Методическая статья

Цитометрия потока Анализ подмножества иммунных клеток в murine spleen, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани в модели остеоартрита

DOI:

10.3791/61008

⸱

24 апреля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем подробный и воспроизводимый протокол цитометрии потока для выявления моноцитов/макрофагов и Т-клеточных подмножества с использованием как экстра-, так и внутриклеточного окрашивания анализов в муриной селезенке, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани, используя установленную хирургическую модель муринового остеоартрита.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеоартрит (ОА) является одним из наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного мозга, затрагивающих пациентов, страдающих от боли и физических ограничений. Последние данные свидетельствуют о потенциальном воспалительном компоненте заболевания, при этом Т-клетки и моноциты/макрофаги потенциально связаны с патогенезом ОА. Дальнейшие исследования постулировали важную роль подмножений обеих воспалительных клеточных линий, таких как Th1, Th2, Th17 и T-регулятивных лимфоцитов, а также макрофагов M1, M2 и синовиум-тканей-резидентов. Однако взаимодействие между локальной синовиальной и системной воспалительной клеточной реакцией и структурными изменениями в суставе неизвестно. Чтобы полностью понять, как Т-клетки и моноциты / макрофаги способствуют ОА, важно иметь возможность количественно определить эти клетки и их подмножества одновременно в синовиальной ткани, вторичных лимфатических органов и системно (селезенки и костного мозга). В настоящее время различные подмножества воспалительных клеток могут быть определены путем сочетания маркеров клеточной поверхности, что делает цитометрию многоцветного потока мощным методом в расследовании этих клеточных процессов. В этом протоколе мы описываем подробные шаги, касающиеся сбора урожая синовиальной ткани и вторичных лимфатических органов, а также генерации одноклеточных суспензий. Кроме того, мы представляем как внеклеточное окрашивание анализ для выявления моноцитов / макрофагов и их подмножего, а также экстра- и внутриклеточного окрашивания анализ для выявления Т-клеток и их подмножего в мурин селезенки, костного мозга, лимфатических узлов и синовиальной ткани. Каждый шаг этого протокола был оптимизирован и протестирован, в результате чего очень воспроизводимые анализы, которые могут быть использованы для других хирургических и нехирургических моделей ОА мыши.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеоартрит (ОА) является изнурительным и болезненным заболеванием, включающим различные патологии всех тканей, связанных с суставом1. Затрагивающие примерно 3,8% мировогонаселения 2, ОА является одним из наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного мозга и она станет 4-йведущей причиной инвалидности во всем мире к 2020году 3. Посттравматический ОА происходит после травмы сустава и составляет не менее 12% всех ОА и до 25% ОА в восприимчивых суставов, таких какколено 4,5. Кроме того, повреждение суставов увеличивает пожизненный риск ОА более чем в пять раз6. Не все травмы с явно аналогичной нестабильности будет продолжать развиваться ОА, и поэтому определяющие факторы, которые управляют долгосрочной ОА-риск остается сложной задачей. Это имеет решающее значение для того, чтобы разработать эффективные методы лечения для профилактики и / или лечения посттравматического ОА, для расследования и лучше определить травмы конкретных патологии, причины и механизмы, которые предрасполагают кОА 1.

ОА и его определяющее разрушение хряща ранее было полностью связано с механическим стрессом и, таким образом, ОА считалась невоспалительноезаболевание 2. Тем не менее, более поздние исследования показали воспалительное проникновение синовиальных мембран и увеличение воспалительных клеток в синовиальной ткани у пациентов с ОА посравнению со здоровыми контроля 2, проливая свет на воспалительный компонент в качестве потенциальной движущей силы в ОА. Дальнейшие исследования показали, что аномалии как в CD4 "и CD8" Т-клеточный профиль, а также моноцитов / макрофагов врожденной иммунной системы может способствовать патогенеза ОА2,7. Детальные исследования этих аномалий выявили соответствующие роли для различныхподмножей Т-клеток 2,таких как Th18,Th29,Th178 и T нормативных (Treg)популяций 10,11. Несмотря на это убедительные доказательства, причинно-следственная связь между изменением Т-клеток ответы и развитие и прогрессирование ОА до сих пор неизвестно2.

В дополнение к конкретным Т-клеток, имеющих роль в ОА, последние исследования показывают, что дифференцированно поляризованных / активированных макрофагов могут быть связаны с патогенезом ОА12. В частности, макрофаги, происходящие из моноцитов крови, накапливаются в синовии и поляризуются либо в классически активированные макрофаги (М1), либо в альтернативно активированные макрофаги (М2) во время развития ОА, подразумевая корреляцию между моноцитами, полученными макрофагами, иОА 13. В отличие от этого, некоторые подмножества макрофагов населяют органы на ранних стадиях развития и самостоятельно поддерживают их численность в моноците независимойматерии 14. Недавно, совместная защитная функция опосредованная плотно-развязным барьером была показана для этих синовиально-тканевых резидентов макрофагов (STRMs)14. Эти выводы свидетельствуют о том, что аномалии, в частности подмножества макрофагов, могут играть решающую роль при разработке ОА. Однако взаимодействие между этой воспалительной клеточной реакцией и структурными изменениями в суставе после травмы неизвестно.

Исторически анализ иммунных клеток в синовиальной ткани был ограничен иммуногистохимией (IHC) или экспрессией мРНК путем обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR)подходов 15,16. Однако и IHC, и RT-PCR не имеют возможности одновременно идентифицировать несколько различных типов клеток и их подмножего, что ограничивает применимость этих методов. Кроме того, IHC ограничивается анализом небольших образцов тканей и может пропустить очаговых воспалительных накоплений клеток. За последние несколько лет было разработано множество поверхностных маркеров для различных типов клеток, и подмножества иммунных клеток теперь могут быть надежно идентифицированы различными комбинациями этих маркеров. Благодаря устойчивому техническому прогрессу, цитометры потока теперь способны идентифицировать множество различных фторхромов, одновременно позволяющих анализ больших многоцветных панелей антител.

Цитометрия потока предоставляет следователям мощный метод, который позволяет одновременной идентификации и количественной оценки множества иммунных клеток и их подмножества на уровне одной клетки. Мы разработали и оптимизировали как внеклеточный анализ окрашивания для выявления моноцитов/макрофагов и их подмножестей, так и дополнительный/внутриклеточный анализ окрашивания для выявления Т-клеток и их подмножестей в муриной селезенке, костном мозге, лимфатических узлах и синовиальной ткани. Каждый шаг этого протокола был оптимизирован и протестирован в результате чего весьма воспроизводимые анализ, который может быть использован для других хирургических и нехирургических моделейОА мыши 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Северный Сидней Местный район здравоохранения животных комитет по этике одобрил все процедуры, упомянутые в этом протоколе. Мыши размещаются и заботятся в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии Пересмотренный 2010). Для всех экспериментов были использованы 10-12-недельные, самцы мышей C57BL/6.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для индуцирования посттравматического ОА была проведена хирургическая дестабилизация медиального мениска (ДММ) в правом удушаирующем суставе. Подробная информация об этой модели животных была опубликована Glasson et al.18. Короче говоря, общая анестезия индуцируется в индукционной камере с использованием изофлюрана, а затем поддерживается с помощью конуса носа. Хирургическая нога побрился с лезвием бритвы и хирургическое место моет и swabbed с этанолом, чтобы свести к минимуму загрязнение. Затем животное перемещается в операционный микроскоп и помещается на стерильное полотенце и ногу, задрапированную стерильной бумажной драпировкой, чтобы изолировать хирургическое место и свести к минимуму загрязнение. С помощью микроскопа, 0,5 см медиальной пара-пателла артротомия сделана, коленная чашечка luxated боковой, и инфра-пателла жира площадку повышенной подвергать медиальной мениско-тибиальной связки, которая трансектируется с рассечением миппов. Сустав промывается стерильным солевым раствором для удаления крови, а рана закрывается в три слоя - капсулу суставов, подкожные ткани (с использованием шовного материала) и кожу (с использованием хирургического тканевого клея). Однако методы, описанные в этом протоколе, могут применяться к другим моделям и методам индуцирования ОА. ОА может быть индуцирована по обе стороны от животного, и при сборе тканей, важно, чтобы урожай ипсилатеральных (дренажных) лимфатических узлов.

1. Изоляция селезенки, контралатерального костного мозга, ипсилатеральных лимфатических узлов, истощающих удушающие и синовиальные ткани

  1. Усыпляйте мышь путем вывиха шейки матки. Поместите мышь в положение лежа под рассечением микроскопа и протрите грудь, живот и ноги 70% этанола. Тщательно откройте кожу на средней линии по длине живота с помощью прямых ножниц, оставляя брюшную полость нетронутой.
  2. Аккуратно потяните кожу на правой стороне животного от основной мышцы, оставляя подкожной жировой ткани прилагается к коже. Как правило, нежная тяга сама по себе будет отделять кожу и лежащие в основе жировой ткани от мышц. Спорадические присоединения должны быть прорезать с мелкими ножницами для того, чтобы сохранить напряжение, необходимое для раздвечивания тканей до минимума и уменьшить вероятность нанесения вреда лимфатических узлов. Определите пересечение трех сосудов, осторожно дразня жировой ткани, расположенной на бедре с помощью двух изогнутых тонких типсов. Паховой лимфатический узел расположен на пересечении и может быть идентифицирован по форме овоида и немного более темному цвету.
  3. Удалите паховой лимфатический узел с помощью тонкого рассечения типсов. Будьте осторожны, чтобы не разорвать капсулу. Удалите оставшийся жир на поверхности лимфатического узла с помощью типсов.
  4. Откройте брюшную полость и определите селезенку. Вырежьте селезенку мелкими ножницами. Аккуратно потяните кишечник в сторону, чтобы разоблачить аорту и ее бифуркацию, будьте осторожны, чтобы не навредить им, чтобы свести к минимуму риск заражения. Подвздошный лимфатический узел расположен в терминальной части брюшной аорты и происхождения общей подвздошной артерии. Удалите правый подвздошный лимфатический узел и продолжить, как описано в 1.3.
  5. Аккуратно удалите кожу обеих задних конечностей. Рассеките левую бедренную кость, очистив ее от мышечной ткани с помощью лезвия и тонких ножниц. Аккуратно отключите как удушающих, так и тазобедренных суставов, оставив всю кость нетронутой и удалите бедренную кость.
  6. Определите сухожилие коленной чашечки правого удушающий сустав, а затем удалить прилегающих мышечной ткани проксимальной к этому с помощью тонких ножниц, пока примерно 5 мм четырехглавой сухожилия проксимальной коленной чашечки подвергается. После этого, прорезать четырехглавое сухожилие примерно 3-4 мм проксимальной для коленной чашечки, чтобы сформировать ручку и с помощью тонкой типсов осторожно вытащить его из сустава. Это сделает края совместной капсулы крепления к бедренной кости видимым, и с помощью скальпеля лезвие тщательно вырезать по краям совместной капсулы с обеих сторон, начиная с бедренной кости собирается к голени, с тем чтобы максимизировать количество синовиальной мембраны, которая собирается. При резке важно поддерживать нежную тягу на четырехглавом сухожилии и паузу, когда синовиальный блок ткани крепится только к голени. На этом этапе внутрисударный жир площадку в настоящее время хорошо видны дистал для коленной чашечки и может быть мягко отделены от сустава и передней аспект мениши с помощью лезвия. После этого, вырезать вдоль оставшейся части суставной капсулы (трибиальная часть), чтобы удалить синовиальной ткани блока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть сделан очень точно, чтобы обеспечить надежные результаты. После завершения вскрытия, "синовиальный блок ткани" должен состоять из коленной чашечки, сухожилия коленной чашечки, инфрапателлар жира площадку, над- и инфрапателлар рецессии синовиальной подкладке и связанных с ними совместных капсул передней к коллатеральных связок. Держите все ткани влажными во время вскрытия, используя 0,9% солевого раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите каждый образец блока синовиальной ткани в отдельный колодец с маркировкой 24-хорошо пластины, содержащей 1,5 мл RPMI 1640 среды. Объедините и подвздошный и паховой лимфатический узел в один колодец, и ткани бассейна из двух мышей.

2. Поколение одноклеточных суспензий из каждой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы обеспечить достаточное количество клеток для анализа потока синовиальных тканей от двух мышей должны быть объединились. В текущем протоколе, объединить все ткани из тех же двух мышей для того, чтобы поддерживать аналогию. Кроме того, подвих и паховые лимфатические узлы были объединены для каждого животного в результате чего в общей сложности 4 лимфатических узлов для каждого образца. В целом, количество клеток в селезенке, костном мозге и лимфатических узлах одного животного достаточно для проведения анализа потока и протокол может быть применен. Однако, при использовании тканей только из одного животного lysing раз, возможно, потребуется настроить.

  1. Селезенка
    1. Поместите две объединились селезенки на 70 мкм клетки ситечко на вершине 15 мл трубки. Аккуратно macerate селезенки через фильтр сетки с помощью стерильных 3 мл шприц поршень. Флеш ситечко часто в общей сложности 6 мл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS.
    2. Спин клеток (500 хг , 5 мин, RT) и повторно гранулы в 5 мл красных кровяных телец (РБК) лиза буфера. Инкубировать в течение 5 минут на RT и остановить реакцию, разбавляя буфер лиза с 10 мл PBS. Спин клетки (500 х г, 5 мин, RT) и повторить этот шаг один раз или до тех пор, пока не более РБК находятся в гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Refilter подвески с помощью 30 мкм клетки ситечко в новую трубку 15 мл между двумя раундами лиза для удаления коагулированных клеток.
    3. После того, как лизирование завершено, спина клеток (500 хг , 5 мин, RT), отказаться от супернатантов и повторно гранулы в 1 мл PBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометре с помощью trypan синего исключения.
  2. Лимфатические узлы
    1. Поместите четыре соединенных лимфатических узла на 70 мкм клеточный ситечко поверх 15 мл трубки. Аккуратно дразнить лимфатических узлов друг от друга в одной клеточной подвески, нажав с стерильной 3 мл шприц поршень. Флеш ситечко часто в общей сложности 6 мл RPMI с 10% FBS.
    2. Спин клеток (500 хг , 5 мин, RT), отказаться от супернатанта и повторно гранулы в 500 йл PBS. Перефильтруйте суспензию с помощью 30 мкм клеточного ситечко в новую трубку 15 мл для удаления коагулированных клеток. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометре с помощью trypan синего исключения.
  3. Костный мозг
    1. Тщательно понять нетронутыми бедренной кости с помощью ткани мизинец большого пальца без разрыва его. Отрежьте самый конец проксимальной бедренной кости острыми ножницами, чтобы облегчить промывку кости. Поверните бедренную кость вокруг и положение 23 G иглы в середине межкордилярной выемки бедренной кости. При применении мягкого давления поверните иглу между большим и указательным пальцами для того, чтобы просверлить отверстие в межкондайной выемке, чтобы войти в костную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда частицы кости могут препятствовать иглы после бурения отверстие, чтобы избежать ненужного высокого давления во время промывки изменения иглы до промывки рекомендуется.
    2. Промыть кость с 6 мл RPMI с 10% FBS (или до флеш становится белым) с помощью шприца 10 мл с 23 G иглы на 70 мкм клетки ситечко, которое помещается на 15 мл трубки. Аккуратно нажмите костный мозг через клеточный ситечко с поршенем шприца 3 мл и промойте ситечко еще 3 мл RPMI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кости должны казаться белыми, как только весь мозг был вымыл полностью.
    3. Спин клеток (500 хг , 5 мин, RT) и повторно гранулы в 5 мл буфера РБК лиза. Инкубировать в течение 5 минут на RT и остановить реакцию, разбавляя буфер лиза с 10 мл PBS.
    4. Спин клеток (500 хг , 5 мин, RT), отказаться от супернатанта и повторно гранулы в 1 мл PBS. Перефильтруйте суспензию с помощью 30 мкм клеточного ситечко в новую трубку 15 мл для удаления коагулированных клеток. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометре с помощью trypan синего исключения.
  4. Синовиальная ткань
    1. Нарезать кубиками два блоков синовиальной ткани на мелкие кусочки с тонкой хирургической ножницой. Перенесите образцы со средой в трубку 15 мл. Промыть старую колодец дополнительными 0,5 мл RPMI, чтобы получить оставшиеся клетки и синовиальные ткани, перевести в соколиную трубку (окончательный объем 2 мл).
      Совет: Используйте перенесите пипетку и вырежьте кончик, где диаметр расширяется в этом шаге.
    2. Восстановленный фермент и алицита в соответствии с инструкциями производителя (например, Liberase). Добавьте достаточное количество фермента, чтобы привести к окончательной концентрации 1 единицы/мл (в общей сложности 2 единицы на образец). Дайджест при 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч с помощью ротатора MACS.
    3. Остановите пищеварение, добавив 8 мл RPMI с 10% FBS и фильтровать подвеску клеток через 70 мкм ситечко клеток в новую трубку 15 мл. Промыть старую трубку 15 мл с еще 5 мл RPMI с 10% FCS средней и фильтровать подвеску ячейки через тот же ситечко клетки в новую трубку (15 мл конечного объема).
    4. Спин клеток (500 хг , 10 мин, RT), отказаться от супернатанта и повторно гранулы в 500 йл PBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометре с помощью trypan синего исключения.

3. Распределение ячеек

  1. Этикетка две пластины 96-хорошо (U-нижней формы) с типом ткани, животных ID, и назначенные антитела панели. Всего в этом протоколе используются две панели антител: подмножество моноцитов (внеклеточное окрашивание) и подсеховая панель Т-клеток (экстра- и внутриклеточное окрашивание).
  2. Обеспечить 5 х 105 ячеек на колодец с использованием соответствующих одноклеточных суспензий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При создании эксперимента оцените абсолютное количество клеток, которое ожидается в группе и типе тканей (обработанные животные имеют более высокий уровень клеток в тканях, чем контрольные животные). При повторном использовании клеточных гранул на последнем этапе генерации одноклеточных суспензий выберите соответствующее количество PBS, чтобы в конечном итоге с концентрацией 5 х10 5 на 200 МКЛ. 96-хорошо пластины, используемые здесь может ввести максимум 300 йл и, как правило, 200 йл идеально подходит для сведения к минимуму риск перекрестного загрязнения из-за разлива.
  3. Для каждой панели и типа тканей, распространять по крайней мере 5 х 105 клеток, как незапачканные элементы управления в скважинах, которые были четко обозначены.

4. Подмножество моноцитов

  1. Выполните окрашивание жизнеспособности: Спиновые клетки (500 х г,5 мин, 4 градусов по Цельсию) с помощью пластины спиннера и мыть клетки один раз с 200 йл 1x PBS. Подготовье стокового раствора клеточно-непроницаемого амин-реактивного красителя (пятно жизнеспособности), разбавленного 1:50 в 1x PBS. После этого, перерасход клеточных гранул с 100 йл этого стокового раствора в результате чего абсолютный объем 2 йл пятна жизнеспособности на колодец. Инкубация в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия защищена от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество пятен жизнеспособности необходимо должно быть определено путем выполнения кривой титрования дозы. Кроме того, разбавленный раствор пятна пятна штока должен быть использован в один день и не храниться. Обратитесь к инструкциям производителя для получения дополнительной информации о том, как восстановить, разбавить и хранить пятно жизнеспособности.
  2. Во время инкубации приготовьте коктейль из антител в соответствующем объеме буфера FACS (Ca2 и Mg' free PBS, содержащий 0,1% BSA и 0,02% азида натрия). Вымойте клетки дважды с 200 йл буфера FACS, центрифуги (500 х г, 5 мин, 4 КК) и повторно поместить каждую гранулу с 100 йл смеси антител или соответствующей контрольной смеси. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, защищенных от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, имейте в виду, что азид натрия является токсичным для клеток. В текущем протоколе концентрация азида натрия в буфере потока очень низкая (0,02%) и образцы запускаются сразу же после окрашивания таким образом, не вызывая никаких проблем. Если вниз по течению функциональные анализы отсортированы клетки планируется, было бы полезно, чтобы составить свежий буфер FACS каждый день экспериментов и не использовать какой-либо натрия азида. При использовании множества антител, рекомендуется добавить соответствующее количество "Brilliant Stain Buffer" в коктейль антител для повышения результатов.
  3. Вымойте клетки дважды с помощью 200 МКЛ буфера FACS и повторно помеку ячейки в 250 йл буфера FACS и EDTA (буфер FACS, содержащий 1 мМ EDTA). Передача образцов в помеченные трубки FACS. Храните образцы на уровне 4 градусов по Цельсию и защищены от света до приобретения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунные клетки имеют тенденцию быть липким. Для минимизации как риска блокировки, так и количества дублетов рекомендуется добавить 1 мМ EDTA в буфер конечного потока.

5. Панель подмножества T клеток

  1. Выполните окрашивание жизнеспособности: Спиновые клетки (500 х г,5 мин, 4 градусов по Цельсию) с помощью пластины спиннера и мыть клетки один раз с 200 йл 1x PBS. Подготовье стокового раствора клеточно-непроницаемого амин-реактивного красителя (пятно жизнеспособности), разбавленного 1:50 в 1x PBS. После этого, перерасход клеточных гранул с 100 йл этого стокового раствора в результате чего абсолютный объем 2 йл пятна жизнеспособности на колодец. Инкубация в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия защищена от света.
  2. При инкубации образцов, подготовить внеклеточное окрашивание антител коктейль в соответствующем объеме 1x FACS буфера. Вымойте клетки дважды с 200 МКЛ 1x facS буфера, спина их вниз (500 х г, 5 мин, 4 КК) и повторно использовать каждую гранулу с 100 йл смеси антител или соответствующей смеси контроля. Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, защищенных от света.
  3. Выполните внутриклеточное окрашивание с набором фиксации и пермеабилизации в соответствии с инструкциями производителя. Вымойте клетки дважды с 200 МКЛ 1x буфера FACS и повторного перерасхода в 200 МКЛ буфера фиксации. Инкубировать в течение 40 мин при 4 градусов по Цельсию защищены от света.
  4. Во время инкубации приготовьте коктейль из антител (внутриклеточного окрашивания) в соответствующем объеме 1x протеабилизации и вымойте буфер. Соберите клетки, вращаясь (750 х г, 5 мин, 4 КК) и мыть клетки дважды с 200 йл 1x завивки / мыть буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация и пермеабилизация приводит к клеткам, которые, как правило, немного сложнее правильно гранулы. Для того, чтобы свести к минимуму потерю клеток во время последующих шагов стирки, увеличьте центробежную силу до 750 х г. В качестве альтернативы можно было бы также применить более длительный цикл вращения. Тем не менее, это приведет к значительно больше времени, которое необходимо для подготовки клеток.
  5. Спин-клетки (750 х г,5 мин, 4 КК) и повторно помесят каждую гранулу со 100 мл смеси антител или соответствующей контрольной смеси. Инкубировать в течение 40 мин при 4 градусов по Цельсию защищены от света.
  6. Вымойте клетки дважды с 200 йл 1x завивки / мыть буфера и повторного перерасхода клеток в 250 йл facS буфера EDTA. Передача образцов в помеченные трубки FACS. Храните образцы на уровне 4 градусов по Цельсию и защищены от света до приобретения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого антитела оптимальная концентрация должна быть определена путем выполнения кривой титровали дозы. Концентрация между антителами может сильно отличаться: CD3 и CD80 использовались с разбавляя фактором 1:1, в то время как CD11b и CD4 использовались с разбавляя фактором 1:6400. При титроваи концентрации антител используйте такое же количество клеток, которое будет использоваться в ходе экспериментов.

6. Компенсация, надлежащий контроль и

  1. Настройка эксперимента
    1. После того, как оптимальная концентрация антитела была определена запустить незапачканных и одного окрашенных элементов управления для компенсации, чтобы настроить для спектрального перекрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите все компенсации контроля с обеих ячеек и компенсации шарики. Используйте все, что генерирует самые яркие результаты (наивысший МФО положительных событий) для компенсации. МФО означает средняя интенсивность флуоресценции и часто используется для описания и определения среднего интенсивности генерируемого сигнала и, таким образом, уровня экспрессии антител.
    2. Запуск флуоресценции минус один (FMO) контролирует и изотип контролирует при запуске нового многоцветного эксперимента. Более подробная информация о FMO были ранее опубликованы19.
    3. Определите оптимальное напряжение Forward Scatter Area (FSC-A) и напряжение бокового рассеяния (SSC-A) для обнаружения популяции лейкоцитов в необрятых контролях каждого типа тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс фиксации и пермеабилизации изменяет размеры ячейки. Таким образом, напряжение FSC-A и SSC-A для подмножества моноцитов и подмножество T Cell Panel значительно различаются. Для того, чтобы найти оптимальное напряжение для панели подмножества Т-клеток, используйте ячейки, которые были одной окрашены CD3 и задние ворота к популяциям лейкоцитов при корректировке значений FSC-A и SSC-A.
  2. Стратегия Гэтинга
    1. После того, как оптимальное напряжение FSC-A и SSC-A будет определено, установите первичные ворота на популяцию лейкоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом откалибровать цитометр с использованием калибровочные бусы в соответствии с инструкциями производителя и запустить незапачканные бусы. Популяции лейкоцитов разных точек времени должны иметь сопоставимые свойства FSC и SSC (ожидаются небольшие различия между типами тканей и нормальными). Если FSC и SSC варьируется значительные проблемы стрелять цитометра и образца поколения.
    2. Исключить дублеты: Участок FSC-A (у оси) и FSC-H (x-axis). Синглеты появляются как диагональ этого сюжета. Ворота на синглетах.
    3. Исключите мертвую ячейку: Участок FVS510 (пятно жизнеспособности) (x-axis) и FSC-A (y-axis). Мертвые клетки будут отображаться как положительные события, таким образом ворота на живые клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Истинные отрицательные клетки будут видны в необлитаемых элементов управления. Таким образом, отрегулируйте эти ворота для каждого набора образцов при запуске неоплеканных элементов управления до окрашенных образцов. Дальнейшее gating зависит от панели антител и типа клеток, который исследован. Стратегии Гэтинга для каждой панели, используемой в этом протоколе, можно найти на рисунке 1 и рисунке 4соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ниже описаны репрезентативные результаты как панели подмножества моноцитов, так и панели подмножества Т-клеток.

Рисунок 1 иллюстрирует иерархическую стратегию гэтинга для моноцитов подмножество панели на иммунные клетки, собранные из костного мозга DMM обработанных животных. Та же стратегия была использована и проверена во всех других типах тканей. При настройке эксперимента для каждого типа тканей было определено напряжение Forward Scatter Area (FSC-A) и Side Sca...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы, описанные в этом протоколе, были разработаны и протестированы для надежного выявления различных подмножей как из моноцитов / макрофагов и Т-клеток в селезенке мурина, костного мозга, лимфатических узлов и синовиальной ткани в муриной модели остеоартрита (ОА). Текущий протокол может быть легко изменен для исследования различных типов тканей, или других типов клеток путем обмена антителами, и может быть использован для альтернативных моделей мурина ОА. При тестировании других типов тканей, очень важно проверить спе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Эндрю Лим, доктор философии и Джайлс Бест, доктор философии за помощь в создании цитометра потока. Этот проект был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1), присужденным PH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
APC anti-mouse CD194 (CCR4)BioLegend131212T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000TstBD566385
Buffers Fixable Viability Stain 510, 100 &; gBD564406Т-клеточная панель
Фиксируемая морилка для жизнеспособности 510, 100 и микро; gBD564406моноцитарная панель
либераза, исследовательский классRoche5401127001фермент для синовиальной ткани
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &; gBD564985панель моноцитов
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &; gBD562454панель моноцитов
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &; gBD742274Т-клеточная панель
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 & микро; gBD565250Панель моноцитов
Ms CD25 BV605 PC61, 50 & микро; gBD563061Т-клеточная панель
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &; gBD557596Т-клеточная панель
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &; gBD552775Т-клеточная панель
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 и микро; gBD565480Панель T-cell
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &; gBD565261Т-клеточная панель
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &; gBD740664Т-клеточная панель
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &; gBD563687панель моноцитов
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &m; gBD563332Т-клеточная панель
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 и микро; gBD565411панель моноцитов
Ms Foxp3 PE MF23, 100 &; gBD560408Т-клеточная панель
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 и микро; gBD563414панель моноцитов
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &; gBD560593панель моноцитов
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &; gBD560600Моноцитарная панель
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &; gBD564143Т-клеточная панель
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &; gBD562894Т-клеточная панель
Буфер для лизирования эритроцитовН/ДБуферы
Буфер Фактора транскрипции Набор буферов 100TstBD562574буферах

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи