Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ретровирусная переэкспрессия CXCR4 на клетках Murine B-1a и приемная передача для целевой миграции клеток B-1a к костному мозгу и производству IgM

4.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61003

⸱

31 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод ретровирусной переэкспрессии и приемной передачи клеток murine B-1a для изучения миграции и локализации клеток vivo B-1a. Этот протокол может быть расширен для различных вниз по течению функциональных анализов, включая количественную оценку донорской B-1a локализации клеток или анализ донорских клеток, полученных секретных факторов после принятия передачи.

Аннотация

Поскольку функция клеток зависит от нишевых факторов в клеточной микросреде, методы вскрытия локализации клеток и миграции могут обеспечить дальнейшее понимание функции клеток. Клетки B-1a являются уникальным подмножеством В-клеток у мышей, которые производят защитные природные антитела IgM против окислительных эпитопов, которые возникают во время здоровья и болезней. B-1a ячейки IgM производства отличается в зависимости от B-1a расположение клеток, и поэтому она становится полезной с терапевтической точки зрения целевой B-1a локализации ниш, поддерживающих высокий выработку антител. Здесь мы описываем метод целевой b-1a миграции клеток в костный мозг ретровирусно-опосредованной переэкспрессии C-X-C мотив хемокин рецептор 4 (CXCR4). Индукция гена в первичных клетках murine B может быть сложной задачей и, как правило, дает низкую эффективность трансфекции 10-20% в зависимости от техники. Здесь мы демонстрируем, что ретровирная трансдукция первичных клеток murine B-1a приводит к 30-40% эффективности трансдукции. Этот метод использует приемную передачу клеток трансиндуцированных клеток B-1a в в клетки-дефицитных мышей-реципиента, так что донор B-1a клеточной миграции и локализации могут быть визуализированы. Этот протокол может быть изменен для других ретровирусных конструкций и может быть использован в различных функциональных анализах после приемной передачи, включая анализ фенотипа и функции клеток-доноров, или анализ растворимых факторов, выделяемых после переноса клеток B-1a. Использование различных доноров и мышей-реципиентов, дифференцированных по аллотипу CD45.1 и CD45.2, а также наличие репортера GFP в ретровирусной плазмиде может также способствовать обнаружению донорских клеток в других, иммунодостаточном мышах, содержащих эндогенные популяции клеток B.

Введение

Недавние исследования продемонстрировали значительную иммунную клетку, и в частности В-клетки, фенотипические и функциональные неоднородности в зависимости от локализации клеток1,2,,3,,4,5. Клетки B-1a являются одной из таких популяций с неоднородной способностью производить защитные антитела IgM; клетки костного мозга B-1a выделяют IgM constitutively и вносят значительный вклад в плазмеigTters9,6,в то время как перитонеальные клетки B-1a имеют низкоуровневую секрецию IgM при гомеостазе и7вместо этого могут быть активированы через врожденный платный рецептор (TLR) или цитокин-опосредованное сигнализацию для быстрого пролиферирования, мигрировать, и выделять 70,890, B-1a клетки IgM антитела признают окисления конкретных эпитопов (OSE), которые присутствуют на патогенных микроорганизмов, апоптотические клетки, и окисленных ЛПНП, и IgM связывания с OSE может предотвратить воспалительные вниз по течению сигнализации при таких заболеваниях, как атеросклероз11. Таким образом, стратегии по увеличению производства IgM за счет увеличения миграции клеток Перитонеала B-1a к местам, как костный мозг может быть терапевтически полезным. Тем не менее, важно, чтобы такие стратегии были целенаправленными и клеточными, так как внецелевые эффекты могут негативно сказаться на иммунной функции или здоровье.

Здесь мы описываем метод целевого и долгосрочного перевыражения CXCR4 в первичных клетках murine B-1a и последующую приемную передачу для визуализации миграции клеток и функционального производства антител IgM (Рисунок 1). Генетическое манипулирование первичными В-клетками ограничено низкой трансфекционной эффективностью по сравнению с трансфекцией преобразованных клеточных линий. Однако, как преобразованные клеточные линии могут значительно отклоняться от первичных клеток12,13, использование первичных клеток, вероятно, обеспечит результаты, которые более тесно выровнять нормальной физиологии. Несколько методов были описаны для передачи генов в первичных клеток murine B, в том числе ретровирусной трансдукции, аденовирусной трансдукции, липофектации, или электропорации на основе трансфекции, которые имеют различные уровни эффективности, трансиенции и воздействия на здоровье клеток13,14,15. Следующий метод использовал ретровиральные трансдукции, как это дало адекватную эффективность передачи генов в размере 30%, в то время как минимально влияющих жизнеспособности клеток. CXCR4-выражения ретровирус был создан с помощью ранее описанной ретровирусной конструкции муриновых стволовых клеток вируса-внутреннего рибосомного входа сайта-зеленый флуоресцентный белок (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, в котором ген мыши CXCR4 был субклонирован4. MigR1 (контроль (Ctl)-GFP) и ретровирусные частицы CXCR4-GFP были созданы с использованием трансфекции фосфатов кальция, как описано в ранее опубликованных протоколах4,14.

Успешно трансиндуцированные клетки B-1a затем внутривенно передавались в лимфоциты-дефицитные Rag1-/- мышей. И донорские, и реципиентные мыши дополнительно содержали нокаут гена аполипопротеина E (ApoE), что приводит к увеличению накопления OSE и атеросклерозу, обеспечивая тем самым модель для активации клеток in vivo B-1 и производства IgM. Кроме того, донорские и реципиентные мыши отличались аллотипом CD45; донорские клетки B-1 пришли из CD45.1 "ApoE-/- мышей и были переведены в Rag1-/- CD45.2" ApoE-/- реципиентов. Это позволило дифференциацию донора CD45.1 от реципиента CD45.2 B клеток после передачи без необходимости дополнительно пятно для Маркеров В клеток во время анализа цитометрии потока. Полученные здесь результаты показывают, что целевая переэкспрессия CXCR4 на клетках B-1a ассоциируется с повышенной способностью клеток B-1a мигрировать в костный мозг, который ассоциируется с повышенной плазменной анти-OSE IgM. Мы дополнительно предоставляем метод для обогащения перитонеальных в-1 клеток через отрицательный отбор и демонстрируем необходимость активации клеток B-1 для эффективной трансдукции. Этот метод может быть адаптирован для других ретровирусных конструкций для изучения влияния переэкспрессии белка на миграцию клеток B-1a, фенотип, или функции. Кроме того, использование CD45.1 против CD45.2 аллотип различия теоретически может позволить переход в другие иммунологические модели, содержащие эндогенные В-клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию в Университете Вирджинии.

1. Магнитное разделение и обогащение перитонеальных вок B-1

  1. Эвтаназия 12-14-недельный, мужчина, CD45.1-ApoE-/- мышь с использованием CO2.
  2. Сделайте поверхностный разрез в животе с помощью прямых хирургических ножниц и очистить кожу назад с помощью изогнутых ножниц, чтобы разоблачить брюшной стенки. Флеш перитонеальной полости с 10 мл 37 КК RPMI-1640 среды с использованием 10 мл шприца и 25 G иглы. Встряхните мышь, чтобы отойти от клеток, схватив хвост и перемещая мышь из стороны в сторону тщательно в течение 15–20 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Массаж лавагской перитонеума также может максимизировать восстановление клеток.
  3. Соберите перитонеальной жидкости с помощью шприца 10 мл и 25 G иглы, рисуя жидкость в нижней правой части перитонеума чуть выше уровня бедра, возле кишечника. Избегайте нарушения эпидидальных жировых отложений и основных органов. Избегайте рисования жидкости с левой стороны мыши, как оментальный жир может быть легко втянутв в шприц.
  4. После того, как будет собрано жидкости в размере 6,7 мл, выделите в коническую трубку 50 мл, размещенную на льду. Далее, поднимите мышь вертикально, удерживая стенку перитонеальной над диафрагмой с помощью щипц, так что любая оставшаяся жидкость остается в нижней части полости перитонеальной. Сделайте небольшой разрез в стенке перитонеальной с помощью хирургических ножниц над печенью (убедитесь, что не сократить печень) и собирать все оставшиеся перитонеальной жидкости с помощью стеклянной трубки и луковицы.
  5. Бассейн перитонеальных клеток вымывания из всех CD45.1-ApoE-/- мышей (n - 15-20) в 50 мл конических труб, и хранить на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета необходимого количества мышей: клетки B-1a составляют 5–10% от общей популяции перитонеальной и дают примерно 2,5 х 55 В-1а на мышь в руках авторов. Эффективность трансдукции составляет 30–40%, как показано ниже.
  6. Подсчитайте живые клетки, используя краситель жизнеспособности, такие как трипан синий и гемоцитометр (разбавляйте образцы 1:5 в трипан-голубом и загружайте 10 л в гемоцитометрическую камеру). Ячейки пула на уровне до 1 х 108 ячеек на трубку. Центрифуги клетки на 400 х г в течение 5 мин при 4 КС, затем аспирсупернат.
  7. Resuspend до 1 х 108 клеток в 1 мл анти-CD16/CD32 антитела (Таблица материалов) разбавленной 1:50 в буфере ассе (1x фосфат буферного сосудистого раствора (PBS), 0,5% бычьей сыворотки альбумина "BSA", 2 мМ EDTA) для того, чтобы блокировать FC рецепторов. Масштабирование по мере необходимости на основе количества клеток. Инкубировать на льду в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию.
  8. Подготовьте 2x мастер смесь биотиниляционных антител (Таблица 1) в буфере ассеа для истощения. 2x мастер смеси приходится на объем жидкости клетки уже в при инкубации с анти-CD16/CD32. Например, если клетки инкубируют в 500 qL разбавленных анти-CD16/CD32, то добавьте 500 qL 2x мастер-микс, содержащий 10 зл биотинилатированных Ter119, Gr-1, CD23 и NK1.1 антител, и 25 мл биотиниты F4/80 антитела для достижения конечной концентрации в таблице 1. Добавьте 2x мастер-микс к клеткам и пятно в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия.
  9. Вымойте клетки с 5 мл буфера асссеии и центрифуги при 400 х г в течение 5 мин при 4 КС и аспирато супернатанта.
  10. Resuspend и инкубировать клетки с анти-биотина microbeads (Таблица материалов) разбавленной в анализ буфера в соответствии с концентрацией и протоколом, рекомендованных производителем.
  11. Вымойте 5 мл буфера асссеии и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирировать супернатант и resuspend до 1 х 108 ячеек в 500 злибуфера.
  12. Основные столбцы магнитного отбора(Таблица материалов) с 3 мл буфера асссе. Перенесите клетки на загрунтованные столбцы магнитного отбора и соберите eluent, содержащий обогащенные клетки B-1 в конической трубке 15 мл на льду. Вымойте столбец магнитного выбора дополнительным буфером ассеа до общего объема, собранного в 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвот предварительно очищенных и пост-очищенных клеточных фракций должен быть отдельно проанализирован цитометрией потока для эффективности очистки путем окрашивания для CD19 "B-клеток, макрофагов F480" и Т-клеток CD5, как показано на рисунке 2.
  13. Подсчитайте посточищенную клеточную фракцию (элуент, содержащую обогащенные клетки B-1), отсчитав живые клетки как в шаге 1.6, и повторно на 1 х 106 клеток / мл в Среде культуры B (RPMI-1640, 10% тепло-инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода ,FBS), 10 мМ HEPES, 1x несущественных аминокислот, 1 мМ пируват натрия, 50 мкг/мл благотворный gentamicin, 55 мкм-меркаптоол.

2. Перитонеальная стимуляция клеток B-1

  1. Сплит объединенные ячейки для двух трансиндуцированных условий (Ctl-GFP и CXCR4-GFP), откладывая и накрывая по крайней мере 10 х 106 ячеек для нетрансдуцированного контроля.
  2. Плита до 150 кл (150 000 клеток) на скважину в 96-хорошо круглых нижних пластин.
  3. Добавьте 100 нМ TLR9 агонист ODN1668 во все скважины, чтобы стимулировать пролиферацию клеток.
  4. Инкубировать для 16-18 ч при 37 градусах По Цельсия, 5% CO2.

3. Ретровиральная трансдукция перитонеальных в клеток В

  1. Генерировать Ctl-GFP (MigR1) и CXCR4-GFP ретровирусных частиц с использованием трансфекции фосфатов кальция, как описано в ранее опубликованных протоколах14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет несколько дней, так что подготовить и титр ретровирусных запасов и хранить aliquots на -80 градусов по Цельсию до начала этого протокола.
  2. Оттепель ретровирусных запасов на льду. Используйте немедленно и не повторно замораживать, как вирус титр значительно уменьшается во время замораживания оттепели циклов. Добавьте ретровирусные супернацианты Ctl-GFP или CXCR4-GFP при множественности инфекции (МВД) в клетки, при наличии 8 мкг/мл полибрена и свежего й-меркаптоэтанола при конечной концентрации 55 мкм. Не добавляйте вирусные запасы в клетки, отведенные для нетрансиндуированного контроля.
  3. Выполните спинфекцию центрифугиваемыми пластинами при температуре 800 х г в течение 90 мин при комнатной температуре.
  4. Инкубировать пластины с ретровирусом при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за дополнительные 3 ч.
  5. Урожай и replate клетки в свежей среде ячейки B и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 ночь.

4. Сортировка клеток трансиндуцированных перитонеальных клеток B-1a

  1. Урожай культивированных ячеек и бассейн в три отдельных 50 мл конических труб для каждого состояния: не-трансиндуцированных, Ctl-GFP трансумции, и CXCR4-GFP транс-.
  2. Подсчитайте живые клетки, как в шаге 1.6, затем центрифуга на 400 х г в течение 5 мин при 4 КС и аспиративной супернатант.
  3. Resuspend клетки на 100000 клеток / Л в сортировать буфер (PBS 1% BSA), содержащий 1:50 анти-CD16/CD32 антитела (Таблица материалов) для того, чтобы блокировать fc рецепторов. Инкубировать на льду в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию.
  4. Аликвотные ячейки для контроля за компенсацией (30 000 ячеек на компенсационный контроль): для неокрашенных и однозначных средств контроля пятен aliquot из нетрансиндуированного образца и для однократного аликота контроля пятен GFP из трансиндуцированных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные бусинки компенсации могут быть альтернативно использованы для одного контроля пятна, если не-трансумированный номер ячейки является низким.
  5. Подготовка 2x антитела мастер смесь, содержащая фторофора конъюгированных антител в сортировать буфер (Таблица 1). Добавьте 2x мастер-микс в нетрансдукторы, CTL-GFP трансиндуцированные и CXCR4-GFP трансиндуцированные образцы. Добавьте индивидуальные антитела к одному контролю пятна. Инкубировать в течение 20 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2x мастер смесь приходится на объем жидкости клетки уже в при инкубации с анти-CD16/CD32, как и в шаге 1.8. Аликвот клеток от каждого состояния может быть отдельно окрашены для CXCR4 для подтверждения cXCR4 переэкспрессии.
  6. Промойте образцы с 1 мл сортировки буфера и процедить через 70 мкм фильтры в полипропиленовых труб.
  7. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию и аспирато супернатант. Повторное увеличение образцов на уровне 50 000 ячеек/ЗЛ в сортировать буфер.
  8. Перед сортировкой клеток подготовьте помеченные флуоресценцией активированные клеточные сортировки (FACS) коллекторские трубки, содержащие 1 мл собираемого среднего (RPMI-1640, 20% теплоинактивированный FBS, 10 мМ HEPES, 1x несущественные аминокислоты, 1 мМ пируват натрия, 50 мкг/мл гентамицин, 55 мкм-меркаптоэтанол) для каждой популяции, которая должна быть отсортирована.
  9. Перед запуском образцов на сортаторе ячейки добавьте 2x DAPI (подготовлен как 1:5000 разбавления в буфере сортировки) для дискриминации мертвых ячеек.
  10. Сортировать gFP B-1a клетки в FACS трубки, содержащие сбор среды, как DAPI- CD19- GFP- B220середине ло CD23- IgMи CD5- клетки из CTL-GFP и CXCR4-GFP образцов. Используйте нетрансиндуцированный образец, чтобы установить ворота GFP и сортировать DAPI- CD19и GFP- B220mid-lo CD23- IgMи CD5- нетрансиндуцированные клетки B-1a.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, нетрансиндуцированные клетки также могут быть отсортированы из образцов CTL-GFP и CXCR4-GFP путем раздельного gating B-1a клеток в GFP-фракции. Трансиндуцированные или нетрансиндуцированные B-1b-клетки также могут быть отсортированы с помощью этой сортировоженной стратегии в виде DAPI- CD19и GFP,/- B220mid-lo CD23- IgMи CD5- клетки.

5. Приемная передача

  1. После сортировки клеток, центрифуги клетки на 400 х г в течение 5 минут при 4 кв и аспирировать супернатант тщательно.
  2. Resuspend клетки в холодной стерильной 1x PBS на 1000 клеток / ЛЛ.
  3. Анестезия мужской Rag1-/- ApoE-/- мышей с использованием изофларан и вводить 100 Л (100 000 клеток) на мышь с помощью внутривенных ретро-орбитальных или хвостовых инъекций вен с помощью сверхтонкого инсулинового шприца. Введите несколько мышей с 1x PBS в качестве контроля.

6. Количественная оценка донорских клеток и плазмы IgM

  1. В нужное время после приемной передачи, анализ переданных клеток у мышей-реципиента по костному мозгу и селезенке ткани урожая4 и потока цитометрии. Количественная локализация донорских клеток и переэкспрессия CXCR4 путем окрашивания CD45.1, CD45.2 и CXCR4 и анализа результатов цитометрии потока с помощью программного обеспечения, такого как Flowjo.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для антител, используемых в этом шаге. Убедитесь, что не использовать конъюгированные антитела, которые флуоресцирует в канале FITC, как GFP будет присутствовать на трансиндуцированных донорских клеток.
  2. Изолировать плазму, добавляя 10 л 0,5 М ЭДТА к всей крови, собранной через сердечный прокол во время жертвоприношения животных. Центрифуга цельной крови на 7000 х г и аликвот плазмы в отдельных 1,5 мл центрифуговых труб. Хранить при -80 градусов до выполнения анализа секретных факторов, таких как IgM от ELISA4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обзор протокола приведен на рисунке 1. Рисунок 2 отображает обогащение перитонеальных клеток B-1a после магнитного истощения других типов перитонеальных клеток. В долях синглетных ячеек после истощения доля клеток CD19'b+ больше, чем у макрофагов F4/80, отсутствие CD5hi CD19- Т-клеток, и содержится повышенная частота CD19и CD5в середине B-1a-клеток по сравнению с фракцией предварительного истощения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предоставляемый здесь метод обеспечивает стабильную и относительно эффективную доставку первичного гена клеток B-1a, приемную передачу vivo, идентификацию и локализацию инъекционных клеток. Клетки были в состоянии быть обнаружены 17 недель после клеточного перевода и сохранили повышенное выражение CXCR4. Ретровирусо-опосредованные поставки дали 30-40% трансдукционной эффективности первичных клеток murine B-1a с минимальным воздействием на жизнеспособность клеток в наших руках (Рисунок 4e). Э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Проект 3 P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) и R01GM100776 (Т.П. Бендер). A. Upadhye была поддержана Американской ассоциацией сердца Предварительная докторская стипендия 16PRE30300002 и 5T32AI007496-20. Мы благодарим Джоан Ланниган, Майка Солгу и Клода Чу из Университета Вирджинии Flow Cytometry Core за отличную техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
70 микронные фильтрующие колпачкиFalcon352235
антибиотиновые микрошарикиMiltenyi Biotec130-090-485
анти-CD16/CD32, или блок Fc LifeTechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Клон: RA3-6B2
Бета-меркаптоэтанолGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Клон: eBio1D3
CD23 биотинeBioscience13-0232-81Клон: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Клон: B3B4
CD3e биотинeBioscience13-0033-85Клон: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- мышин/дВыведены в доме
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Клон: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Клон: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- мышин/дВыведены в доме
CD5 PEeBioscience12-0051-83Клон: 53-7.3
Ctl-GFP ретровирусН/ДН/ДСгенерирован внутри компании с использованием GFP-экспрессирующего ретровирусного id MigR1, предоставленного доктором Т.. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Клон: 2B11
CXCR4-GFP ретровирусН/ДН/ДПолучен внутри компании путем клонирования мыши CXCR4 в MigR1 ретровирусная плазмида
F4/80 биотинLife TechnologiesMF48015Клон: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.Требуется
GentamicinGibco15710-064
Gr-1 биотинeBioscience13-5931-82Клон: RB6-8C5
термоинактивированная фетальная бычья сывороткаGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Клон: R6-60.2
Инсулиновые шприцыBD Biosciences329461
изофлуранаHenry Schein Animal Health029405
Live/Dead YellowLife TechnologiesL34968
LS колонкиMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 биотинBD Biosciences553163клон: PK136
Заменимые аминокислотыGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
Пируват натрияGibco11360-070
Ter119 биотинeBioscience13-5921-82Клон: Ter119
лицензия

Ссылки

  1. Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).
  2. Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
  3. Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
  4. Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083(2015).
  6. Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
  7. Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
  8. Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
  9. Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
  10. Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
  11. Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
  14. Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
  15. Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).
  16. DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
  17. Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
  18. Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
  19. Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
  20. Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
  21. Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
  22. Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экспрессия CXCR4адоптивный перенос клетоклокализация в костном мозгезабор перитонеальной жидкостимагнитная сортировка клетокстимуляция агонистом TLR9определение аллотипа CD45
Ретровирусная переэкспрессия CXCR4 на клетках Murine B-1a и приемная передача для целевой миграции клеток B-1a к костному мозгу и производству IgM
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.