Методическая статья

Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

DOI:

10.3791/61005

⸱

7 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Anthropology, Indiana University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы оптимизировали коммерчески доступные рецепторы эстрогена β анализа для скрининга человеческих и нечеловеческих продуктов приматов для эстрогенной активности. Мы подтвердили этот анализ, показав, что известные эстрогенные человеческие пищевые сои регистрирует высокий, в то время как другие продукты не показывают никакой активности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения являются источником пищи для многих животных, и они могут производить тысячи химических веществ. Некоторые из этих соединений влияют на физиологические процессы у позвоночных, которые потребляют их, такие как эндокринная функция. Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические вещества, непосредственно взаимодействуют с гипоталамо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокринной системы. Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует клетки млекопитающих, разработанные для высокого экспресс-бета рецептора эстрогена (ER) и которые были трансфицированы геном люциферазы. Воздействие соединений с эстрогенной активностью приводит к клеткам, производящим свет. Этот анализ является надежным и простым способом проверки на биологическую эстрогенную активность. Он имеет несколько улучшений по сравнению с переходными анализа трансфекции, прежде всего, простота использования, стабильность клеток, и чувствительность анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения являются необходимым источником пищи для многих животных, обеспечивая калории и питательные вещества, критически важные для выживания, воспроизводства, роста, развития иповедения 1. Растения производят тысячи химических веществ, многие из которых являются адаптацией для собственного роста, стоматического обслуживания и воспроизводства. Другие соединения, считающихся вторичными метаболитами растений (PSMs), имеют функции, которые менее ясны, хотя некоторые из них токсичны и, вероятно, используются в качестве защиты от травоядного и тунеядства (например, алкалоиды, танины)2,3. Некоторые из этих химических веществ имеют возможность влиять на долгосрочные физиологические процессы у животных, такие как эндокринное функционирование, хотя почему эти эндокринно-активные фитохимические вещества взаимодействуют с эндокринной системой позвоночныхдо сих пор неясно 2,4.

Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические, являются полифенольными ПМС, которые структурно и функционально имитируют эстрогены, непосредственно взаимодействуя с гипоталомо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокриннойсистемы 5. Прием фитоэстрогенов в рационе человека связан с защитой от некоторых видов рака, сердечных заболеваний и симптомов менопаузы, хотя другие эффекты включают проблемы фертильности. В самом деле, физиологические эффекты этих соединений были обнаружены в 1940-х годов, когда бесплодие у овец было связано с их выпаса на фитоэстроген богатых клевера (Trifolium subterrareum)6. При приеме внутрь, фитоэстрогены могут передаваться в клетки и имитировать эффекты эстрогена. Хотя фитоэстрогены негативно сказались на плодовитости овец, взаимосвязь между фитоэстрогенами и физиологией не проста. Как и овцы, южный белый носорог проявляет чувствительность к эстрогенным соединениям в кормах, полученных из большого количества сои и люцерны. Дочери женщин кормили эту диету во время беременности, менее вероятно, воспроизвести7. Тем не менее, другие исследования показали, что фитоэстрогены могут иметь положительный эффект, а также, в том числе созревание фолликуловяичников у пожилых мышей 8, профилактика некоторых видов рака, антиоксидантной активности и антипролиферативныхэффектов 9.

Широта воздействия фитоэстрогенов не удивительно, учитывая, что эстрогены влияют на широкий спектр биологических функций, в том числе роста, развития и регулирования репродуктивной и центральнойнервной систем 10. Хотя Есть много механизмов действия, фитоэстрогены часто имеют возможность изменять, повысить, или нарушить эстроген сигнализации через их способность выступать в качестве лигандов для внутриядерных рецепторов эстрогена альфа и бета (ER и ER). Многие фитоэстрогены имеют фенольные структуры кольца похож на эстрогены, что позволяет им связывать рецепторы эстрогена. Те, с агонистической эстрогенной функции активности, как эстроген, образуя активированный ER-лиганд комплекс, который может затемнить и связываться с эстрогеном ответ элемент (ERE) и вызватьтранскрипцию гена 11. Таким образом, эстрогены и фитоэстрогены регулируют активность клеток и функции системы через их действия в качестве транскрипционных факторов.

Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует китайский хомяк яичников CHO клетки инженерии высоко выразить ER, которые были трансфицированы с светлячок (Photinus pyralis) luciferase ген, связанный спромоутером ERE 12. Когда эстрогенные соединения присутствуют, они связываются с ER, затемняют, и связываются с ERE, что приводит к транскрипции гена люциферазы. При добавлении раствора субстрата люцифераза катализует реакцию, ведущую к фотону. Таким образом, положительные образцы производят легкие и отрицательные образцы нет.

Этот коммерчески доступный анализ устраняет необходимость для лабораторий, чтобы трансфект клеток млекопитающих с геном репортераи рецептором эстрогена 13,14, который был нестабильным и переменной по эффективности. Анализ обеспечивает стабильную платформу трансфекции, которая позволяет быстро и просто определить, имеет ли растение эстрогенную активность через связывание рецепторов.

Мы тестируем гипотезу о том, что соевые бобы имеют более высокую эстрогенную активность, чем все другие продукты, учитывая их известные концентрации эстрогенных изофлавонов15 с использованием человеческих продуктов из местных бакалейных лавок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка растительных материалов

  1. Заморозить сухие растительные продукты, которые были собраны свежими с помощью лиофилизера.
    1. Для защиты образцов от света накройте камеры алюминиевой фольгой во время процесса сушки.
    2. Чтобы убедиться, что образцы полностью сухие, лиофилизировать, пока камеры больше не чувствовать себя холодно на ощупь и растительные материалы больше не теряют массу при взвешивании.
    3. Храните сушеные растения в стерильных мешках с низким содержанием остатков при отсутствии света до измельчения.
  2. Мелко измельчить образцы с помощью шлифовальной мельницы с 0,85 мм сетчатым экраном.
    1. Храните образцы грунта в мешках при отсутствии света до извлечения.

2. Добыча вторичных метаболитов растений

  1. Для извлечения вторичных метаболитов растений используйте соотношение 1 г сушеного образца к 10 мл метанола класса HPLC.
    1. Взвесь образец на аналитическом балансе и добавьте его в колбу Erlenmeyer надлежащего размера (125 - 250 мл). Затем добавьте соответствующий объем метанола. Запись массы извлеченного образца.
    2. Обложка растительно-метанол раствор алюминиевой фольгой, а затем установить для поворота на 100 об / мин скорость при комнатной температуре (RT) в течение 3 дней на орбитальной шейкер, что позволяет потенциально эстрогенных соединений растворяться в метанол.
    3. Врезать супернатант в систему капельной фильтрации с помощью фильтровальной бумаги (125 мм).
    4. Используя роторный испаритель, высушите растительный экстракт до тех пор, пока образец не загустеет, но не зальется, в колбу с круглым дном 300 мл. Налейте образец в 50 мл круглого дна колбы, полоскания большой колбы с небольшим количеством метанола. Продолжайте сушить образец в небольшой колбе, пока метанол полностью не испарится.
    5. Взвешивание остатков выборки с использованием аналитического баланса. Запись остатков массы.
    6. Растворите растительный экстракт в диметилсуфсиде (ДМСО) при концентрации 0,1 г экстракта до 2 мл ДМСО. Вихрь до однородной массы.
    7. Храните растительный экстракт-DMSO раствор при 4 градусов по Цельсию в янтарных стеклянных флаконах до анализа.

ВНИМАНИЕ: Растения могут производить неизвестные биологически активные химические вещества, и DMSO является транспортным средством, которое может транспортировать их через клеточные мембраны. Используйте соответствующее средства индивидуальной защиты и ухода при обработке этих образцов.

3. Рецептор эстрогена человека β трансфекции анализ12

ПРИМЕЧАНИЕ: Асептическая техника и ламинарный капюшон потока требуется для первого дня протокола анализа.

  1. Подготовка разбавления 17 -эстрадиола для стандартной кривой.
    1. Передача среднего и соединения клетки скрининга среднего (CSM) из морозильной камеры хранения и оттепели в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
    2. Этикетка микроцентрифуг трубки промежуточные 1 и 2 (INT1, INT2) и 1-8.
    3. Заполните INT1 995 МКЛ CSM, INT2 с 615 МКЛ CSM, трубка 1 с 900 МКЛ CSM, и трубки 2-8 с 600 МКЛ CSM. Установите трубку 8 в сторону.
    4. Передача 5 МКЛ из 100 МКМ 17 "-Эстрадиол фонда в INT1. Откажитесь от наконечника. Вихрь.
    5. Перед каждой передачей, промыть пипетку 3 раза, а затем передать 10 МКЛ из INT1 в INT2. Откажитесь от наконечника.
    6. Промыть пипетку 3 раза, а затем передать 100 мкл из INT2 в трубку 1. Откажитесь от чаевых. Перенесите 300 МКЛ из трубки 1 в трубку 2. Повторите для трубок от 3 до 7. Отбросьте 300 мкл из трубки 7 в контейнер для отходов. Трубка 8 является нулевой и не получает эстрадиола. Окончательные концентрации постриговых стандартов: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 и 0 pM эстрадиола.
  2. Подготовка образцов соединений.
    1. Образцы вортекса.
    2. Возьмите 4 МКЛ каждого образца растения в DMSO и добавьте к 496 МКЛ CSM, чтобы дать 0,8% раствор DMSO.
  3. Быстро оттепель Репортер клетки.
    1. Извлекит трубку cell Recovery Medium из водяной ванны с 37 градусами Цельсия. Дезинфекция внешней поверхности с использованием 70% этанола.
    2. Извлеките клетки репортеров из хранилища и оттепели от -80 градусов по Цельсию, передав 10 мл предварительно разогретого CRM в трубку замороженных клеток.
    3. Закройте трубку клетки репортера и перенесите на водяную баню при 37 градусов по Цельсию на 5-10 минут.
    4. Извлеки трубку подвески клетки репортера от ванны воды. Переверните трубку клеток несколько раз осторожно, чтобы разбить агрегаты клеток и произвести однородную подвеску. Очистите поверхность трубки 70% этанолом.
  4. Оссай покрытие
    1. Выпределите 100 йл подвески ячейки Reporter в каждую колодец с помощью многоканальной пипетки.
    2. Распределение 100 МКЛ образцов в три раза в соответствующие скважины анализа.
    3. Перенесите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию, увлажненные 5% CO2 инкубатор для 22-24 ч.
  5. Оттепель Обнаружения субстрата и обнаружения буфера в темном холодильнике на ночь, чтобы подготовиться к 2-й день.
  6. Незадолго до окончания инкубации пластины удалите субстрат обнаружения и буфер обнаружения из холодильника и поместите в зону низкой освещенности до тех пор, пока не будет уравновешена до RT. После того, как на RT, инвертировать каждую трубку осторожно несколько раз, чтобы тщательно перемешать решения.
    1. Непосредственно перед тем, как инкубация завершена, вылейте все содержимое буфера обнаружения в трубку подложки обнаружения для создания реагента обнаружения люциферазы. Смешайте осторожно, чтобы не производить пену.
    2. Как только инкубация завершена, инвертировать пластину, чтобы выбросить содержимое в соответствующий контейнер отходов. Аккуратно коснитесь пластины на чистом абсорбенте бумажном полотенце, чтобы удалить последние капли из колодцев.
    3. Добавьте 100 МКЛ реагента обнаружения люциферазы к каждой хорошо. Разрешить анализ пластины отдохнуть на RT в течение 15 минут. Не встряхивать тарелку.
  7. Количественная оценка люминесценции с помощью 96-ну пластины чтения люминометра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двадцать два экстракта фруктов и овощей, обычно встречающихся в рационе человека, были проверены на наличие эстрогенных соединений. Различные продукты были анализированы, в том числе бобовые, такие как соевые бобы, горох снега, и горох оснастки, как горох семьи является известным источникомфитоэстрогенов 16, а также инжир, финики, кукуруза, морковь, яблоки, бананы, клубника, помидоры, капуста и капуста. Эндокринные разрушающие соединения содержатся в общих веществах (например, пластмассах и пестиц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ репортеров ER, разработанный для индивидуального скрининга фармацевтических агентов, также подходит для скрининга растительных продуктов на фитоэстрогены, биологически активные через ER. Важные соображения в протоколе включают в себя лечение образцов растений с осторожностью: свежий растительный материал должен быть высушен быстро, чтобы предотвратить литье или другие биологические деградации, и она должна быть вдали от света, чтобы предотвратить фотолиз соединений18. Протокол анализа

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны Дейл Лейтман для первоначальной подготовки в использовании переходных анализов трансфекции для определения эстрогенной активности приматов растительных продуктов. Спасибо Брэдфорду Вестричу и К. Эрику Джонсону за помощь в настройке лабораторного оборудования и обучении студентов методам экстракции. Наконец, спасибо Университету Индианы за финансирование этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1000 &микро; L пипетка
20 & микро; L пипетка
200 & микро; L пипетка
37 ° водяная баня
37 °, увлажненная 5% CO2 инкубатор
70% этанол
аналитический баланс
клеточная культура с рейтингом ламинарного потока колпак
диметилсульфоксид
одноразовый таз для фильтрующего материала, стерильная
система
Erlenmeyer колбы125 мл и 250 мл
ВЭЖХ марки метанола
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-луночный формат анализовIndigo BiosciencesIB00411Assay kit - анализирует 24 образца плюс стандартный
кривой лиофилизатор
многоканальный пипетка
орбитальный шейкер
пластинчатый люминометрex. Bioteck Synergy HTX
ротационный испаритель
с круглым дном50 мл и 300 мл
стерильные микроцентрифужные пробирки или стерильные многоканальные медиаванны стерильные
наконечники200 & микро; L и 1000 & микро; L Ватман
1 класс бумажные
вихревые пакетыстерильные полиэтиленовые пакеты
капельной фильтрацииколбы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
  2. Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
  3. DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
  4. Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
  5. Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
  6. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
  7. Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
  8. Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42(2017).
  9. Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
  10. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  11. Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
  12. Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
  13. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
  14. Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
  15. Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
  16. Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
  17. Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
  18. Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
  19. Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
  20. Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
  21. Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
  22. Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
  23. Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Estrogen Receptor BetaCell based AssayLuciferase ReporterPhytoestrogen ScreeningPlant Extract AnalysisEstrogenic Activity DetectionDMSO ExtractionOrbital Shaker Incubation96 Well PlateLuminometer Detection

Похожие статьи