Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60996

⸱

10 апреля 2020 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, University of Kentucky

В этой статье

Краткое содержание

Модели ксенотранспланта зебрафиш позволяют проводить скрининг с высокой пропускной мощностью и флуоресцентную визуализацию раковых клеток человека в микроокружении in vivo. Мы разработали рабочий процесс для крупномасштабного, автоматизированного скрининга лекарственных средств на образцах лейкемии, полученных от пациента, у зебры с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа, оборудованного блоком визуализации.

Аннотация

Пациент производные модели ксенотрансплантата имеют решающее значение в определении того, как различные виды рака реагируют на лечение наркотиками в системе in vivo. Мыши модели являются стандартом в этой области, но зебрафиш стали альтернативной моделью с рядом преимуществ, в том числе возможность высокой пропускной способности и недорогих наркотиков скрининга. Зебрафиш также позволяют для in vivo скрининга наркотиков с большими номерами репликации, которые ранее были доступны только с системами in vitro. Возможность быстро выполнять крупномасштабные экраны наркотиков может открыть возможность для персонализированной медицины с быстрым переводом результатов обратно в клинику. Модели ксенотрансплантата зебрафиш также могут быть использованы для быстрого скрининга на действия мутаций на основе реакции опухоли на целевую терапию или для выявления новых противораковых соединений из крупных библиотек. В настоящее время основным ограничением в этой области является количественное и автоматизация процесса, с тем чтобы экраны наркотиков можно было сделать в более широком масштабе и быть менее трудоемким. Мы разработали рабочий процесс для ксенотрансплантации первичных образцов пациентов в личинки зебры и выполнения крупномасштабных экранов наркотиков с помощью флуоресцентного микроскопа оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер. Этот метод позволяет стандартизировать и количественно привязать область опухоли и ответ на медикаментозное лечение в большом количестве личинок зебры. В целом, этот метод является выгодным по сравнению с традиционной клеточной культуры скрининга наркотиков, как это позволяет для роста опухолевых клеток в среде in vivo на протяжении всего лечения наркотиками, и является более практичным и экономически эффективным, чем мышей для крупномасштабных in vivo наркотиков экранов.

Введение

Xenografting первичных раковых заболеваний пациента или раковых клеток человека линий в модель организмов является широко используемым методом для изучения прогрессирования опухоли и поведения in vivo, реакция опухоли на лечение наркотиков, и взаимодействие раковых клеток с микросредой, среди других. Традиционно, клетки ксенопригватом в иммунно-компрометированных мышей, и это остается стандартом в этой области. Тем не менее, эта модельная система имеет ряд ограничений, таких как высокая стоимость, низкие цифры репликации, трудности в точной количественной опухолевой нагрузки in vivo, и длительное время, которое требуется для опухолей, чтобы привить и тестирование на наркотики, которые должны быть завершены. В последние годы, зебравый стали альтернативной модели ксенотрансплантата, с первым сообщается в 2005 году, с зеленым флуоресцентным белком (GFP) помечены человеческой меланомы клеточных линий пересажены в бластулы стадии эмбрионов1,2. Совсем недавно, 2 дня после оплодотворения (dpf) личинки зебры были использованы в качестве получателей ксенотрансплантата, чтобы обеспечить контроль анатомического расположения инъекций и для использования в высоком разрешении in vivo изображений взаимодействия опухоли с окружающей микросредой3,4.

Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели ксенотрансплантата. Во-первых, взрослых зебры можно разместить и быстро разводить в больших количествах по относительно низкой цене. Каждая пара взрослых зебр ы может производить сотни личинок рыбы в неделю. Из-за их небольшого размера, эти личинки зебры могут быть сохранены в 96-колодцев для высокой пропускной связи наркотиков скрининга. Larvae не должны быть поданы в ходе типичного эксперимента ксенотрансплантата, так как их желток-мешок обеспечивает питательные вещества для поддержания их в течение первой недели жизни. Кроме того, зебрафиш не имеют полностью функциональной иммунной системы до 7 dpf, а это означает, что они не требуют облучения или иммуносупрессивных схем до инъекции ксенотрансплантата. Наконец, оптически четкие линии зебры позволяют с высоким разрешением изображения опухолево-микроэкологических взаимодействий.

Возможно, наиболее перспективным применением зебры в качестве модели ксенотрансплантата является способность выполнять высокопроизводительный скрининг наркотиков на образцах рака человека таким образом, что это невозможно с помощью любого другого модельного организма. Larvae поглощают наркотики из воды через кожу, повышая легкость введения препарата5. Поскольку животные поддерживаются в 96-колодцах, как правило, в 100-300 л воды, экраны требуют меньших количеств наркотиков по сравнению с мышами. В настоящее время существует несколько различных методов стандартизации и количественной оценки влияния препаратов на бремя опухолей человека у зебры, некоторые из которых являются более практичными, чем другие, для масштабирования одного тестирования на наркотики для скрининга с высокой пропускной стоимостью. Например, некоторые группы разъединяют рыбу на одноклеточные суспензии и количественно флуоресцентно помечены или окрашенные опухолевые клетки путем визуализации отдельных капель подвески и количественной флуоресценции с помощью полуавтоматическогоМакро-4ImageJ . Полуавтоматический метод визуализации цельноликов был разработан, в котором личиночные рыбы были зафиксированы в 96-колодцах пластин и изображены с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа перед перегруппировкой композитных изображений и количественной оценкой очагов опухолевых клеток6. Оба эти анализы являются довольно трудоемкими методами количественной оценки, которая сделала действительно высокой пропускной способ скрининга наркотиков в модели ксенотрансплантата зебра непрактично.

Этот вопрос был решен в результате разработки Vertebrate Автоматизированная технология скрининга (VAST) Bioimager и большой частицы (LP) Sampler, флуоресценция микроскоп оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер (Рисунок 1 и таблица материалов), который является действительно автоматизированным методом для высокой пропускной записи личинки зебры7,8,9. С помощью этого устройства, рыбы под анестетом, взяты автоматически из 96-колодец пластины, расположенные в капилляре и вращается в набор ориентации на основе заданных предпочтений пользователя, изображения, а затем либо помещены обратно в тот же колодец нового 96-ну пластины для дальнейших исследований или отбрасываются. Сочетание этой технологии визуализации с зебрафиш ксенотрансплантатов может позволить возможность персонализированной медицины, которая использует высокой пропускной связи скрининга наркотиков крупных библиотек соединения наркотиков против отдельных опухолей пациента. Кенотранспланты зебрафиш также предлагают крупномасштабный и недорогой метод для проверки токсичности и эффективности новых соединений in vivo. Зебрафиш может быть использован в качестве предварительного шага скрининга, прежде чем приступить к мыши ксенотрансплантат модели.

Мы разработали обтекаемый рабочий процесс для ксенотрансплантации первичных клеток лейкемии пациента в зебрафиш и выполнения высокой пропускной записи наркотиков экраны с автоматизированной визуализации и количественной оценки, которые могут быть применены к любой другой первичной опухолевых клеток пациента или раковой линии клеток. Этот рабочий процесс использовал флуоресцентный микроскоп оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплердля для улучшения текущих методов стандартизации и количественной оценки и предлагает автоматизированную альтернативу предыдущим, более трудоемким методам количественной оценки опухолевой массы in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Кентукки (протокол 2015-2225). Образцы пациентов были собраны в рамках Институционального совета по обзору Университета Кентукки (протокол 44672). Все эксперименты на животных, проводимые в соответствии с этим протоколом, должны быть одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных.

1. Таяние первичного пациента Острый лимфобластный лейкоз клеток

  1. Оттепель первичных пациентов периферических клеток периферии крови (PBMCs) из замороженных запасов в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Сразу же после того, как клетки разморозились, переносите клетки в их замораживающие носители (90% FBS и 10% диметилсульфодки (DMSO) в коническую трубку 15 мл с медленным пипеткой, избегая пузырьков воздуха. Добавьте 10 мл предварительно разогретых 37 градусов по Цельсию оттаивательных носителей (25% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в модифицированной средней «IMDM» Компании Искова (примерно 2 с 3 с на мл) к клеткам в конической трубке 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПБМК были собраны из образцов крови пациента во время постановки диагноза. Буффи пальто было разделено плотности центрифугирования и клетки были промыты 2x в RPMI 1640 и 10% FBS. Клетки были подсчитаны и 107 клеток были заморожены на криовиальный в 1 мл замораживания средств массовой информации, и хранится на -80 градусов по Цельсию.
  2. Клетки центрифуги при 100 х г в течение 10 мин и аспирные носители из клеточной гранулы. Повторите добавление оттепели, центрифугация, и стремление еще раз, чтобы удалить любые остаточные DMSO.
  3. Отстегивайте клетки в 5 мл фосфатно-буферизированного сольятого раствора (PBS) и удалите 10 л для подсчета на автоматизированном счетчике клеток или гемоситометре. Добавьте 10 зл и немного синего трипана до 10 злител клеток, удаленных для подсчета. Подсчитайте количество ячеек на мл и запишите, чтобы позже рассчитать объем для повторной приостановки клеток для ксенотрансплантации (см. шаг 2.5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 500 клеток ксенопригируются на личиночных зебры. Например, 5 х 105 клеток необходимы для введения 1000 зебры. Выживаемость должна быть йgt;85% использовать для ксенотрансплантации. В этом эксперименте жизнеспособность клеток составила 96% после оттаивания, оцениваемых трипаном синего окрашивания.

2. Флуоресцентно маркировка клеток с DiI

  1. Центрифуга желаемого номера ячейки в 5 мл PBS на 200 х г в течение 5 мин и аспир супернатант. Пятно минимум 2 х 106 клеток в случае слипания или проблемы загрузки иглы во время инъекции.
  2. Сделать 1,1'-диокецикл-3,3,3',3',3'-тетраметилиндокарбоциана перхлората (DiI) окрашивающий раствор (5 мл PBS, содержащий 4 л на мл пятна DiI, Таблица материалов) и повторно вникать в растворе окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток не должна превышать 2 х 106 клеток/мл при повторном походе в растворе окрашивания.
  3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия защищены от света в течение 20 минут, вихрь мягко, затем инкубировать клетки на льду в течение 15 минут защищены от света.
  4. Клетки центрифуги при 200 х г в течение 5 мин и аспирсупернат. Вымойте клетки с 5 мл PBS, центрифуга на 200 х г в течение 5 мин и аспир супернатант. Повторите мытье, центрифугацию и стремление еще раз.
  5. Повторное перетаскивание клеток в 1 Л ПБС на 250 000 живых клеток и передача в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Держите resuspended клетки на льду в темноте и немедленно продолжайте микроинъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что 500 клеток пациента вводятся в зебры с каждым инъекционным насосом 2 nL объема.

3. Микроинъекционные личинки зебрафиш

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинъекции должны быть завершены в течение 1'3 ч окрашивания для повышения жизнеспособности клеток.

  1. До окрашивания клеток и инъекций, сделать агарозные пластины для инъекций, заливки 25 мл 3% агарозы в 1x Tris/borate/EDTA (TBE) в чашку Петри и дать ему затвердеть. Храните тарелки при 4 градусах по Цельсию в течение 2 недель.
  2. Кроме того, до окрашивания клеток и инъекций, dechorionate 2 dpf зебрафиш с помощью щипц под рассекающим микроскопом. Для ручного дехорионации, тянуть с противоположных концов защитного хориона зебры с щипками, пока хорион слезы и зебрафиш становится unокудный10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дехорионация также может быть выполнена с помощью ферментативного лечения с проназе, как ранее описано10. Каспер (рой---;nacre-/-) зебрабыли были использованы для этих экспериментов11. Любой штамм личинки зебры может быть использован для ксенотрансплантации. Если пигмент мешает визуализации или визуализации, пропилтиурацил (PTU) лечение может быть использовано для блокирования синтеза меланина, если оптически четкие штаммы зебры не доступны12.
  3. Прешилхилл иглы при 4 градусах Цельсия или на льду, чтобы предотвратить слипание клеток во время микроинъекции. Загрузите 5 зЛ окрашенных клеток в охлажденную нефилатустную боросиликатную стеклянную иглу с помощью наконечников пипетки microloader.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинжетор и методы установки иглы были ранее опубликованы13.
  4. Загрузите иглу в руку микроинжектора. Освящите кончик иглы стерильным лезвием бритвы. Измерьте размер капли в минеральном масле с помощью микрометра стадии, сохраняя объем капель последовательно на 2 nL (диаметр 0,15 мм) во всем.
  5. Используйте 350 л 4 мг/мл трикаина-S для обезврежения 30 дехорионированных 2 dpf зебры в чашке Петри, содержащей 25 мл E3 средств массовой информации. После 1 мин перенесите анестезированные личинки на плоскую поверхность инъекционной пластины (3% агарозы в чашке Петри) и вводят личинки одним насосом окрашенных клеток в нужном месте инъекции (например, желток или перикард; см. Рисунок 2A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Место инъекций должно быть выбрано на основе цели эксперимента. Наиболее распространенным местом инъекции является желток. Чтобы получить клетки, циркулирующие в крови, перикард, проток Кювье, перивителин пространства, или ретро-орбитального пространства могут быть использованы в качестве инъекций сайтов. Ортотопические инъекционные участки также могут быть использованы, такие как мозг.
  6. Вымойте личинки с пластины инъекций в 10 см2 Петри блюдо (30 личинок на тарелку), содержащий E3 сми14 без метилена синий и инкубировать при 28 градусов по Цельсию в течение 1 ч период восстановления. Продолжайте инъекционные до желаемого количества личинок были введены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале вводят в 2,2 раза больше личинок, необходимое для экспериментов. Там будет некоторое вымирание личинок из-за стресса от инъекций и повышенной температуры инкубации. Как правило, после практики с техникой, 800-1500 личинок зебры могут быть введены одним человеком в течение 1 х 3 ч, когда окрашенные клетки должны быть введены.
  7. Переместите пластины впрыскиваемых личинок в инкубатор 34 градусов по Цельсию. Не помещайте блюда Петри из личинок прямо на металлическую полку в инкубаторе, чтобы предотвратить перегрев воды Е3. Например, поместите пустое блюдо Петри между полкой и петри блюдо личинок выступать в качестве буфера. Удалить мертвых личинок зебры после 24 и 48 часов после инъекции (hpi).

4. Настройка экрана наркотиков с Xenografted зебрафиш

  1. На 48 hpi, экран личинки зебры для флуоресценции / опухоли прививок и здоровья(рисунок 2C,D). Удалите всех мертвых или пороков зебры и выберите зебры с аналогичным ит-х разыгранием(рисунок 2C,D, 1'3 и 1'3'). Удалите неприваемых зебры(рисунок 2C, D, 5 и 5').
    1. Для желтка вводят рыбу, удалить рыбу, где границы желтка не может рассматриваться вокруг привитой клеточной массы(рисунок 2C, 4), как это делает количественную оценку трудно. Для перикарда вводят рыбу, удалить рыбу, где вводили клеточной массы посягает на желточный мешок(рисунок 2D, 4').
  2. Добавьте зебры в 96-колодую тарелку. Для этого, отрежьте кончик от 200 qL пипетка отзыв, просто достаточно большой для 4 dpf зебрафиш, чтобы соответствовать до конца. Аспир 150 л E3 носителей с одной зебры из пластины с помощью пипетки P200, и добавить к пустой колодец плоским дном 96-колой пластины.
  3. Разбавить препарат для тестирования в необходимом объеме E3 средств массовой информации, на 150 Л л на скважину. Приготовьте препарат в 2 раза больше нужной концентрации. Например, подготовить 20 км препарата в E3, если желаемая конечная концентрация составляет 10 мкм, так как половина от общего объема в каждой скважине состоит из раствора препарата. Для контрольной группы DMSO добавьте DMSO в том же объеме, что и препарат.
  4. Добавьте 150 л раствора 2x разбавленного препарата к каждому хорошо содержащему личинки зебры в 150 Зл E3, для окончательного объема 300 Зл с 1x лекарственным раствором на скважину.
  5. Инкубировать тарелку при 34 градусах Цельсия. Проверяйте на наличие мертвых зебры ежедневно. Через 2 дня, при желании, освежите препарат, удалив 200 л жидкости из каждой скважины из 96-хорошей пластины и заменив 200 ЛЛ 1x разбавленного лекарственного раствора или ДМСО в E3 media.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшие результаты были найдены после 3 дней медикаментозного лечения для этого эксперимента; однако продолжительность медикаментозного лечения может варьироваться от 2 до 4 дней и, возможно, потребуется оптимизировать сядр на основе проводимого эксперимента или использования лекарств.

5. Imaging Xenografted зебрафиш с помощью флуоресцентного микроскопа оборудованный imaging блок и автоматизированный блок образца

  1. Приготовьте 1 л свежих 4 мг/мл трикаина и 1,5 л E3-носителей. Заполните медиа-бутылку 1 с E3 СМИ и медиа бутылку 2 с трикаином.
  2. Удалите все нежелательные флуоресцентные каналы в программном обеспечении для визуализации и добавьте нужный канал (DiI для этого эксперимента). Проверьте желаемый флуоресцентный канал, так как изображение будет взято только для каналов с галочкой. Также выберите, как будут приниматься изображения (z-stacks, автоматизация, циклы в серии и т.д.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента, фокус был вручную установлен для каждой рыбы изображения, чтобы получить наибольшее количество изображений с оптимальной фокусировки.
  3. Изображение DMSO управления рыбой перед наркотиками обработанных рыб, так что соответствующее время воздействия может быть установлено в изображении программного обеспечения. После установки экспозиции не изменяйте время экспозиции в течение всего эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фокус может быть либо скорректирован вручную для каждого зебры, чтобы убедиться, что нет вне фокусизображения, или для полностью автоматизированной визуализации, тот же фокус может быть использован между рыбой с из фокуса изображения отбрасываются или рыбы reimaged до выполнения анализа. Кроме того, этот эксперимент может быть проведен с помощью любого флуоресцентного изображения с последующим количественной оценкой флуоресценции с помощью программного обеспечения ImageJ.

6. Количественная оценка флуоресценции с использованием ImageJ

  1. Открытое программное обеспечение ImageJ.
  2. Перейти к файлу Откройте и выберите нужный файл .czi. Программное обеспечение будет воспитывать окно вариантов импорта.
    1. Для просмотра стека выберите Hyperstacks,проверьте Открытые файлы индивидуально,проверьте Autoscale,и проверить Сплит каналов. Для варианта цвета выберите Цветные.
  3. Нажмите на плагины Макрос Запись.
  4. Нажмите изображение (ru) Отрегулируйте (англ.) Пороговый . Выберите тип изображения в виде красного цвета в меню выпадения с правой стороны порогового окна. Отрегулируйте минимальный порог до тех пор, пока программное обеспечение не выделяет только области с флуоресценцией(рисунок 3A)и нажмите Apply. Программное обеспечение преобразует фотографию в черно-белую, с выбранной областью в черном цвете.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте один и тот же порог для каждого изображения на экране препарата, чтобы сохранить результаты стандартизированы и сопоставимы.
  5. Нажмите Анализ (ru) Мера. Программное обеспечение подтянет окно результатов, содержащее флуоресцентную область для этого изображения.
  6. Нажмите Создать на окне Макро рекордер. Это откроет новое окно с кодом для макроса. Выделите все желаемые изображения для анализа и откройте как в шаге 6.2.
  7. Выберите Выполнить на окне с макросом. Окно результатов теперь будет содержать область для каждого изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображения может быть сделан индивидуально без записи и запуска макроса, а также путем повторения вышеуказанных шагов для каждого изображения.
  8. Копирование измеренных данных в электронную таблицу. Средняя суммарная флуоресценция всех контрольных (DMSO) образцов. Рассчитайте процентную разницу, используя следующую формулу: :(средняя площадь DMSO - экспериментальная область)/средняя площадь DMSO х 100%(рисунок 3B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В соответствии с протоколом, описанным выше, зебрабыли были ксеноприжированы в желток и перикард с первичным пациентом PBMCs, которые были первоначально изолированы от Т-клеток острого лимфобластного лейкоза (T-ALL) пациента при диагностике и накренился как жизнеспособный, замороженный образец. На 48 hpi, ксенотрансвированные рыбы были проверены на флуоресцентно помечены опухолевые клетки(Рисунок 2C,D) и лечение химиотерапией (дексаметазон или винкристин) или DMSO. Рыбы были...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали стандартизированный метод оттаивания и инъекции первичных клеток лейкемии пациента в зебрафиш в качестве модели ксенотрансплантата. Мы также установили протокол для высокой пропускной записи наркотиков скрининга ксенотрансвированных зебры с помощью флуоресцентного микроскопа оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер. Ранее, ксенотрансплантаты были зарегистрированы с человеческими клеточными линиями, и количественная оценка ксенотрансвированных опухолей в в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано V Фонд V Стипендиат премии и NIH Гранты DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. Блэкберн) и NIH Обучение Грант T32CA165990 (М.Г. Хэйни).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Жидкий концентратTBE VWR0658-5L
96-луночная пластина, плоское дноCELLTREAT229195VAST совместима с различными стандартными или глубокими скважинами 24, 48 или 96 лунок
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Боросиликатное стекло Капилляр без нитинакала Sutter Instrument CompanyB100-50-10
ДексаметазонEnzo Life SciencesBML-EI126-0001
DMSOSigma-AldrichD2438-5X10ML
E3 медиаН/Д5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4
Фемтоtips Наконечники микрозагрузчикаEppendorf930001007
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (премиум тепло инактивированная)Atlanta BiologicalsS11150H
ImageJfijin/a https://imagej.net/Fiji
Dulbecco's MediumSTEMCELL Technologies36150
Large Particle (LP) UnionBiometricaN/AАвтоматизированный пробоотборник http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
МетотрексатSigma-AldrichA6770-10MG
Минеральное маслоFisher ScientificBP26291
фосфатный буферный физиологический раствор (1x)Caisson labsPBL06-6X500ML
Stage Micrometer (400-ступенчатый)Hausser Scientific400-S
Tricaine-SPentair AquaticTRS1
Trypan BlueThermo FisherT10282
VAST BioimagerUnion Biometrican / Флуоресцентный микроскоп https://www.unionbio.com/vast/
Vincristine SulfateEnzo Life SciencesBML-T117-0005
Vybrant DiI StainThermo FisherV22885
Модифицированный пробоотборник

Ссылки

  1. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
  2. Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
  3. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
  4. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
  5. Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
  6. Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281(2012).
  7. Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
  8. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
  9. Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
  10. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
  11. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  12. Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
  13. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  14. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  15. Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
  16. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  17. Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
  18. Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  19. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Ксенографт на Zebrafishфлуоресцентная микроскопияавтоматизированная визуализацияколичественное определение площади опухолиприживление раковых клетоканализ ответа на препаратпротокол микроинъекцийвысокопроизводительный скрининг
Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.