Acyl-PEGyl Обмен Гель Сдвиг Анализ для количественного определения Palmitoylation мозга Membrane белков

S-palmitoylation является обратимой пост-трансляционной модификации целевых белков, которая регулирует стабильную мембранную ассоциацию, торговлю белками и белково-белковые взаимодействия^1. Она включает в себя добавление 16-углеродного пальмитата moiety к остаткам цистеина через тиостер связи катализировали palmitoyl acyltransferase (PAT) ферментов. Многие синаптические белки в головном мозге palmitoylated, в том числе АМРА-Rs и PSD-95, в активности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации, и функции^2,3,4. Изменения в уровнях синаптической АМРАРов в PSD через взаимодействие вспомогательных факторов с синаптической эшафот, таких как PSD-95 лежит в основе синаптической пластичности; Таким образом, методы определения состояния пальмитоилации синаптических белков дают важное представление о механизмах синаптической пластичности.

Ранее мы определили семейство SynDIG из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами^5. Переэкспрессия или нокдаун SynDIG1 в диссоциированных крысиных гиппокампальных нейронов увеличивается или уменьшается, соответственно, ampA-R размер синапса и число на 50%, как обнаружено с помощью иммуноцитохимии и электрофизиологии⁵. Мы использовали ацил-биотин обмена (ABE) анализ, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности зависимых образом для регулирования стабильности, локализации и функции⁶. ABE ассси опирается на обмен биотина на цистеины защищены модификации и последующей очистки сродства⁷. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ^8,9,10,11,12, который не требует очистки сродства и вместо этого использует изменения в подвижности геля, чтобы определить количество изменений для белка интерес. Протокол описан для исследования эндогенных мембранных белков из мозга мыши, для которых доступны подходящие антитела.

Все процедуры для животных следовали руководящим принципам, установленным Национальными институтами здравоохранения (NIH) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.

1. Подготовка мембран мозга мыши

1. Обезглавливать мышь с помощью аппарата гильотины и быстро вскрыть мозг (в 1 мин, если это возможно, чтобы свести к минимуму изменения пальмитоилации, которые могут произойти во время процедуры вскрытия). Гомогенизировать сразу в 10 мл буфера гомогенизации(Таблица 1) в стеклянном гомогенизаторе (12 ударов) на льду.
2. Центрифуга лисаты в течение 15 мин при 1400 х г при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую трубку на льду. Приостановите гранулы (6 ударов) в равном объеме буфера гомогенизации и центрифуги на уровне 710 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
3. Смешайте супернацианты со ступени 1.2 и центрифугу при 40 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах По Цельсию.
4. Откажитесь от супернатанта (цитосоликофракции) и отбросите фракцию гранулированной мембраны (P2) в буфере гомогенизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть флэш-заморожены и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
5. Выполните анализ бисинхониновой кислоты (BCA) для количественной оценки уровня белка. Для aPEGS анализ, начните с белка 100-200 мг (максимум 250 мг) в объеме 470 л буфера А (Таблица 1) в трубке 1,5 мл. Соникат и центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить нерастворимый белок. Перенесите растворимый белок в новую трубку 1,5 мл.

2. Acyl-PEGyl обмен гель-сдвиг (APEGS) асссе

1. Нарушить дисульфидные связи и блокировать свободные цистеина.
   1. Нарушить дисульфидные связи путем инкубации в 25 мм три (2-карбоксехил) фосфин (TCEP; 25 Л, добавленный из акционерного раствора; Таблица 1) в течение 60 мин при 55 градусах По цельсии.
   2. Блок свободных цистеина с 50 мМ N-этилмалеймид (NEM; 12,5 л, добавленный из бульонного раствора; Таблица 1) при комнатной температуре 3 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть продлена на ночь.
2. Выполните хлороформметаное (СМ) осадки.
   1. Перенесите белковый раствор из 1,5 мл трубки в полипропилена или стеклянную трубку, которую можно центрифугировать в размахивающем роторе ведра с небольшой скоростью. Идеально подходит для трубки 5 мл. Добавьте четыре тома (2 мл) метанола (MeOH) и вихрь кратко.
   2. Добавьте два тома (1 мл) хлороформа и вихря кратко.
   3. Добавьте три тома (1,5 мл) dH₂O и вихрь кратко.
   4. Centrifuge образцы на 3000 х г в течение 30 мин при 25 градусов по Цельсию в размахивая ротор ведро.
   5. Тщательно удалите и отбросьте верхнюю фазу.
   6. Добавьте 3 тома (1,5 мл) MeOH и аккуратно перемешайте, но тщательно, стараясь не фрагментировать непрозрачный белковый блин.
   7. Центрифуга при 3000 х г в течение 10 мин при 25 градусах По Цельсию в размахивающем роторе ведра.
   8. Используя стеклянный серологический пипетка, удалите как можно больше верхней фазы, не нарушая белок блин.
   9. Тщательно промыть гранулы с 1 мл MeOH.
   10. Воздух сушить гранулы, по крайней мере 10 минут.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
3. Выполните расщепление пальмитоил-тиоэстерных связей с гидроксиламином (NH₂OH, HAM).
   1. Повторное протеина осаждается в 125 л буфера А и снотворно езлит. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию, чтобы удалить нерастворимый материал. Перенесите растворимый белок в новую трубку 1,5 мл.
   2. Добавьте 375 л буфера H (HAM; Таблица 1) или буфер T (HAM-; Таблица 1) и инкубировать образцы в течение 60 мин при 25 градусах Цельсия.
4. Повторите осадки СМ, описанные в шаге 2.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
5. Добавьте mPEG в незащищенные цистеина.
   1. Повторное удаление гранул в 100 л буфера А, содержащего 10 мМ TCEP. Перенесите на трубку 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально для значительной потери белка, которые произошли во время см осадков шаги. Все последующие шаги будут выполняться в трубке объемом 1,5 мл, что ограничивает объем белка максимум в 120-130 мл. Это позволит уменьшить потерю белка во время окончательного осадков СМ.
   2. Добавить 20 мМ mPEG-5k (25 л, добавленный из запасного раствора; Таблица 1) к образцу белка и перемешать путем пипетки. Инкубировать в течение 60 мин при 25 градусах Цельсия с конечным вращением.
   3. Для удаления неинкорпорированных mPEG-5k, выполнить СМ осадков, как описано в шаге 2.2 с использованием этих скорректированных объемов: 4 тома MeOH (500 л), 2 тома хлороформа (250 л), и 3 тома dH₂O (375 л). Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
   4. Тщательно удалите верхнюю фазу, как и раньше, избегая густой, flocculent блин. Добавить 1 мл MeOH и аккуратно перемешать, но тщательно. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
   5. Тщательно удалите супернатант и промыть гранулы с 1 мл MeOH. Центрифуга на йgt;13000 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию. Воздух сухой гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы могут храниться при -20 градусах Цельсия.
   6. Приостановите высушенные гранулы в 50 злбуфера А (без TCEP или какого-либо редукционного агента). Резерв 5 ЗЛ для количественной оценки белка BCA. После количественной оценки добавьте соответствующее количество 4x буфера образца Laemmli и, в зависимости от интересующего белка, потенциально нагреть образец до 70-100 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кипение может привести к агрегации некоторых мембранных белков.

3. Западный анализ поблужей PEGylated белков

1. Загрузите образец на гель натрия dodecyl sulfate polyacrylamide гель электрофорес (SDS-PAGE) гель¹³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе было использовано 10% полиакриламид.
2. Используйте стандартные протоколы разделения, передачи и обнаружения для западных blotting¹⁴.
3. Используйте денситометрию¹⁴ для определения относительного количества PEGylated по сравнению с неПЕГилатированных белков.

Иммуноблоттинг с антителами против белка интереса показывает palmitoylated состояние (не, посредственный, вдвойне и т.д.) в мышиных мозговых лисатов, как определяется сдвиг мобильности по сравнению с образцами, в которых HAM не был включен. Ранее мы продемонстрировали, что SynDIG1 был palmitoylated на двух сайтах с помощью ABE обзор6; однако, мы не смогли определить были ли оба места доработаны в тканях мозга. Здесь мы показываем, что SynDIG1, SynDIG4/Prrt1, и Prrt2 являются palmitoylated в мозге мыши и что они имеют два потенциальных palmitoylation сайтов (Рисунок 1). Интересно, что каждый белок имеет различное состояние пальмитоилации в мозге мыши на основе сигнала для не, познавательно и вдвойне palmitoylated белка. Денситометрия анализ помарки предоставляет количественную информацию о palmitoylated состоянии.

Рисунок 1: Обнаружение PEGylated белков оговороса видов в мышечной мембраны препаратов. Мозги мыши были вскрыты быстро и однородны немедленно. Фракции мембран P2 были подвергнуты ассею APEGs, как описано в этом протоколе. В этом эксперименте, послеродовой день 18 (P18) были разделены с помощью 10% SDS-PAGE гель и иммуноблатные и зондируется с антителами против SynDIG1 (SD1), Prrt2, и SynDIG4 (SD4). Символы указывают на белок, который не palmitoylated (я), palmitoylated посевно (я), или вдвойне (я). Наличие слабых полос в условиях HAM (-) указывает либо на неполное сокращение дисульфидных связей, либо на неполную блокировку свободных цистеин NEM свободных цистеинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Решения, используемые для асссеа APEGS. Буфер гомогенизации и буфер А могут быть подготовлены заранее; однако, добавить ингибиторы протеазы и фенилметилсульфонил фтора (PMSF) непосредственно перед использованием. Все остальные решения должны быть подготовлены свежими.

Авторам нечего раскрывать.