Методическая статья

Измерение токсичности пептида РАН в C. elegans

DOI:

10.3791/61024

⸱

30 апреля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повторные не-ATG-зависимые трансляционные продукты являются патогенными особенностями нескольких повторных заболеваний, основанных на расширении. Цель описанного протокола заключается в оценке токсичности, вызванной этими пептидами с помощью поведенческих и клеточных анализов в модельной системе C. elegans.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans обычно используется для моделирования возрастных нейродегенеративных заболеваний, вызванных повторными мутациями расширения, такими как амиотрофический боковой склероз (ALS) и болезнь Гентингтона. Недавно было показано, что повторное расширение, содержащее РНК, является субстратом для нового типа белкового перевода, называемого повторным независимым (РАН). В отличие от канонического перевода, перевод РАН не требует начала кодона и происходит только тогда, когда повторы превышают пороговую длину. Поскольку нет стартового кодона для определения кадра чтения, перевод RAN происходит во всех кадрах чтения как из смысла, так и из шаблонов РНК- антисмыслов, которые содержат последовательность повторения расширения. Таким образом, перевод РАН увеличивает количество возможных связанных с болезнью токсичных пептидов с одного до шести. До сих пор перевод РАН был задокументирован в восьми различных нейродегенеративных и нервно-мышечных заболеваниях, основанных на повторном расширении. В каждом случае расшифровка продуктов РАН, которые являются токсичными, а также их механизмы токсичности, является важным шагом на пути к пониманию того, как эти пептиды способствуют патологиологии болезни. В этой работе мы представляем стратегии для измерения токсичности пептидов RAN в модельной системе C. elegans. Во-первых, мы описываем процедуры измерения токсичности пептида РАН на рост и подвижность развивающихся C. elegans. Во-вторых, мы подробно ассси для измерения постразвития, возрастно-зависимых эффектов пептидов РАН на подвижность. Наконец, мы описываем нейротоксичность асссы для оценки влияния пептидов РАН на морфологию нейронов. Эти анализы обеспечивают широкую оценку токсичности пептида RAN и могут быть полезны для выполнения крупномасштабных генетических или малых молекул экранов для выявления механизмов заболевания или терапии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неуместное расширение последовательностей повторения ДНК является генетической основой для нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), фронтотемпоральная деменция (FTD) и болезнь Гентингтона (HD)1. Хотя существуют клеточные и животные модели для этих заболеваний, механизмы, лежащие в основе этих условий, не четко определены. Например, HD вызвано расширением последовательности повтора CAG в последовательности кодирования для белка Хантингтин Htt2. Потому что CAG кодирует аминокислоты глутамин, CAG повторить расширение приводит к вставке полиглютамина, или поли, последовательность в Htt. Расширенный поли" белки образуют длину и возраст-зависимых белковых агрегатов, которые связаны с токсичностью3,4. Удивительно, но два последних исследования показывают, что длина последовательности поли" не является основным фактором начала заболевания БГ, предполагая, что поли- независимые факторы могут также способствовать болезни5,6.

Один из возможных поли- независимый механизм включает в себя недавно обнаруженный тип белка перевод называется Repeat Associated Nна-AUG-зависимых (RAN) перевод7. Как следует из названия, перевод РАН происходит только тогда, когда присутствует расширенная повторная последовательность и не требует канонического старта кодона. Таким образом, перевод РАН происходит во всех трех кадрах чтения повтора для получения трех различных полипептидов. Кроме того, поскольку многие гены также производят антисмысловую транскрипт, содержащую обратный дополнение расширенной последовательности повтора, перевод RAN также происходит во всех трех кадрах чтения антисмыслового транскрипта. В совокупности перевод РАН расширяет количество белков, вырабатываемых из расширенной повторяющихся последовательностей ДНК, от одного пептида до шести пептидов. На сегодняшний день перевод РАН наблюдается по крайней мере в восьми различных нарушениях повторного расширения8. Пептиды РАН наблюдаются в посмертных образцах пациентов и только в тех случаях, когда пациент несет расширенное повтор9,,10. Хотя эти пептиды явно присутствуют в клетках пациента, их вклад в патофизиологию болезни неясен.

Чтобы лучше определить потенциальную токсичность, связанную с пептидами RAN, несколько групп выразили каждый пептид в различных модельных системах, таких как дрожжи, мухи, мыши и клетки культуры тканей11,,12,,13,,1515,16., Вместо того, чтобы использовать повторную последовательность для выражения, эти модели используют подход кодон-вариации, в котором повторяющаяся последовательность устраняется, но аминокислотная последовательность сохраняется. Инициация перевода происходит через канонический АТГ и пептид, как правило, сливается с флуоресцентным белком либо n- или C-терминус, ни один из которых, как представляется, вмешиваться в RAN пептид токсичности. Поэтому каждая конструкция переэкспрессирует один пептид РАН. Моделирование различных продуктов РАН в многоклеточном организме с простыми анализами для измерения токсичности пептида РАН жизненно важно понять, как различные продукты РАН от каждого вызывающего заболевание повторного расширения способствуют клеточной дисфункции и нейродегенерации.

Как и другие модельные системы, C. elegans обеспечивает гибкую и эффективную экспериментальную платформу, которая позволяет проводить исследования новых механизмов заболевания, таких как токсичность пептида РАН. Черви предлагают несколько уникальных экспериментальных атрибутов, которые в настоящее время не доступны в других моделях пептидной токсичности RAN. Во-первых, C. elegans оптически прозрачны от рождения до смерти. Это позволяет просто визуализировать экспрессию и локализацию пептида РАН, а также анализ нейродегенерации у живых животных. Во-вторых, трансгенные методы генерации моделей экспрессии пептида РАН являются недорогими и быстрыми. Учитывая короткий трехдневный жизненный цикл C. elegans, стабильные трансгенные линии, выражающие любой пептид РАН в клеточном типе специфическим образом, могут быть произведены менее чем за неделю. В-третьих, простые фенотипические выходы могут сочетаться с методами генетического скрининга, такими как химический мутагенез или скрининг РНК, чтобы быстро определить гены, необходимые для токсичности пептида РАН. Наконец, короткая продолжительность жизни C. elegans (20 дней) позволяет следователям определить, как старение, которое является наибольшим фактором риска для большинства повторных заболеваний расширения, влияет на токсичность пептида РАН. В совокупности это сочетание экспериментальных атрибутов не имеет себе равных ни в одной другой модельной системе и предлагает мощную платформу для изучения токсичности пептида РАН.

Здесь мы описываем несколько анализов, которые используют экспериментальные преимущества C. elegans для измерения токсичности пептидов РАН и для выявления генетических модификаторов этой токсичности. Кодон-разнообразные ПЕПтиды ПО РАН помечены GFP и выражается индивидуально в любом мышечных клетках под промоутером мио-3 или в ГАМК-моторных нейронов под unc-47 промоутер. Для экспрессии в мышечных клетках, важно, чтобы токсичные пептиды RAN помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP), или другим флуоресцентным белком (FP) тегом, который может быть направлен с вектором кормления РНК. Это потому, что токсичные экспрессии пептида RAN обычно блокирует рост, что делает такие штаммы нежизнеспособными. Использование gfp (RNAi) условно инактивирует экспрессию пептида RAN и позволяет проводить поддерживающие деформации, генетические кресты и т.д. Для анализов, эти животные удаляются из gfp (RNAi), что позволяет выражение пептида РАН и в результате фенотипов. В дополнение к молекулярной стратегии для проектирования кодон-разнообразных конструкций экспрессии RAN пептида, мы описываем анализы для измерения токсичности развития (личиальная подвижность и анализ роста), пост-развития возрастной токсичности (парализующий анализ), и нейронных морфологических дефектов (анализ commissure).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Создание кодон-разнообразных конструкций экспрессии пептида РАН

  1. Дизайн индивидуальной последовательности пептидного кодирования RAN с использованием синонимных кодонов для устранения фундаментальной повторяющейся структуры ДНК/РНК, но сохранить надлежащую аминокислотную последовательность.
  2. Закажите пользовательские последовательности кодона на коммерческой степени на длинах повтора, необходимых для исследований (обычно 5-100 повторов). Включите сайт ограничения HindIII в конце 5' и сайт ограничения BamHI в конце 3', чтобы облегчить клонирование в вектор выражения C. elegans, таких как pPD95.79.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если синтез больших конструкций оказывается трудным, меньшие последовательности строительного блока могут быть синтезированы, а затем встроены в большие повторы с помощью стратегии направленной перевязки17.
  3. Подклон пептидной последовательности в C. elegans экспрессии вектор с использованием стандартных методов перевязки T4.
  4. Подклон клеточного типа конкретных промоутер последовательность, генерируемая ПЦР перед последовательность пептида RAN для привода ткани конкретных RAN пептид-GFP выражение.
  5. Микроинъекция струи1и RAN в гонад дикого типа C. elegans для генерации трансгенных штаммов, содержащих экстрахромосомные массивы с использованием стандартных методов18. Для совместного инъекционного маркера, мышцы конкретных RFP репортер(мио-3p::RFP (pCFJ104)) был использован, хотя другие маркеры могут быть использованы также.
  6. Интеграция стабильного трансгена в геном с помощью стандартных методов интеграционного скрининга C. elegans 19.
  7. Если пептид РАН токсичен, а трансгенные животные не выживают, кормите животных gfp (RNAi), выражая бактерии до и после инъекции, чтобы заставить замолчать выражение токсичного белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление животных из gfp (RNAi) позволяет экспрессии пептида РАН для фенотипических анализов с использованием анализов, описанных ниже.

2. Измерение токсичности развития пептидов RAN после нокдауна гена на основе РНК: Протокол анализа скорости видео

  1. Налейте стандартный нематод роста среды (NGM) РНК 24 хорошо пластины с 1 мМ изопропил -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) и 25 мкг /мЛ карбенициллин.
  2. Полоса из РНК кормления клонов в HT115 бактерий, которые будут протестированы на бульон Лурия (LB) и карбенициллин (25 мкг/мл) агар пластин и выращивать бактерии при 37 кС для 24 ч. Включите пустой вектор (RNAi) в качестве положительного контроля за токсичность и gfp (RNAi) в качестве отрицательного контроля.
  3. Для каждого клона, выбрать одну колонию в 1 мл LB и карбенициллин жидких носителей и выращивать бактерии на ночь в течение 18 часов при 37 градусов по Цельсию при встряхивании при 250 вращений в минуту (RPM).
  4. Обнаружите четыре отдельные скважины NGM RNAI 24 скважин с 20 qL следующих ночных бактериальных культур: колонка 1 скважины и gfp (RNAi); колонка 2 скважины (EV)RNAi; столбцы 3-6 скважин и РНК против генов, которые должны быть протестированы. Разрешить РНК бактерий, чтобы вызвать dsRNA производства на ночь при комнатной температуре (RT).
  5. Изолировать яйца с первого дня взрослых C. elegans, выражающих интегрированный трансген пептида RAN, используя стандартный метод гипохлорит и семена 30 C. elegans яйца в каждый колодец NGM RNAi 24 хорошо пластины.
  6. Инкубировать 24 скважины при 20 градусах по Цельсию в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации для штаммов, выражающих токсичные диспептиды C9orf72 RAN, такие как PR50 или GR50. Другие штаммы могут потребовать более короткого времени инкубации, чтобы предотвратить истощение бактериального источника пищи и последующего голодания.
  7. Приобретайте передаваемые световые видео с помощью стереораспарирующего микроскопа Leica M-16FA, оснащенного монохромной камерой DFC345FX, подключенной к совместимому с Windows КОМПЬЮТЕРом под управлением программного обеспечения для приобретения видео Leica AF (версия 2.6.0.7266).
    1. Приобретите два видео из двух отдельных скважин для каждого состояния РНК, используя согласованные настройки приобретения видео между скважинами. Для каждого видео, приобрести 10 секунд при разрешении 800 х 600 пикселей и 13,16 кадров в секунду (время вокселя размер0,0,076 секунды) с помощью 18,6X увеличение (1,49 зум настройки в программном обеспечении AF). Установите время экспозиции изображения до 4 миллисекунд. Этикетка каждое видео сразу с штаммом, состояние РНК, и хорошо номер.
  8. Ослепите экспериментатора на генотип, связанный с каждым видео файлом, рандомизировав порядок видео и изменив название видео на числа. Сохранить эту группу видео в качестве нового файла. Отпустите экспериментатора после завершения анализа.
  9. Измерьте «пройденное расстояние» и длину каждого животного для 20 различных животных из каждого видео, изучая в общей сложности 40 червей для каждого состояния РНК.
    1. В программном обеспечении выберите кнопку аннотации инструментов, а затем нарисовать текстовый инструмент. Нажмите на точку в центре червя измеряется в первом кадре видео и пометить его как число. Предварительное видео до конца, визуально отслеживая траекторию движения червя. В последнем кадре нажмите на точку в центре измеряемого червя и пометьте следующее соответствующее число. Затем, используя инструмент шкалы рисования, нарисуйте линию от первого номера до второго числа, чтобы записать "пройденное расстояние".
    2. «Расстояние пройдено» — это расстояние между двумя центроидными точками. Это расстояние отображается рядом с линией измерения. Запись этого измерения в электронной таблице. Повторите это измерение для 19 других червей в видео, сохраняя при этом каждое отдельное измерение в окне анализа.
  10. Сделайте измерения от животных, демонстрирующих наиболее надежное движение, чтобы избежать отбора животных, не проявляющих движения и смещения данных к параличу. После завершения измерений сфотографировать окончательный видеокадр, иллюстрирующие все линии измерения, чтобы данные можно было проследить до животного, из которого они возникли.
  11. Проанализируйте данные с помощью электронной таблицы из четырех столбцов. Колонка 1 червь "идентификатор", колонка 2 расстояние пройденное / время (скорость).
    1. Время каждого видео можно найти, нажав на видео под экспериментом и перейдя к свойствам видео.
  12. Нормализуйте измерение скорости, найдя длину каждого животного, выбрав количественную, а затем статистику по программному обеспечению. Нажатие на значок аннотации инструмента на дисплее видео должно позволить использовать инструмент "Draw Polyline". Этот инструмент может быть использован для свободного отслеживания C. elegans от видео от кончика головы до кончика хвоста. Длина линии будет записана в статистике.
    1. Сфотографать окончательный видеокадр, иллюстрирующий все полилиновые, используемые для размеров C. elegans, чтобы данные могли быть прослежены до животного, из которого они возникли.
  13. Проанализируйте данные, добавив два дополнительных столбца в электронную таблицу. Колонка 3 — «Длина животных», а четвертой — «Нормализация скорости» (скорость/длина животных). Проанализируйте нормализованные данные о скорости с помощью односторонней ANOVA с пост-специального тестирования по сравнению с пустым вектором (RNAi).

3. Измерение токсичности развития пептида РАН: Оценка роста

  1. Выберите 30 gravid животных в 50 л пятно гипохлоритного раствора (10 мл отбеливателя, 2,5 мл 10 N NaOH, 37,5 мл dH2O) либо на gfp (РНК), (EV)RNAi, или (ген-специфический) 6 см РНК пластины.
  2. После 24 ч переместите шесть трансгенных потомков, которые выползли из гипохлоритного пятна раствора, в новую 6-сантиметровую пластину РНК, идентичную условиям РНК на пластине, на которой они подвергались лечению гипохлоритного раствора. Положите эти потомства (F1) на 20 градусов по Цельсию, чтобы расти и размножаться.
  3. После 24-48 ч, выбрать 10 трансгенных l4 животных на 6 см РНК соответствия РНК условия, что животные растут на. Разрешить животным пульс отложить яйца в течение 24 ч в инкубаторе 20 градусов по Цельсию.
  4. После 24 ч, удалить взрослых животных и отказаться от них. Подсчитайте количество яиц и личинок L1, отложенных в течение 24 ч период с помощью механического портативного счетчика. Это общий размер выводка.
  5. В течение следующих 72 ч, подсчитайте количество животных, которые достигают L4 или старше стадии. По мере того как каждое животное подсчитано, извлеките его от плиты.
  6. Количественно "Процентный рост" как процент животных, которые достигают L4 или старше стадии из общего размера выводка.
  7. Выполните точный тест 2 x 2 Fisher по сравнению с пустым вектором (RNAi), чтобы определить, является ли процентный рост статистически значимым. Категории для сравнения: "Рост" (" животных, достигших L4 или старшей стадии в 72 ч) и "Нет роста" (общий размер выводка минус количество животных, достигающих L4 или старше стадии в 72 ч).

4. Пост-развития РАН пептидный паралич асссее

  1. Поддерживайте интегрированные Трансгенные штаммы C. elegans, выражающие пептид-GFP РАН в мышцах на gfp(RNAi), поместив 4-6 трансгенных L4 на пластину 6 см gfp(RNAi) и выращивайте червей при 20 градусах Цельсия.
  2. Если эксперимент использует РНК для проверки генетического воздействия на токсичность пептида РАН, переместить 10 трансгенных gravid взрослых из неголоданой пластины к каждому из двух 6 см пустой вектор(RNAi) (положительный контроль за параличом, отрицательный контроль за генетические эффекты), gfp (RNAi) (отрицательный контроль за параличом, положительный контроль генетических эффектов), ген-специфический(РНК) (т.е., 10 gravid взрослых на 6 пластин).
  3. Если мутанты используются для анализа генетического воздействия на токсичность пептида РАН, поместите 10 гравидов WT или мутантов животных, выражающих тот же трансген РАН на каждом из двух 6 см пустых векторов(РНК) или gfp (RNAi) пластин. Выращивайте червей при 20 градусах по Цельсию в течение 48 ч.
  4. Выберите 10 наборов из 10 трансгенных L4 из 6-сантиметровых пластин РНК и поместите каждый набор на 3 см пластины РНК (т.е. n и 100 животных для каждого генотипа). Убедитесь, что Выбранный для асссея L4 имеет поверхностно нормальную подвижность. Поместите пластины в мешок для хранения молнии, чтобы сохранить влагу.
  5. Поместите мешки пластин с L4 в инкубаторе 25 градусов по Цельсию.
  6. Удалите животных 24 ч позже из инкубатора 25 градусов по Цельсию один штамм в то время, чтобы свести к минимуму количество времени, которое они находятся на RT.
  7. Нажмите пластины на рассекающий микроскоп, чтобы проверить движение. Если животные двигаются больше, чем длина тела, посчитайте животное мобильным и перенесите его на новую 3-сантиметровую пластину РНК. Используйте платиновый выбор, чтобы коснуться оставшихся червей на голове или хвосте. Если животное движется больше, чем длина тела, посчитайте животное как мобильное и перенесите его на новую 3-сантиметровую пластину РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 10 червей на тарелку при передаче. Будьте осторожны, чтобы избежать перемещения потомства к новой пластине РНК, потому что результат ы зависит только от следующих возрастных животных.
  8. Группируйте всех неподвижных червей вместе, так что движение больше, чем длина тела может быть легко обнаружено. Дайте животному хотя бы одну минуту, чтобы переместить более одной длины тела. Если он все еще не двигается, он парализован, мешках (т.е. личинки вылупились внутри матери), или мертв.
  9. Цензор животных, которые демонстрируют мешки, desiccate по бокам пластины, экспонат экструдированных кишечника, норы, заблудиться, или умереть от испытания во время обнаружения. Парализованные черви подсчитываются, оставляют на старой пластине РНК и выбрасывают.
  10. Оценка животных для паралича каждый день в течение 5-7 дней, как описано в шагах 4,6-4,9.
  11. Проанализируйте данные о параличе с помощью теста, идентичного тесту, используемому для анализа продолжительности жизни. В этом статистическом анализе, движущихся червей забил как "живой", парализованные черви забил как "Мертвые", и мертвые, мешки, кишечник экструдируется, высохли, зарытые, или иным образом потеряли червей забил как "цензура".
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе, "Процент жив" число указывает на "Процент Перемещение" животных. Обратное представляет собой "Процент парализованных". Используйте инструмент онлайн-анализа OASIS(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)для выполнения статистического анализа ранга журнала.

5. Измерение патологии нейронов: Оценка ассоциатизм

  1. Генерировать трансгенные C. elegans, выражающие пептид RAN интереса к ГАМК нейронов с помощью unc-47 промоутер. Также выразить unc-47p::GFP или unc-47p::RFP выявить клеточной морфологии нейронов ГАМК.
  2. Выберите 50 трансгенных l4 животных и поместите их на 6 см OP50 пластины на 25 градусов по Цельсию в течение 24 ч.
  3. Перенесите 50 трансгенных животных на новую 6-сантиметровую пластину OP50 при 25 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
  4. Сделать агарозные прокладки для визуализации животных под широкоугольной микроскопией.
    1. Поместите два куска ленты поверх двух слайдов микроскопа. Поместите очищенный слайд без ленты в середине двух лентой слайдов.
    2. Распределить 100 юл (1 капля из одноразовой пластиковой пипетки Pasteur) 3% расплавленной агарозы на средний слайд с одноразовой стерильной передачи пипетки.
    3. Немедленно поместите второй чистый слайд через каплю расплавленной агарозы так, что он опирается на лентой слайды и создает тонкий и ровный слой агарозы между слайдами.
    4. После того, как агарозо остынет и затвердеет, аккуратно удалите два слайда слоем агарозы между ними, не разделяя их, и поместите их в полиэтиленовый пакет с влажным листом бумаги под ними. Сделайте один слайд на 10 червей, которые будут рассмотрены вместе с тремя дополнительными слайдами.
  5. Удалите трансгенные C. elegans из инкубатора 25 градусов по Цельсию и выберите 10 трансгенных C. elegans в 100 лл капли 10 мМ левамизола в стеклянной депрессии слайд. Инкубировать в течение 10 минут или до тех пор, пока животные не будут парализованы.
  6. Удалите пару слайдов из полиэтиленового пакета и тщательно разделите их. Пометьте слайд агарозой с генотипом и добавьте 2 зл и 10 мМ левамизола к середине агарозы. Переместите 10 животных в левамизол на агарозной площадке. Обложка животных с #1 толщиной coverslip.
  7. Изображение животных, в которых вульвы ориентированы так, что он находится на правой стороне животного. Если вульва находится на левой стороне головы, commissures моторных нейронов будет под животных, а не так четко видны, что делает точную количественную оценку трудно. Опустить количественную оценку этих животных. В этой ориентации, commissures моторных нейронов находятся ближе всего к coverslip и хорошо видны на перевернутой широкоугольной флуоресцентный микроскоп. Визуализируйте нейронные коммюники, выражающие GFP с перевернутым широкоугольным флуоресценционным микроскопом Leica DMI4000B с объективом погружения масла 63X 1.4X NA и набором фильтров Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Если нейрон commissures выразить RFP вместо GFP, использовать leica TX2 RFP набор фильтров (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Визуализируйте нейронные коммюники, выражающие GFP с перевернутым широкоугольным флуоресценционным микроскопом с объективом погружения масла 63x 1.4x NA и набором фильтров GFP (Ex480/40 nm; Em527/30 нм). Если нейрон commissures выразить RFP вместо GFP, использовать красный флуоресцентный белок (RFP) фильтр набор (Ex560/40 нм; Em 645/75 нм).
  8. Изображение червей в течение 45 минут размещения coverslip на червей, чтобы свести к минимуму токсичность от иммобилизации.
  9. Для каждого червя подсчитайте количество видимых спой. Есть 16 видимых commissures в диких животных типа. Также подсчитайте количество commissures которые имеют большие шарики (т.е., blebs) в commissures также, как число commissures которые сломлены. Чтобы подтвердить, что спужная нарушается, следуйте за смягчающим из спинного шнура к брюшному шнуру, регулируя фокусную плоскость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Commissures, в котором unc-47p::GFP флуоресценции экспонатов разрыв считаются сломанной. Сломанный commissure обычно имеет bleb по обе стороны от перерыва, помогая показать, что commissures нарушается. Подсчитайте количество blebbing и перерывы на 20 червей.
  10. Рассчитайте фракцию commissures с blebs или ломает над общим числом наблюдаемых commissures для каждого животного. Можно также измерить абсолютное количество соминостов на одно животное (включая дикий тип, выплеснутые и сломанные события).
  11. Для каждой категории вычислите среднее SD и статистически сравните либо с помощью Т-теста студента для сравнения между двумя популяциями, либо с помощью односторонней ANOVA для сравнения между 3 или более популяциями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали анализы, описанные здесь, чтобы оценить влияние различных ингибиций генов на токсичность дипептиды РАН, которые находятся у больных ALS с расширением повторения G4C2. Используя анализ роста для измерения токсичности развития, мы проанализировали эффекты нескольких генетических мутаций нокаута, выявленных в геноме всей РНК-супрессоры мышечной выраженных PR50-GFP токсичности. В то время как выражение PR50-GFP только привело к полностью проникающий арест роста, потеря функции мутаций в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы сообщаем методы, которые могут быть использованы для ассеидного токсичности пептида RAN, смоделированных в мышцах или в нейронах C. elegans. В то время как нейродегенеративные белки имеют возрастной фенотип у пациентов с людьми, они также могут проявлять развитие токсичности, когда переэкспрессия в модельных системах. Переэкспрессия имеет значительные интерпретаторные ограничения, но она также обеспечивает мощную отправную точку для генетических или фармакологических экранов, направленных на выявление г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка Петри 35 мм x 10 мм, стерильнаяCELLTREAT Scientific Products50-202-036Пластины роста нематоды и РНК-интерференция
АГАР ГРАНУЛИРОВАННЫЕ 2 КИЛОГРАММАBD ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫПластины роста нематоды и РНКи
АГАРОЗНЫЕ УЛЬТРАЧИСТЫЕЖИЗНЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИМикроинъекции для получения пептидных трансгенных штаммов
RAN КАРБЕНИЦИЛЛИН 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485Пластины роста нематод и РНК-I
ЗАЩИТНЫЕ СТЕКЛА NO 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BВизуализация для коиссурительного анализа
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSМикроинъекция для получения пептидных трансгенных штаммов RAN,
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CМикроинъекция для получения пептидных трансгенных штаммов RAN
Fisherbrand  Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопаTHERMO SCI ERIE12-550-15Визуализация для анализа спайки
Gibco  Бакто Пептон Gibco DF0118-17-0Пластины роста нематод и РНКи
ГАЛОКАРБОНОВОЕ МАСЛО 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLМикроинъекция для генерации пептидных трансгенных штаммов
RAN IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSПластины роста нематод и РНК
Leica Advanced Fluorescence imaging программное обеспечение LeicaMicrosystemsLAS-AFПрограммное обеспечение для получения изображений для анализа скорости видео и анализа спайки
Leica Immersion type N (Oil)W NUHSBAUM INCВизуализация для анализа
спаек ЛЕВАМИЗОЛА ГИДРОХЛОРИД 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSВизуализация для анализа спаек
НАКОНЕЧНИКИ МИКРОЗАГРУЗЧИКА 2 X 96 ШТEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003Микроинъекция для получения трансгенных штаммов пептида
RAN
PETRI DISH, 60X15MM, 500/CS		CORNING LIFE SCIENCES ПЛАСТИКПЛАСТИНЫ РОСТА НЕМАТОДЫ И ТКАНЕВЫЕ ПЛАСТИНЫ ДЛЯ РНК
CULT PLATE 24WEL 50/CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721Пластины роста нематоды и РНК-интерференция
DF0145070 16500500 E5242952008 BP162010 NC9547002 AC187870100 . FB0875713A

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877(2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87(2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494(2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C elegansRPN7IGF DAF 2

Похожие статьи