Демонстрация управления морфологией электроспинного полимера для тканевой инженерии с использованием клеточной линии hepG2

Краткое содержание

Этот метод позволяет тестировать различные морфологии и топографии поликапролактонных волокон с целью тканевой инженерии. Малые и большие волокна изготавливаются со случайной ориентацией, выровненной ориентацией, а также пористые криогенные электроспиннинговые структуры и используются в качестве платформ для культивирования клеток.

Аннотация

Электропрядение дает исследователям возможность изготавливать воспроизводимые микро- и наноразмерные полимерные волокна. Трехмерная волокнистая архитектура электроспиннинговых полимеров рассматривается как структурная имитация внеклеточного матрикса (ВКМ). Таким образом, электроспиральные волокна, изготовленные из биосовместимых полимеров, широко исследовались исследователями в области тканевой инженерии на предмет их потенциальной роли в качестве искусственного ВКМ для управления ростом тканей как in vitro, так и in vivo. Все клетки остро чувствительны к своему механическому окружению. Это было продемонстрировано открытием множественных путей механотрансдукции, неразрывно связанных с цитоскелетными актиновыми филаментами. Цитоскелет действует как механический сенсор, который может управлять функциональностью и дифференцировкой клетки-хозяина в зависимости от жесткости и морфологии ее субстрата. Электропрядунные волокна могут быть настроены как с точки зрения размера волокна, так и морфологии, чтобы легко модулировать механическую среду внутри волокнистого полимерного каркаса. Здесь описаны методы электроспиннингования поликапролактона (PCL) для трех различных морфологий при двух различных диаметрах волокон. Категории морфологических волокон состоят из случайно ориентированных волокон, выровненных волокон и пористых криогенных волокон диаметром 1 мкм и 5 мкм. Методы, подробно описанные в этом исследовании, предлагаются в качестве платформы для изучения влияния архитектуры электропрядных волокон на генерацию тканей. Понимание этих эффектов позволит исследователям оптимизировать механические свойства электропрядущих волокон и более тщательно продемонстрировать потенциал этой технологии.

Введение

В последние десятилетия были разработаны методы тканевой инженерии, обеспечивающие клеткам биомиметическую среду для стимулирования успешной регенерации тканей, как для моделей тканей in vitro, так и для регенеративных методов in vivo. Эти методы обычно стимулируют клетки к образованию трехмерных агрегатов либо самостоятельно, либо с использованием направляющего каркаса¹. Каркасы могут быть изготовлены в виде пористых или волокнистых полимерных нано/микроструктур или в виде гидрогелей с высоким водопоглощением ^2,3,4. Электроспиннинг полимеров является распространенным методом изготовления, при котором получаются нетканые наномикроразмерные матрицы из полимерных волокон, которые могут имитировать волокнистую архитектуру нативного внеклеточного матрикса (ВКМ)⁵. Несколько биосовместимых полимеров применимы к процессу электропрядения; Следовательно, электропрядильные волокна являются популярной средой для облегчения регенерации тканей ^6,7,8. Электропрядунные волокна были использованы в культуре ряда тканей, демонстрируя многообещающее направление для недорогих и воспроизводимых платформ каркасов 9,10,11,12,13.

Клетки обладают острой чувствительностью к своему механическому окружению. Предыдущие исследования выявили эту важную взаимосвязь, называемую механотрансдукцией, которая может влиять на функцию, морфологию ^{и дифференцировку} клеток. Основа эукариотического клеточного цитоскелета построена из филаментного актина и играет ключевую механическую роль в клеточном делении, адгезии, миграции, сокращении и морфологии. Он манипулируется внешними механическими раздражителями через соединение с внеклеточными поверхностными белками 16,17,18. Морфологическое влияние на дифференцировку стволовых клеток было продемонстрировано в многочисленных исследованиях путем изменения формы присоединяемого субстрата, который затем способен контролировать форму клетки и направлять процесс дифференцировки^19,20. Более того, жесткость субстрата, к которому прикрепляются клетки, также влияет на судьбу стволовых клеток и их происхождение^21,22. Помимо стволовых клеток, было также замечено, что эти эффекты влияют на клетки различных линий^23,24. Методы трехмерной тканевой инженерии показали результаты, сходные с теми, которые были обнаружены в исследованиях двухмерной механотрансдукции как с гидрогелями, так и с фибриллярными каркасами 25,26,27. Кроме того, механика субстрата передается через 3D-клеточные агрегаты посредством межклеточной передачи сигналов²⁸. Механика материалов играет решающую роль в управлении клеточной функциональностью и, следовательно, должна быть основным фактором при проектировании каркасов для сконструированных тканей.

Целью данного метода является понимание влияния размера и морфологии волокон электроспиннингового поликапролактона (PCL) на клеточные культуры in vitro. Метод основан на предыдущих исследованиях, посвященных инженерии тканей почек⁹. Здесь предлагается более подробный пошаговый протокол, чтобы облегчить реконструкцию скаффолда и разработать стандартизированный метод, применимый ко всем типам клеток. С помощью этого метода были построены шесть групп скаффолдов: три из них представляют собой большие волокна размером 5 мкм (LG) и три других малых волокна размером 1 мкм (SM) с использованием различных концентраций PCL. В этих группах LG и SM существуют три различные морфологические конструкции: случайные волокна (RA), выровненные волокна (AL) и пористые криогенные волокна (CR). Все эти группы скаффолдов имеют по своей сути различную структуру и, таким образом, создают уникальные локальные механические среды, к которым прикрепляются клетки. Чтобы продемонстрировать морфологический эффект, который это оказывает на клетки, клеточная линия hepG2 была засеяна на каждую группу скаффолдов в качестве репрезентативного исследования. Этот метод предлагается в качестве базового анализа для проектирования электровращающегося скаффолда для всех типов клеток от стволовых клеток до клеточных линий и первичных клеток.

Протокол

1. Приготовление раствора

1. Крупные (случайные, выровненные и криогенные) волокна
   1. Приготовьте соотношение хлороформа и метанола в соотношении 5:1, смешав 50 мл хлороформа и 10 мл метанола в стеклянной бутылке, устойчивой к растворителям, с помощью стеклянной серологической пипетки.
      ВНИМАНИЕ: Хлороформ и метанол являются токсичными растворителями, и их смешивание необходимо проводить в вытяжном шкафу.
   2. Чтобы получить 19 мас.% раствора PCL в соотношении 5:1 хлороформ:метанол, взвесьте 1,9 г PCL и добавьте к 10 мл 5:1 хлороформ:метанол в стеклянный флакон, устойчивый к растворителям. Дважды запечатайте флакон с помощью парафиновой пленки и оставьте флакон на ролике на ночь, чтобы PCL полностью растворился.
      ВНИМАНИЕ: Смешивание необходимо проводить в вытяжном шкафу.
2. Маленькие (случайные и выровненные) волокна
   1. Для приготовления 7 мас.% раствора PCL в гексафторизопропаноле (HFIP) смассируйте 0,7 г PCL и смешайте с 10 мл HFIP в стеклянном флаконе, защищенном от растворителей. Дважды закройте флакон парафиновой пленкой и оставьте на ролике на ночь, чтобы PCL полностью растворился.
      ВНИМАНИЕ: HFIP очень токсичен, и его смешивание необходимо проводить в вытяжном шкафу.
3. Мелкие криогенные волокна
   ВНИМАНИЕ: Смешивание необходимо проводить в вытяжном шкафу.
   1. Приготовьте соотношение хлороформа и метанола в соотношении 3:1, смешав 30 мл хлороформа и 10 мл метанола в стеклянной бутылке, устойчивой к растворителям, с помощью стеклянной серологической пипетки.
   2. Чтобы получить 14 мас.% раствора PCL в соотношении 3:1 хлороформ:метанол, взвесьте 1,4 г PCL и добавьте к 10 мл 3:1 хлороформ:метанол в стеклянный флакон, устойчивый к растворителям. Дважды закройте флакон парафиновой пленкой и оставьте на ролике на ночь, чтобы PCL полностью растворился.

2. Установка электроспиннинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры должны быть установлены перед началом процесса электроспиннинга.

1. Размер и расположение иглы
   1. Для больших волокон (случайных, выровненных и криогенных) используйте латунную иглу с внутренним диаметром 1 мм / 0,8 мм и поместите иглу на расстоянии 230 мм от поверхности оправки.
   2. Для мелких волокон используйте латунную иглу с внутренним диаметром 1 мм / 0,4 мм и поместите иглу на расстоянии 15 мм от поверхности оправки.
2. Боковое движение иглы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Строительные леса, описанные на рисунке 1 , были изготовлены с игольчатой траверсой диаметром 100 мм со скоростью 50 мм/с, с повторяющимся движением влево и вправо на протяжении всего процесса.
   1. Чтобы настроить боковое движение, нажмите Motion | TNS 1 и установите Начальное положение [мм] на -50, Расстояние [мм] на 100, Скорость [мм/с] на 50 и Задержка поворота [мс] на 750.
3. Расход шприцевого насоса
   1. Для больших волокон (случайных, выровненных и криогенных волокон) нажмите вкладку «Материал » в пользовательском интерфейсе и установите шприцевой насос на 4 мл/ч.
   2. Для небольших (случайных и выровненных) волокон установите шприцевой насос на 0,8 мл/ч.
   3. Для мелких криогенных волокон установите шприцевой насос на 2,5 мл/ч.
4. Настройки напряжения
   1. Для больших волокон установите напряжение иглы на +15 кВ и напряжение на оправке на -4 кВ, нажав вкладку «Напряжение» в пользовательском интерфейсе и изменив положительные и отрицательные значения напряжения.
   2. Для небольших (случайных и выровненных) волокон установите напряжение иглы на +17 кВ, а напряжение на оправке на -4 кВ.
   3. Для малых криогенных волокон установлено напряжение иглы +18 кВ и напряжение оправки -4 кВ.
5. Вращение оправки (крупные и мелкие волокна)
   1. Для случайных волокон нажмите Motion | Установите цель и установите скорость вращения оправки на 250 об/мин.
   2. Для выровненных волокон установите скорость вращения оправки на 1 800 об/мин.
   3. Для криогенных волокон установите скорость вращения оправки на 180 об/мин.

3. Электроспиннинг случайных и выровненных волокон (больших и мелких волокон)

1. Вставьте иглу (информацию о размере и размещении иглы см. в разделе 2.1) в трубку из ПТФЭ диаметром 1 мм и закрепите внутри иглодержателя электроспиннера.
2. Под вытяжной шкаф перелейте 10 мл полимерного раствора в полипропиленовый или стеклянный (защищенный от растворителей) шприц. Обязательно удалите все пузырьки, дав шприцу постоять перед грунтовкой.
3. Подсоедините шприц к игле с помощью трубки из ПТФЭ и закрепите шприц внутри шприцевого насоса. После подключения подготовьте трубку из ПТФЭ, сжав поршень шприца и заполнив трубку полимерным раствором.
4. Оберните оправку алюминиевой фольгой и закрепите на устройстве вращения оправки.
5. Включите вращение оправки, нажав Motion | Цель | Вращайте и шприцевой насос нажимая на материал | Запустите насос 1.
6. Когда на конце иглы образуется небольшая бусина полимера, включите напряжение, нажав кнопку ACTIVATE HIGH VOLTAGE. Затем струя полимера должна быть выпущена из конического выступа полимерного раствора, называемого конусом Тейлора. Проверьте оправку, чтобы подтвердить отложение волокон на поверхности оправки.
7. Запускайте процесс электроспиннинга до тех пор, пока желаемое количество раствора PCL не будет электровращаться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для скаффолдов, представленных на рисунке 1, 4 мл раствора подвергали электроскручиванию.
8. После того, как электропрядение прекратится, снимите с оправки алюминиевую фольгу, покрытую волокном, и оставьте в вытяжном шкафу на ночь, чтобы дать возможность испариться излишкам растворителя.
9. После выпаривания храните волокна при комнатной температуре (RT).

4. Электропрядение криогенных волокон

1. Для криогенного электропрядения используйте криоспиннинговую оправку. Повторите шаги 3.1-3.3, затем перейдите к следующим шагам.
2. Оберните оправку алюминиевой фольгой.
3. Наполните оправку гранулами сухого льда. Закрепите крышку криовращающейся оправки на оправке, чтобы сухой лед не мог выйти из оправки, но давление могло уйти. Кристаллы льда должны образоваться на поверхности оправки практически сразу.
   ВНИМАНИЕ: Используйте защитные перчатки при работе с сухим льдом, чтобы избежать холодовых ожогов.
4. Закрепите оправку на устройстве вращения оправки и немедленно включите вращение оправки, нажав Motion | Цель | Вращайте и шприцевой насос нажимая на материал | Запустите насос 1.
5. Как только на конце иглы образуется шарик полимера, включите напряжение, нажав кнопку ACTIVATE HIGH VOLTAGE. Затем струя полимера должна быть испускаема из конического выступа полимерного раствора (т.е. конуса Тейлора). Проверьте оправку, чтобы подтвердить отложение волокон на поверхности оправки.
6. После 1 ч электроспиннинга приостановите процесс, нажав STOP ALL, и долейте в оправку сухой лед. Обеспечьте достаточную защиту от паров растворителя при заправке оправки. Выполните это в общей сложности 3 раза в течение 4 часов общего времени электроспиннинга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электроспиннинг можно возобновить, повторив шаги 4.4 и 4.5.
7. Как только электроспиннинг закончится, осторожно снимите оправку и немедленно поместите ее в сублимационную сушилку на 24 часа, чтобы сублимировать кристаллы льда на поверхности оправки.
8. После сублимации снимите покрытую волокнами фольгу с оправки и храните при RT, стараясь не раздавить.

5. Пробивка лесов

1. Пробивные каркасы из листа волокон с помощью биопсийного перфоратора диаметром 10−12 мм. Если волокна остаются прилипшими к алюминиевой фольге, поместите каркасы в 70% этанол для облегчения отслоения.

6. Стерилизация и нанесение плазменных покрытий

1. Поместите каркасы (по 1 каркасу на лунку) в пластину на 24 или 48 лунок и промойте их 3 раза в 70% этаноле. Оставьте погруженным в окончательную стирку, поместите в морозильную камеру при температуре -80 °C и дайте застыть.
2. После заморозки поместите тарелку в сублимационную сушилку и лиофилизируйте в течение 24 часов. Высушенные каркасы теперь могут быть покрыты плазменным покрытием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет доступа к плазменному коатеру, погрузите каркасы в 1% антибиотик-антимикотик (Анти-Анти) в фосфатно-солевой буфер (PBS) и оставьте инкубироваться при 37 °C на ночь.
3. Поместите пластину в плазменную камеру и снимите крышку. Запустите установку для нанесения плазменного покрытия на 500 мТорр и среднюю радиочастотную (РЧ) мощность в течение 30 с.
4. После нанесения плазменного покрытия погрузите каркасы в 1 мл PBS и 1% Anti-Anti. Каркасы должны легко впитывать раствор PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь каркасы готовы к засеиванию клетками.

7. Подготовка и посев клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Основной метод культивирования клеток, представленный ниже, предназначен для клеток hepg2, используемых в демонстрационных целях в репрезентативных результатах. Эти принципы могут быть применены к любому типу адгезивных клеток; Однако для разных ячеек могут потребоваться разные материалы и разные процессы. Работа с клетками должна проводиться в шкафу биологической безопасности в соответствии с асептической техникой.

1. Возьмите 1 x 10⁶ криоконсервированных клеток hepg2 и затравите семена в колбу для клеточной культуры T75 с 12 мл полной среды, состоящей из минимально незаменимых сред Eagle (EMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина, 5 мМ L-глутамина и 1% заменимых аминокислот.
2. Как только клетки достигнут 80% конфлюенции, отделите клетки от колбы для культур, промыв 3 раза в PBS и инкубируя в 2 мл трипсина при 37 °C в течение 4 минут. После постукивания по колбе ячейки должны отсоединиться.
3. Деактивируйте трипсин, добавив 8 мл готовой среды. Перелейте клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и вращайте клетки в центрифуге при давлении 120 x g в течение 5 минут.
4. Удалите надосадочную жидкость над клеточной гранулой с помощью аспирационной пипетки и замените 5 мл готовой среды. Ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
5. Подсчитайте полученную клеточную суспензию с помощью метода исключения трипанового синего. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и добавьте к 100 мкл трипанового синего во флаконе объемом 1,5 мл. Введите смесь на гемоцитометр под стеклянным покровным листом и подсчитайте клетки под микроскопом.
6. Отрегулируйте концентрацию клеток до 2,6 x 10⁶ клеток/мл, добавляя или удаляя весь фильтрующий материал. Чтобы удалить среду, центрифугируйте ячейки при давлении 220 x g в течение 5 минут, удалите необходимую среду и снова суспендируйте клетки.
7. Отсадите 1% Anti-Anti in PBS из луночного планшета и затравите 50 мкл суспензии клеток 2,6 x 10⁶ клеток/мл на поверхность каркаса с помощью пипетки объемом 200 мкл.
8. Дайте клеткам прикрепиться во время инкубации при 37 °C и 5%_CO2 в течение 1−3 ч, следя за тем, чтобы они не высыхали. После присоединения добавьте 300 μL (для 48-луночного планшета) или 500 μL (для 24-луночного планшета) питательной среды и инкубируйте при 37 °C и 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные методы культивирования клеток могут быть использованы с этого момента до дальнейшего функционального анализа.

Результаты

На рисунке 1 представлены изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) как малых (~1 мкм), так и крупных волокон (~5 мкм), изготовленных из растворов PCL. Волокна покрывали золотым палладием (60:40) в течение 30 с с использованием распылительного коатера перед СЭМ-визуализацией. Крупные волокна получали с использованием высокой концентрации PCL в соотношении 19 мас.% в растворе хлороформа и метанола в соотношении 5:1 для получения высоковязкого раствора PCL. Затем этот раствор с высокой вязкостью подвергался электроспиннингу с высокой скоростью потока, чтобы испускать большую нить полимерного раствора в электрическом поле. Поэтому необходимо было большое расстояние в 230 мм между иглой и оправкой, чтобы обеспечить эффективное испарение растворителя перед осаждением на оправку. И наоборот, волокна меньшего размера были получены с использованием низкой концентрации PCL в HFIP 7 мас.% для создания раствора PCL с низкой вязкостью. Электроспиннинг раствора PCL с низкой вязкостью при низкой скорости потока обеспечивал выделение более тонкой нити раствора PCL из иглы в электрическом поле. Более тонкая нить способствовала более быстрому испарению растворителя, а игла должна была находиться ближе к оправке на расстоянии 70 мм, чтобы обеспечить стабильное осаждение волокон. Для электропрядения небольших криогенных волокон изменение раствора PCL было необходимо для достижения надежного протокола. PCL в HFIP электроспиннингом на криогенную оправку многократно приводила к распаду волокнистой структуры. Электроспиннинг с концентрацией PCL 14 w/v% в хлороформ-метаноле 3:1 решил эту проблему; Тем не менее, это создавало большую вариативность размера волокон по всему каркасу. Степень выравнивания волокон (радиус и ориентация волокон) для каждого каркаса анализировали с помощью плагина²⁹ ImageJ DiameterJ и показывали на рисунках 2 и 3.

Рисунок 1: Изображения СЭМ, показывающие морфологические качества каждой группы скаффолдов. В верхнем ряду показаны мелкие волокна, а в нижнем ряду - крупные. Морфологические группы перечислены слева направо как случайные волокна, выровненные волокна и криогенные волокна соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Данные о радиусе волокна (слева) и ориентации волокна (справа) из плагина DiameterJ для небольшого набора волокон. Морфология указана сверху вниз как случайные волокна, выровненные волокна и криогенные волокна соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Данные о радиусе волокна (слева) и ориентации волокна (справа) из плагина DiameterJ для большого набора волокон. Морфология указана сверху вниз как случайные волокна, выровненные волокна и криогенные волокна соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Этот метод предложил нам набор скаффолдов с шестью отчетливо различающимися свойствами при растяжении, определенными с помощью машины для испытаний на растяжение в соответствии с ранее описанными методами⁹. Как показано в таблице 1 , макромасштабные модули Юнга варьируются от 46,94 ± 3,48 МПа в больших выровненных волокнах до 0,20 ± 0,01 МПа в больших криогенных волокнах. Значения жесткости физиологических тканей колеблются от 100 Па (нервная ткань) до 2−4 ГПа (костная ткань)³⁰; Все приведенные здесь значения жесткости скаффолда находились в этом диапазоне.

Эшафот	Модуль Юнса (МПа) для деформации, %
	0–2%	2–4%	4–6%	6–8%	8–10%
СМ. РА	11.14 ± 2.13	9.31 ± 0.43	6,75 ± 0,64	4,75 ± 0,59	3.32 ± 0.40
СМ. АЛЬ	27.94 ± 8.63	28.27 ± 7.36	16.34 ± 4.87	9.10 ± 3.75	5.85 ± 3.11
СМ. ЧР	0,27 ± 0,11	0,31 ± 0,44	0,31 ± 0,65	0,29 ± 0,59	0.26 ± 0.40
LG. РА	9,23 ± 0,78	8.22 ± 0.87	5,96 ± 0,68	3,96 ± 0,59	2,63 ± 0,45
LG. АЛЬ	46.94 ± 3.48	38.03 ± 2.46	27.69 ± 1.22	16.10 ± 1.61	7.87 ± 1.32
LG. ЧР	0,20 ± 0,01	0,16 ± 0,01	0,12 ± 0,01	0,10 ± 0,01	0,09 ± 0,01

Таблица 1: Данные испытаний на растяжение для каждой группы скаффолдов с интервалом 2% деформации. СМ. RA = малый случайный, SM. AL = Малый выровненный, SM. CR = Малый криогенный, LG. RA = Большой случайный, LG. AL = большой выровненный, а LG. CR = Большой криогенный. Данные представлены в виде среднего ± SD, n = 5.

На рисунке 4 показано окрашивание DAPI и фаллоидином, используемое для визуализации клеточной морфологии. Используемый метод окрашивания установлен в литературе^11,12. Изображения были получены с помощью микроскопа (Table of Materials) с объективом 40-кратного увеличения. Изображения показывают, что выровненные волокна, полученные этим методом, удлиняют морфологию клеток hepG2 и направляют пролиферирующие клетки по длине волокон, создавая направленность внутри клеточной культуры. Напротив, клетки hepG2 на случайных волокнах не демонстрировали направленной пролиферации и удлинения, наблюдаемых в выровненных структурах. На случайных структурах клетки hepG2 демонстрировали более регулярную морфологию с расширенными выступами, прикрепляющимися к окружающим волокнам PCL.

Рисунок 4: DAPI (синий) и фаллоидин (зеленый) окрашивали клетки hepG2 на различных морфологиях каркаса: случайном (слева), выровненных (посередине) и криогенных (справа). В верхнем ряду показаны мелкие волокна, а в нижнем ряду — крупные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Создание волокон различных размеров было достигнуто с помощью комбинации различных растворителей, концентраций PCL и параметров электропрядения. Тип полимера, его молекулярная масса и растворитель сильно влияют на вязкость и зарядовые свойства полученного раствора и, следовательно, оказывают сильное влияние^{на свойства} электроспиннинга. Напряжения, отображаемые в этом методе, могут изменяться в зависимости от условий, в которых проводится электроспиннинг. Температура и влажность влияют на поведение процесса электропрядения³². Поэтому читателю рекомендуется быть готовым к изменению напряжения, чтобы противостоять любым помехам и добиться стабильного конуса Тейлора. Рекомендуется размещать электроспиннер в кожухе для контроля окружающей среды, чтобы уменьшить вариативность процесса электропрядения от партии к партии.

Достижение различных морфологий, представленных в этом методе, возможно благодаря возможностям электропрядильного устройства IME. Оправка с регулируемой скоростью необходима для контроля выравнивания волокна. Вращение оправки при низких оборотах (<250 об/мин) приводит к образованию случайно ориентированных волокон из-за поведения полимерной струи. Когда заряженный полимерный раствор испускается иглой, внутренние заряды и аэродинамические силы вызывают хаотичный эффект взбивания, который используется для укладки хаотичного расположения волокон на оправку^33,34. Этот эффект взбивания можно преодолеть, увеличив скорость вращения оправки выше 1 800 об/мин. Волокна, нанесенные на оправку с такой высокой частотой вращения, демонстрируют выровненную структуру, потому что скорость поверхности достаточна для эффективного противодействия любому поперечному движению, проявляемому взбивающим волокном. Важно отметить, что при использовании высоких скоростей оправки это может нарушить работу окружающего воздуха, что может оказать неблагоприятное влияние на выработку стабильного конуса Тейлора.

Высокопористые криогенные каркасы получают путем заполнения оправки сухим льдом при температуре -78,5 °С. Это снижает температуру оправки и способствует конденсации и замерзанию капель воды на поверхности. Образованные кристаллы демонстрируют пики, которые выходят из поверхности оправки, а волокна осаждаются по всем вершинам. После того, как кристаллы льда сублимируются, на оправке^35,36 остается пористая структура волокон. Вес и хрупкость кристаллов ограничивают возможность создания пористых выровненных волокон, так как слишком высокие скорости оправки (>250 об/мин) приводят к отделению кристаллов и волокон от оправки из-за чрезмерных центростремительных и аэродинамических сил. При таком способе можно столкнуться с трудностями из-за хрупкости образующихся конструкций. Необходимо соблюдать осторожность при обращении с оправкой, а также при последующем обращении с лесами, потому что конструкции склонны к сплющиванию при сжатии и складыванию при извлечении из жидкостей. Существует также вероятность того, что растворы, которые успешно электроспинируются без криогенной оправки, могут быть фатально нарушены изменением температуры и кристаллическими структурами. При криопрядении количество льда, образующегося на поверхности оправки, сильно зависит от влажности, что приводит к изменчивости конечного результата. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить процесс электропрядения в корпусе для контроля окружающей среды.

Чтобы оценить клеточные характеристики на этих каркасах, необходимо предварительно простерилизовать материал. Существует множество вариантов стерилизации полимеров, включая химические, радиационные методы и методы на основе нагрева^37,38. Важно оценить эффективность каждого метода и пригодность как для использования материала, так и для самого материала. В этом протоколе используется стерилизация в 70% этаноле перед лиофилизацией, обработкой плазмы и погружением в 1% раствор Anti-Anti. Использование этанола позволяет денатурировать и обезвоживать белки и микроорганизмы, не разрушая при этом материал PCL³⁷. Использование более сильных растворителей может привести к растворению PCL. Плазменное покрытие было включено в этот метод в первую очередь для повышения гидрофильности PCL, которая, как известно, гидрофобна, и улучшения прикрепления клеток ^39,40. Удобно то, что это также работает как этап вторичной стерилизации, но необходимо соблюдать осторожность при хранении скаффолдов в стерильной среде до и после плазменной обработки. Этот метод доказал свою пригодность для исследований in vitro с использованием сред, обработанных антибиотиками. Однако для применения in vivo необходимо рассмотреть более надежные варианты, такие как воздействие этиленоксида (EtO) и гамма-излучения. После проведения стерилизации клетки могут быть засеяны на каркас и могут быть применены стандартные методы клеточного культивирования для формирования 3D-культур клеток in vitro.

Важно отметить, что значения жесткости должны быть отнесены к различным микроструктурам, сформированным внутри каркасов. Сыпучий материал (PCL) остается постоянным между лесами. Таким образом, жесткость сыпучего материала не изменяется между группами. Криогенные каркасы демонстрируют гораздо меньшую жесткость, чем другие группы, из-за сниженной связности внутри волоконной матрицы, что можно увидеть в таблице 1. Считается, что редуцированная связность вызывает деформацию с преобладанием изгиба, в отличие от деформации с преобладанием растяжения внутри волокнистой структуры⁴¹. Интересно, что жесткость каркаса не сильно зависит от размера волокон в случайной и криогенной группах. Тем не менее, продольная жесткость выровненных волокон показывает значительно большую зависимость от размера волокон, при этом модуль Юнга при деформации 0-2% составляет 27,94 ± 8,63 МПа для малых волокон и 46,94 ± 3,48 МПа для крупных волокон. Из-за растягивающего характера испытания на растяжение это означает более высокую объемную плотность PCL в продольном поперечном сечении. Необходимо повторить, что представленные здесь механические данные являются макромасштабным механическим снимком волокнистых архитектур. Дальнейшая микромеханическая характеристика была бы полезна для полного понимания механических воздействий на клеточном уровне.

В этот метод были включены как случайные, так и выровненные архитектуры для сравнения изотропной и анизотропной морфологии. Степень выравнивания волокон можно наблюдать на изображениях SEM на рисунке 2 и анализе волокон, представленном на рисунках 2 и 3. Анизотропные свойства наблюдаются во многих тканях организма. В частности, это обычно наблюдается в выровненных клеточных структурах, таких как те, которые обнаруживаются в мышечных и нервных тканях. Выровненные структуры из полимерных волокон обеспечивают возможность повторения этих выровненных структур in vitro^42,43. Как было описано ранее, функция клетки чувствительна к морфологическим и механическим изменениям, поэтому следует провести дальнейший функциональный анализ клеток, связанных с каркасом, чтобы определить биологическое влияние каждого типа скаффолда.

По сравнению с другими существующими методами изготовления скаффолдов, этот метод обеспечивает простой способ создания микромасштабных каркасных структур со сравнительно высоким контролем над механическими свойствами и морфологией. Альтернативные методы изготовления каркасов PCL, такие как разделение фаз, выщелачивание солей и вспенивание газа, позволяют осуществлять морфологический контроль с точки зрения пустотного пространства и размера пор. Тем не менее, поры и структурная геометрия остаются в основном теми же 44,45,46,47. Таким образом, такие качества, как уровень изотропии, не могут быть изменены так же легко по сравнению с электропрядением. Гидрогелевые материалы, популярные для производства скаффолдов, обеспечивают средства для изменения жесткости полимерной подложки путем изменения уровня сшитых полимерных цепей⁴⁸. Также можно печатать на 3D-принтере различными методами, обеспечивая превосходный контроль над морфологией^. Тем не менее, достижение масштабного разрешения электроспиннинга в биосовместимых гидрогелевых материалах остается проблемой, которую необходимо практически реализовать^50,51. Электропрядущие каркасы широко использовались в исследованиях в области тканевой инженерии в течение последнего десятилетия, и внедрение новых материалов и применений с различными типами клеток постоянно изучается. В то время как постоянно разрабатываются новые материалы для электропрядильных каркасов, возможности для дальнейшей биологической характеристики существующих электропрядильных материалов и методов сохраняются. Описанный метод предложен в качестве способа, облегчающего биологическое исследование in vitro, так как он непосредственно применим к основным методам культивирования клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 мм пуансон для биопсии	Acuderm	P1025
15 мл Falcon Tube	Thermo-scientific	339650
20 мл стеклянный флакон	Fisherbrand	11513542
48 луночный планшет для клеточной культуры	Greiner Bio-one	677180
Anti-Anti 100X	Gibco	15240062
хлороформ	Acros Organics
DAPI	Sigma-aldrich	D9542
Eagles Минимальная необходимая среда	Gibco	11090081
Электроспиннер	IME Technologies	EC-DIG
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	GE Healthcare	SH30071.03
Золото-палладиевый распылетель Напыление	Emscope	SC500A
HepG2 элемент линия	Sigma-aldrich	85011430
гексафторизопропанол (HFIP)	Manchester Organics	G26383
L-глютамин 200 мМ	Gibco	25030081
MEM заменимые аминокислоты	Gibco	11140050
метанол	Acros Organics	11984591
пенициллин-стрептомицин 10 000 ед/мл	Gibco
Фаллоидин	Abcam	ab176754
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Sigma-aldrich	P4417-100TAB
Плазменный коатер	Harrick Plasma	PDC-002
Поликапролактон (в среднем MW 80,000)	Sigma-aldrich	440744
Шприц из ПТФЭ	Fisherbrand	12941031
Сканирующий электронный микроскоп	Hitachi	S4700
T75 Колба для культур	Corning	CLS430641
Трипановый синий (0,4%)	Gibco	15250061