта. Для оптогенетического глушения нейронов VMN необходимо достаточное покрытие, поэтому вводится 200 нЛ вируса со скоростью 1 нл/с.
11. После микроинъекции подождите 10 минут в месте инъекции, чтобы свести к минимуму выброс вируса во время отмены.
12. Медленно выводят микропипетку из мозга с приблизительной скоростью 1 мм/мин.
13. Как только игла очистится от черепа, выбросьте небольшой объем вируса, чтобы убедиться, что игла не засорилась кровью или тканью. Используйте стерильный аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы удалить вирус, прежде чем продолжить.
14. Повторите шаги 7.6–7.12 для контралатеральной стороны.
15. Запечатайте отверстия микроинъекции заусенцев костным воском для улучшения заживления(рисунок 5B).

8. Волоконно-оптическая имплантация

ПРИМЕЧАНИЕ: После вирусной инъекции двусторонние волоконно-оптические канюли имплантируются под расчетным углом на секцию 1. Обратите внимание, что эти координаты уже должны быть отмечены на черепе из раздела 6.

1. Повторите шаги 7.1–7.4 для угловых координат.
2. Верните голову в положение уровня 0°.
3. Далее с помощью ручного сверла можно изготовить четыре дополнительных отверстия для костных винтов: два должны быть размещены с передней части и два с задней стороны(рисунок 5А). Они будут служить якорями для прикрепления волоконно-оптики к черепу(рисунок 5D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отверстия расположены достаточно далеко от угловых координатных отверстий заусенца, чтобы вместить часть наконечника волоконно-оптического, которая находится над черепом.
4. Как можно остязательнее используйте маленькую плоскую отвертку, чтобы установить костные винты так, чтобы они прочно сидели в черепе, но не проникали в мозг.
5. Зажмите волоконно-оптиическую канюлю в держатель канюли и поместите ее в стереотаксический держатель.
6. Поверните головку на рассчитанный угол, еще раз отметив, что координаты на микроманипуляторе не относятся к новому инструменту. Используйте центр угловых отверстий заусенцев в качестве мишени для имплантации.
7. Опустите волоконно-оптику до тех пор, пока она не коснется твердой мозговой оболочки в центре отверстия заусенца(рисунок 5C). Обнулите микроманипулятор на оси z, затем медленно замедлите волоконно-оптику до угловой координаты D/V (-5,4 в примере VMN).
8. Используйте цианоакрилатный гель для соединения волоконно-оптического наконечника с ипсилатеральными анкерными винтами, затем нанесите ускоритель с наконечником микропипетки(рисунок 5D).
9. Как только цианоакрилатный гель полностью затвердеет, осторожно ослабьте держатель канюли и поднимите до тех пор, пока не очистится волоконно-оптическая овсянка.
10. Повторите шаги 8,5–8,9 для координаты с противоположным углом, затем выровняйте голову. Для дополнительной безопасности сделайте дополнительное соединение между двумя угловыми волоконно-оптическими канюлями с цианоакрилатным гелем и ускорительным(рисунок 5D).
11. Приготовьте небольшое, относительно тонкое количество зубного цемента. Нанесите на поверхность черепа, убедившись, что тщательно прикрыли анкерные винты и основание волоконно-оптических канюль. Оставьте достаточное количество наконечника чистым для последующего сопряжения с волоконно-оптическими патч-кабелями.
12. Как только цемент высохнет, извлеките мышь из стереотаксического аппарата.
13. Поместите мышь в восстановительную клетку с терморегуляционной поддержкой. Позвольте ему восстановиться и перенестись в домашнюю клетку, как только он появится бдительным, мобильным и грумингом.

9. Послеоперационный уход

1. Ежедневно контролируйте животных в течение 3 дней после операции на поведение, осанку, активность и уход за собой, а также ведите учет потребления пищи и массы тела.
2. Если у животных проявляются какие-либо общие признаки боли или плохого самочувствия, проконсультируйтесь с ветеринарными службами.
3. Дайте мышам не менее 2 недель для выздоровления и для вирусной экспрессии, прежде чем начинать поведенческие исследования.

10. Оптогенетика

1. Для выполнения оптогенетических исследований обратитесь к Sidor et al.⁸.
2. Проверка вирусной экспрессии и размещения клетчатки по завершении исследований.

Результаты

Этот протокол описывает хирургическую процедуру для проведения оптогенетических исследований для изучения роли нейронов VMN гипоталама в гликемическом контроле^9. Первым был использован стандартный (неугольный) стереотаксический подход для двусторонней микроинъекции ингибирующего канального вируса в VMN. Хотя угловой подход также был бы подходящим, стандартный (неуглированный) подход был выбран, потому что он достаточен для нацеливания на интересуемую область мозга и является простым, надежным и по...

Обсуждение

Последние достижения в области неврологии поддерживают продвинутое понимание и понимание активности и функции нейросхем мозга. Это включает в себя применение оптогенетических и хемогенетических технологий для активации или подавления дискретных нейронных популяций и их проекционных участков in vivo. Совсем недавно это включало разработку генетически закодированных показателей кальция (например, GCaMP, RCaMP) и других фторометрических биосенсоров (например, дофамина, норадреналина) для регистрации активности нейронов in v...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Волоконно-оптические канюли	Дорические линзы	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Настраиваемая
система выверки Kopf Модель 1900 Стереотаксическая система выравнивания	Kopf	Модель 1900
Kopf Модель 1900-51 Центральный высотомер	Kopf	Модель 1900-51
Kopf Модель 1905 Индикатор юстировки	Kopf	Модель 1905
Kopf Модель 1911 Стереотаксическая дрель	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Центрирующий эндоскоп	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-градусные неразрывные ушные накладки	Kopf	Model 1922
Держатель головки для газовой анестезии мыши	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Микроманипулятор	Kopf	Model 1940
Micro4 Система микроинъекций	World Precision Instruments	-
Мышиные костяные винты	Пластик One	00-96 X 1/16
Стереотаксический держатель канюли, наконечник 1,25 мм	Хирургическая дрель Thor Labs	XCL
Cell	Point Scientific	Ideal Micro Drill