Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов

7.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61053

⸱

4 мая 2020 г.

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

Лантипептидные синтезы катализует многоступенчатые реакции во время биосинтеза пептидных натуральных продуктов. Здесь мы описываем непрерывный, снизу вверх, серо-дейтерий обмена масс-спектрометрии (HDX-MS) рабочий процесс, который может быть использован для изучения конформации динамики lanthipeptide синтезетаз, а также других аналогичных ферментов, участвующих в пептид природного продукта биосинтеза.

Аннотация

Масс-спектрометрия обмена водородом дейтерия (HDX-MS) является мощным методом биофизической характеристики ферментно-конформативных изменений и ферментно-субстратных взаимодействий. Среди его многочисленных преимуществ, HDX-MS потребляет только небольшое количество материала, может быть выполнена в почти родных условиях без необходимости фермента / субстрата маркировки, и может обеспечить пространственно решенную информацию о ферментной конформации динамики даже для крупных ферментов и мультипротеин комплексов. Метод инициируется путем разбавления фермента интереса в буфер, подготовленный в D2O. Это вызывает обмен протия в пептидных аминах (N-H) с дейтерия (N-D). В желаемых точках обмена, реакция aliquots утоляются, фермент протеолизирован в пептиды, пептиды разделены ультра-производительной жидкой хроматографии (UPLC), и изменение массы каждого пептида (из-за обмена водорода на дейтерий) регистрируется MS. Количество поглощения дейтерия каждым пептидом сильно зависит от местной среды склеивания водорода этого пептида. Пептиды, присутствующие в очень динамичных регионах дейтерия ферментного обмена очень быстро, в то время как пептиды, полученные из хорошо упорядоченных регионов, проходят обмен гораздо медленнее. Таким образом, скорость HDX сообщает о местной конформациальной динамике ферментов. Возмущения к уровням поглощения дейтерия в присутствии различных лигандов могут быть использованы для карты лигандовых связывающих участков, выявления алостерических сетей и понимания роли конформациальной динамики в функции ферментов. Здесь мы проиллюстрировали, как мы использовали HDX-MS, чтобы лучше понять биосинтез типа пептидных натуральных продуктов, называемых лантипептидами. Лантипептиды – это генетически закодированные пептиды, которые пост-переводно модифицируются крупными, многофункциональными, конформно-динамическими ферментами, которые трудно изучать с помощью традиционных подходов структурной биологии. HDX-MS обеспечивает идеальную и адаптируемую платформу для изучения механистических свойств этих типов ферментов.

Введение

Белки являются структурно динамические молекулы, которые образец различных конформаций на временных масштабах, начиная от фемтосекундного масштаба вибрации связи для перестановки целых белковых доменов, которые могут произойти в течениемногих секунд 1. Эти конформные колебания часто являются критическими аспектами функции фермента/белка. Например, конформациальные изменения, вызванные связыванием лигандов, часто критически важны для модуляции функции ферментов, либо путем организации активных остатков участка, необходимых для катализа, определения сайтов связывания субстрата в последовательных кинетических механизмах, защиты реактивных промежуточных веществ от окружающей среды, либо путем модуляции функции ферментов через алостерические сети. Недавние исследования также показали, что конформативная динамика может быть сохранена на протяжении всей эволюции и что возмущения к сохраненным молекулярным движениям могут быть коррелированы с изменениями в специфичности субстрата и появлением новых функций фермента2,3.

В последние годы масс-спектрометрия обмена водородом-дейтерия (HDX-MS) быстро стала мощным методом для зондированиятого,как конформациальные ландшафты белка реагируют на возмущения, такие как связывание лиганда или мутагенез4,5,6,7. В типичном эксперименте HDX-MS(рисунок 1),протеин интереса помещен в буфер подготовленный в D2O, который вызывает замену растворителя-обменяемых протонов с deuteria. Скорость обмена амиде moiety пептидных связей сильно зависит от рН, местной аминокислотной последовательности, а также от местной структурнойсреды амиде 8. Амидес, которые занимаются водородными взаимодействиями связи (например, присутствующих в α-хеликах и β-листах), обмениваются медленнее, чем амида в неструктурированных регионах белка, которые подвергаются воздействию растворителя. Таким образом, степень поглощения дейтерия является отражением структуры фермента. Ферменты, которые являются конформациально динамическими, или которые проходят структурные переходы на связывание лиганда, как ожидается, даст измеримый ответ HDX.

Механистическая основа медленного обменного курса структурированного амеда показана на рисунке 25,8,9. Для того, чтобы пройти HDX, структурированная область должна сначала временно попробовать развернутую конформацию, так что молекулы растворителя, которые катализингировать обмен HDX через определенный кислотный/базовый химический механизм, имеют доступ к обмениваемому амиду. В конечном счете, относительные величины химического обменного курса(kchem)и скорость складывания и складывания(kopen и kclose)определяют курс HDX, измеренный вэксперименте 5,8. Из этой простой кинетической модели ясно, что степень поглощения дейтерия будет отражать лежащую в основе конформацию динамики (определяемую kopen и kclose). Большинство экспериментов HDX-MS проводятся в рабочем процессе снизу вверх, где, после реакции обмена, белок интереса переваривается в пептиды и поглощение дейтерия каждым пептидом измеряется как увеличениемассы 7. Таким образом, HDX-MS позволяет сопоставить возмущения с ферментной конформациальной динамикой на локальном пространственном масштабе пептидов, что позволяет исследователю оценить, как возмущение изменяет динамику в различных областях фермента, представляющих интерес.

Преимущества подхода HDX-MS для выяснения структурной динамики белка многочисленны. Во-первых, метод может быть выполнен с небольшим количеством родного белка или на белковых комплексах в системах с четвертичных структур10. Это даже не обязательно для фермента препарат, используемый ванализе, чтобы быть высоко очищены 11,12, до тех пор, как снизу вверх HDX-MS рабочий процесс обеспечивает достаточное количество уверенно определены пептиды, которые охватывают белковую последовательность интереса. Кроме того, HDX-MS может предоставить информацию о конформации динамики в почти родных условиях без необходимости для сайта конкретных белковой маркировки, как будет использоваться в одной молекулыфлуоресценции исследований 13, и нет предела размера белка или белковогокомплекса,которые могут быть исследованы (что делает подходы, такие как ядерный магнитный резонанс "NMR" спектроскопиисложной) 7,14. Наконец, время решены HDX-MS методы могут быть использованы для изучения внутренне неупорядоченых белков, которые трудно изучить с рентгеновскойкристаллографии 15,16,17,18. Основным ограничением HDX-MS является то, что данные имеют низкое структурное разрешение. Данные HDX-MS полезны для указания на то, где меняется конформациальная динамика, и для выявления связанных конформных изменений, но они не часто дают большое представление о точном молекулярном механизме, обуговающем наблюдаемое изменение. Недавние достижения в сочетании методов диссоциации захвата электронов с данными белка HDX-MS показали обещание для картирования сайтов обмена на одиночныеаминокислотные остатки 19,но последующие биохимические и структурные исследования все еще часто необходимы, чтобы обеспечить ясность структурных моделей, переадресуемых данными HDX-MS.

Ниже представлен подробный протокол для разработки анализа HDX-MS20. Протоколы подготовки образца, представленные ниже, должны быть в целом применимы к любому белку, который демонстрирует хорошую жалкость в aqueous буферах. Более специализированные методы подготовки образца и HDX-MS рабочие процессы доступны длябелков,чем нужно провести анализ в присутствии моющего средства илифосфолипидов 21,22,23,24. Инструментальные настройки для сбора данных HDX-MS описаны для четырехугольного масс-спектрометра высокого разрешения в сочетании с жидкой хроматографической системой. Данные аналогичной сложности и разрешения могут быть собраны на любой из ряда коммерчески доступных жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) систем. Предоставляются также ключевые аспекты обработки данных с использованием коммерчески доступного пакета программного обеспечения. Мы также представляем руководящие принципы для сбора и анализа данных, которые соответствуют рекомендациям, сделанным более широким сообществом HDX-MS12. Описанный протокол используется для изучения динамических структурных свойств HalM2, лантипептид синтетазы, которая катализа multistep созревания антимикробного пептида натуральныйпродукт 20. Мы иллюстрировать, как HDX-MS может быть использован для выявление сайтов связывания субстрата и алостерических свойств, которые ускользали от предыдущей характеристики. Несколько других протоколов по белку HDX-MS были опубликованы в последниегоды 25,26. Вместе с настоящей работой, эти более предыдущие вклады должны обеспечить читателю некоторую гибкость в экспериментальном конструкции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка дейтетерированных реагентов и растворов ферментного запаса

  1. Подготовка реагентов, необходимых для реакции HDX (включая любые буферы, соли, субстраты, лиганды и т.д.), как 100–200x концентрированные фондовые растворы в D2O (99,9% атомовая фракция D). Подготовь не менее 50 мл решения буферного запаса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для характеристики HalM2 были подготовлены следующие решения: 500 мМ MgCl2, 100 мМ трис (2-карбоксетил)фосфин (TCEP), 750 мМ АТФ (в буфере HEPES), 800 мМ HEPES pD 7.1, 500 МКМ Хала2 и 500 мМНП.
  2. Заморозить и лиофилизировать фондовые растворы до сухости.
  3. Повторное растворение в D2O, и повторить цикл лиофилизации по крайней мере еще одно время, чтобы заменить как многие из сменных протонов с дейтеронами, как это возможно.
  4. Отрегулируйте pD дейтетерированного буферного запаса HEPES до желаемого значения с концентрированным NaOD/DCl, имея в виду следующие отношения27:
    figure-protocol-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость ХДХ сильно зависит от pL раствора (pL и pH или pD)5. Различные пакеты решений буферного запаса должны быть подготовлены, сохранены и использованы идентичным образом, чтобы избежать небольшого дрейфа pL между экспериментами.
  5. Рассчитайте количество каждого реагента, необходимого для анализа 300 МКЛ HDX, и храните в качестве одноразовых алицитов при -80 градусов по Цельсию.
  6. Подготовь концентрированный раствор ферментного запаса (100–200 мкм) в буфере хранения ферментов с помощью центробежного фильтра(Таблица материалов)или эквивалентного устройства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный буфер и центробежный фильтр молекулярного веса отсечения будет зависеть от белка / фермента интереса. HalM2 хранится в 50 мМ HEPES, рН 7,5, 100 мМ ККл и 10% глицерол. Для приготовления концентрированного фермента использовались 10 фильтров kDa.
  7. Aliquot фермента в одноразовые порции использования и хранить при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть остановкой. Все фондовые решения, описанные в разделе 1, могут быть подготовлены до реакции HDX. При хране при -80 градусов по Цельсию, большинство ферментов / дейтетерированных фондовых растворов будет стабильным в течение многих месяцев.

2. Калибровка объема утоления HDX

  1. Подготовь реакцию 300 МКЛ HDX в D2O с использованием дейтетерированных реагентов и концентрированных запасов ферментов, подготовленных в разделе 1.
    1. Используйте окончательную концентрацию фермента в 1–5 МКМ.
    2. Используйте окончательную дейтетерированную буферную концентрацию HEPES не менее 50–100 мМ.
    3. Убедитесь, что концентрации других компонентов достаточны для поддержания желаемой активности/функции ферментов.
  2. Приготовьте 1 л раствора для затухления HDX (100 мМ фосфат, 0,8 м гуанидина-HCl, рН 1,9). Заморозить и хранить как в 50 мл порций (для долгосрочного запаса) и 1 мл порций (для одноразовых aliquots).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав буфера утоления будет зависеть от фермента, который используется в этапе протеолиза рабочего процесса HDX-MS снизу вверх (шаг 3.3.3). Утоляемый буфер, данный здесь, совместим с пепсином, наиболее часто используемым протеазой для HDX-MS. Если используется другая протеаза, обратитесь к поставщику protease, чтобы обеспечить совместимость буфера.
  3. Калибруйте объем буфера утоления, необходимый для регулировки конечного pL закалынной реакционной смеси HDX до значения показания счетчика pH 2.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель H / D обменный курс пептида amide N-H облигаций рН-зависимый процесс, который подлежит как кислоты и базы катализа. Минимальный обменный курс происходит при значении рН 2,5 (показания рН-метра No 2,3 за смесь 50:50 H2O:D2O). Таким образом, окончательное значение pL около 2.5 сведет к минимуму обмен водородом назад, который происходит во время анализа снизу вверх LC-MS, тем самым сохраняя ярлык дейтерия в пептидах.
    1. Смешайте 50 МКЛ реакционной смеси HDX из шага 2.1 с 50 МКЛ буфера утоления и измерьте ЛП затухленной смеси с помощью микротипа электрода.
    2. Увеличьте объем раствора для утоления по мере необходимости для корректировки конечного показания счетчика рН до значения 2,3.
    3. После того, как будет определен соответствующий объем утоления, повторите процесс затухления несколько раз, используя свежие 50 алицитов из реакции HDX (шаг 2.1), чтобы гарантировать, что последовательный окончательный pL достигается при добавлении фиксированного количества буфера утоления.

3. Подготовка эталонных образцов и оптимизация рабочего процесса LC-MS снизу вверх

  1. Подготовка неопределёненных эталонных образцов для белка, представляющих интерес для трипликата в трубках 0,5 мл. Убедитесь, что условия окончательной смеси реакции идентичны условиям, используемым в подлинных реакциях HDX (шаг 2.1), за исключением того, что реакции готовятся в H2O с использованием реагентов, также подготовленных в H2O.
  2. Утолить образцы, как в шаге 2.3, добавив соответствующий объем буфера утоления для корректировки окончательного рН до 2,5. Вспышка заморозить образцы в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию до готовности к анализу.
  3. Проанализируйте протеченные образцы ферментов с помощью рабочего процесса LC-MS снизу вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением этих шагов система LC-MS, используемая для сбора данных, должна быть должным образом откалиброванной и готовой к использованию. Сроки и температура всех этапов рабочего процесса LC-MS снизу вверх должны строго контролироваться, чтобы свести к минимуму различия в обратном обмене между образцами. С MS приборов, используемых в этом протоколе (Таблица материалов и Вспомогательная информация), большинство шагов можно контролировать с помощью программного обеспечения инструмента. Для обеспечения сбора точных репликаций рекомендуется автоматизировать как можно больше этапов в рабочем процессе.
    1. Удалите индивидуальный эталонный образец фермента (подготовленный в шаге 3.2) из морозильной камеры и оттаивать при 37 градусов по Цельсию в течение 1 мин в водяной бане.
    2. Ровно через 2 минуты после удаления образца из морозильной камеры и оттаивания в колонку ультравысокой жидкой хроматографии (UPLC) (2,1 х 30 мм, 300, 5 МКМ), содержащую стационарную фазу, функционирующую с пепсином (кислотно-стабильная протеаза).
    3. Усваиваете образец со скоростью потока 100 мкл/мин в течение 3 мин при 15 градусов по Цельсию, используя 0,1% мякоть кислоты в H2O (рН 2,5) в качестве растворителя.
    4. Соберите пептические пептиды, как они elute от пепсиновой колонки на C18 ловушки колонке, состоявшейся на 0,4 градусов по Цельсию, чтобы свести к минимуму обратного обмена.
    5. Перейдите десальтированные пептитические пептиды из столбца ловушки в аналитическую колонку C18 (1 мм х 100 мм, 1,7 МКМ, 130 з) при 0,4 градуса цельсия для разделения септических пептидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.3.3'3.3.5 могут быть автоматизированы определенными системами LC-MS, используемыми для получения данных HDX-MS. Кроме того, эти шаги могут быть выполнены независимо, имея в виду, что сроки и температура каждого шага должны быть тщательно проверены для достижения последовательно низкой обратной обмена.
    6. Elute колонка C18 с ацетонитрилом/водой/0,1% системы растворителя миновой кислоты. Оптимизация градиента LC для белка, представляющих интерес для того, чтобы максимизировать разделение и сохранить этикетку дейтерия в пептидах peptic.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент elution подробности представлены в вспомогательной информации.
    7. Подвергаю пептическое пищеварение электроспрей-ионизации (ESI) масс-спектрометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные условия, предусмотренные в вспомогательной информации, обеспечат достаточную ионизацию для большинства пептитических пептидов.
      1. После ионизации в инструменте MS, выполнить ионные разделения подвижности газовой фазы с использованием азота в качестве буферного газа для повышения пиковой мощности метода.
      2. После разделения ионные мобильности подвергните ионы прекурсора пептического пептида рабочему процессу MSE, включающему чередующиеся циклы низкой энергии столкновения (4 V) и высокую энергию столкновения (21–40 V).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чередующиеся режимы низкого и высокого столкновения позволяют сбор данных MS (низкая энергия столкновения) одновременно с данными MSMS (высокая энергия столкновения). Это, в свою очередь, позволяет со временем соединять ионы-прекурсоры с их соответствующими ионами фрагментов. Эта корреляция необходима для уверенной идентификации пептида, описанной в разделе 4.
      3. Обнаружить пептидный прекурсор и фрагмент ионы с помощью масс-анализатора с разрешая силой не менее 20000.
      4. Одновременно с сбором данных приобретайте данные MS для внешнего стандарта «Glu-1»-fibrinopeptide B (GluFib).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс MS, описанный в шаге 3.3.7, называется протоколом MSE. Полные инструментальные настройки протокола MSE, который подходит для снизу вверх HDX-MS, представлены в вспомогательной информации.
    8. Оцените качество данных LC-MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя описанный выше протокол и инструментальные настройки, представленные в Вспомогательной информации,эталонные образцы должны производить полную ионную хроматограмму с максимальной интенсивностью сигнала приблизительно 1 x 108. Там должно быть много peptic пептидов eluting между 3'9 мин (Рисунок 3A q C).
    9. Ввимить 40 МКЛ пустых образцов (0,1% мимической кислоты в воде) для очистки пепсинов и аналитических столбцов С18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, 2'3 пробелов должно быть достаточно.
    10. Повторите шаги 3.3.1'3.3.9 для каждого из тройного эталонного образца белка.

4. Обработка справочных данных и определение пептидного списка

  1. Проанализируйтенеобработанные данные MS E (шаг 3.3.7) с помощью программного обеспечения протеомика(Таблица материалов). Используя программное обеспечение протеомика, перейдите в библиотеки | Белковая последовательность Databanks для определения базы данных белка путем импорта аминокислотной последовательности белка интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага заключается в поиске справочных данных MS для peptic пептидов, полученных из белка интереса, и использовать данные MSMS (приобретенные одновременно с данными MS) для проверки любых мнимых пептидных идентификаций.
  2. Назовите белковую последовательность интереса. Импорт белковой последовательности (в формате FASTA). Программное обеспечение будет выполнять в силико переваривания белка базы данных для создания списка пептидов, которые будут использоваться для поиска данных LC-MS.
  3. Определите параметры обработки (расположенные под меню Библиотеки). Выберите Electrospray MSE в качестве типа получения данных. В поле Lock Mass for Charge 2 введите 785.8426 для m/z для2 иона «Glu-1»-fibrinopeptide B (GluFib) и нажмите на финиш.
  4. Определите параметры рабочего процесса (расположенные под меню Библиотеки).
    1. Выберите Electrospray MSE для типа поиска. В соответствии с рабочим | Заголовок запроса поиска базы данных, выберите белок базы данных, созданный в шаге 4.2 в поле Databank.
    2. Измените реагент первичного дайджеста на неспецифический и очистите поле реагентов фиксированного модификатора, удерживая кнопку Ctrl при нажатии на карбамидометил C.
  5. Укажите каталог выходных данных, переориентаясь на | автоматизация настройки | Идентичность E. Проверьте коробки для Apex 3D и пептид 3D выход и ионный учет выход и указать желаемый каталог.
  6. Обработать данные эталонной выборки.
    1. На левой бар инструмент протеомической платформы рабочего пространства, создать новую пластину, право нажав на Microtiter плиты. Выделите три скважины в пластине микротитр (по одной для каждого эталонного образца, собранного в разделе 3). Левый нажмите в один колодец, удерживайте и перетащите на три колодца.
    2. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите добавить необработанные данные. В окне, которое появляется, перейдите к каталогу, содержащем три справочных файла из раздела 3, и выберите их одновременно.
    3. Нажмите дальше и выберите параметры обработки, определенные в шаге 4.3. Нажмите на следующий и выберите параметры рабочего процесса, определенные в шаге 4.4. Затем нажмите на финиш.
  7. После того, как необработанные данные, параметры обработки и параметры рабочего процесса будут назначены каждой скважине на пластине, скважины будут казаться синими. Выберите скважины, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс последних необработанных данных. Нажмите на правый нижний угол окна, чтобы отслеживать обработку данных. Как только сообщение Не отображается задание для запуска, обработка полностью завершена.
  8. После завершения обработки данных скважины в плите позеленеет. Нажмите правой кнопкой мыши на скважины и выберите результаты рабочего процесса представления. Для каждого файла справочных данных откроется отдельное окно.
  9. Осмотрите данные, чтобы убедиться, что большинство сигналов MS в данных эталонной выборки были успешно отображены на пептиды, предсказанные от пищеварения белка интереса. Соотвеные пептиды будут окрашены в синий цвет в спектре выходных данных(рисунок 4). Дважды нажмите на фильтр OK и убедитесь, что процентный охват превышает 99%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке выход данных будет автоматически сохранен с расширениемфайла (raw_data_file_name_IA_final_peptide) в каталоге, указанном в шаге 4.5.
  10. Импорт протеомического программного обеспечения в HDX-обработка программного обеспечения(Таблица материалов)для дополнительного порогового значения.
    1. Нажмите на данные в левом углу окна программного обеспечения для обработки HDX. Нажмите на результаты импорта PLGS и нажмите на значок добавления. Выберите обработанные файлы данных из шага 4.9, переместив их в соответствующий каталог.
    2. Нажмите на Далее и укажите следующие параметры: минимальные последовательные ионы ≥ 2, массовая ошибка - 5 промилле, и порог файла - 3. Нажмите на финише.
  11. Удовлетворив пороговые параметры, сохраните проект HDX. Все данные HDX будут импортированы в этот проект для анализа и отображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обмен образцами дейтерия, описанными в следующем разделе, должен быть обработан идентичным рабочим процессом LC-MS. Поэтому, прежде чем приступить к анализу HDX (раздел 5), убедитесь, что подготовка образца (раздел 2), рабочий процесс снизу вверх LC-MS (раздел 3) и рабочие процессы обработки данных (раздел 4) обеспечивают желаемую воспроизводимость и последовательность охвата целевого белка. Если какой-либо из этих процессов необходимо изменить для улучшения охвата, рекомендуется вернуться к шагу 2.1, подготовить свежие справочные образцы в трипликате, а также повторить разделы 2'4 (при внесении необходимых корректировок в протокол), чтобы гарантировать, что каждый пептид может быть воспроизведен и обнаружен.

5. Проведение реакций HDX

  1. Подготовь рабочее пространство для реакций HDX.
    1. Предварительно алицит утолить буфер в правильно помечены 0,5 мл труб. Подготовьте различные трубки для каждой точки времени, каждой репликации, и каждое биохимическое состояние, которые будут проанализированы. Используйте соответствующий объем буфера утоления от шага 2.2, необходимого для корректировки окончательного показания счетчика рН 50 МКЛ части реакции HDX на значение 2,3.
    2. Кратко центрифуга 0,5 мл ванны для передачи всех утолить буфера на дно трубки. Поместите трубки на лед.
    3. Заполните небольшой Dewar с жидким азотом и держать рядом с рабочей области.
  2. Подготовь реакции HDX. Убедитесь, что имеется достаточный объем реакции для сбора нужного количества точек обменного времени (одна алицита 50 КЛ для каждой желаемой точки времени). Соберите по крайней мере 4–5 точек времени в масштабе времени от 3 до 4 порядков (например, время утоления 15 с, 60 с, 300 с (5 мин), 1800 с (30 мин) и 14 400 с (4 ч) обеспечивают адекватное покрытие динамики обмена для большинства ферментов).
    1. Предварительно смешайте все дейтетерированные компоненты (минус фермент) из шага 1.1 в D2O.
    2. Для каждого биохимического состояния, которые должны быть изучены (свободный фермент, фермент и лиганд, фермент и ингибитор и т.д.), подготовить HDX реакции, по крайней мере в три раза.
    3. Инкубировать реакционной смеси в контролируемой температурой водяной бане при температуре 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут до добавления фермента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент должен быть подготовлен в качестве концентрированного фондового раствора (100–200 МКМ, шаг 1,6), с тем чтобы свести к минимуму добавление протия в анализ HDX.
    4. После добавления фермента в окончательную концентрацию 1'5 МКМ, запустите таймер. Тщательно и быстро смешайте раствор с помощью пипетки из 200 мл, чтобы гарантировать равномерное равномерное равномерное распределение фермента в образце.
    5. При желаемом обмене времени точек, удалить 50 йл aliquots от реакции HDX и смешивать быстро и равномерно с предварительной aliquoted, ледяной утоления буфера в 0,5 мл трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы смешивания и смешивания должны быть как можно более точными и воспроизводимыми для обеспечения быстрого достижения желаемого окончательного утоления PL 2.3 во всех образцах. Сохранение затухания буферного льда холодной поможет свести к минимуму обратно обмен на денатурации фермента.
    6. Сразу же после закалки образца HDX, крышка трубки и вспышки заморозить в жидком азоте.
    7. Продолжайте собирать точки времени до тех пор, пока все анализы не будут завершены, а затем перенесите образцы в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию для хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть остановкой. После сбора всех точек времени HDX, образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до готовности к анализу LC-MS. В идеале, тройной HDX реакции должны быть выполнены для всех биохимических состояний, представляющих интерес в тот же день. Как минимум, все репликации HDX реакций для данного биохимического состояния должны быть запущены параллельно в тот же день.
  3. После сбора всех утоленых точек времени HDX, подвергте образцы оптимизированному рабочему процессу LC-MS снизу вверх, разработанному, как описано в шаге 3.3. Ввисьт образцы HDX в рандомизированном порядке с соответствующим количеством пробелов между образцами, чтобы гарантировать, что любой пептид переноситься является минимальным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные HDX не должны собираться в режиме MSE. Таким образом, сегмент энергии высокого столкновения (шаг 3.3.7.2) должен быть удален из цикла пошлины MS. Это должно быть единственное изменение, внесенное в рабочий процесс, описанный в шаге 3.3.
  4. Оцените качество собираемых данных HDX.
    1. Убедитесь, что хроматографические пики, присутствующие в общей иононограмме неутерированных эталонных образцов, появляются в то же время удержания в дейтетерированных образцах (как на рисунке 3Д'Ф).
    2. Убедитесь, что масс-спектры, суммированные в течение определенных промежутков времени из эталонных и дейтетерированных образцов, свидетельствуют о дейтетерации (т.е. сдвиг изотопной оболочки отдельных пептидов к более высоким значениям м/з в дейтетерированных образцах -рисунок 6).

6. Обработка данных HDX

  1. Импорт данных HDX в проект HDX, созданный в шаге 4.11, нажав на Data | MS Файлы в верхней бар инструментов.
    1. Нажмите на New State и New Exposure по мере необходимости для определения биохимических состояний (например, свободного фермента, фермента и лиганда и т.д.) и времени воздействия дейтерия, соответственно, которые имеют отношение к анализу.
    2. Нажмите на New Raw, чтобы выбрать файлы данных HDX для анализа. Назначьте соответствующее время обмена и биохимическое состояние каждому импортируемому файлу необработанных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть импортированы и обработаны партиями, или все сразу. Добавление данных в проект не отменяет анализ, который ранее проводился в рамках этого проекта.
  2. Как только файлы данных были добавлены, нажмите закончить, чтобы начать обработку данных. После короткой задержки программное обеспечение спросит, хочет ли пользователь сохранить данные, прежде чем продолжить работу. Нажмите да.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная обработка может занять до нескольких часов в зависимости от того, сколько образцов анализируется, сколько пептидов находится в окончательном пептидном списке (шаг 4.10), размер хроматографического окна, и частота спектрального приобретения.
  3. При желании измените параметры обработки в меню Configuration, чтобы изменить параметры поиска ионов. Убедитесь в том, чтобы использовать те же параметры поиска ионов для всех данных в данном проекте.

7. Анализ и визуализация данных HDX

ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения первоначальной обработки необработанных данных (шаг 6.2) программное обеспечение для обработки HDX будет иметь обнаруженные пептиды из пептидного списка (сгенерированные в шаге 4.10) в каждом из исходных файлов данных, которые были проанализированы. После того, как распределение изотопов для пептида в списке находится в сыром файле данных, программное обеспечение для обработки HDX представляет каждый изотоп с «палкой» (как на рисунке 6C'E). Относительная итензия палочек для данного пептида затем используются для расчета поглощения дейтерия по отношению к эталонным спектрам. В то время как программное обеспечение для обработки HDX делает замечательную работу по правильному назначению "палочек" большинству пептидов, по-прежнему потребуется значительное ручное кураторирование значений поглощения дейтерия.

  1. Анализ значений поглощения пептидного дейтерия
    1. Выберите первый пептид в пептидном списке и откройте сложенный спектральный участок из меню Views. Прокрутите вверх и вниз в сложенном окне участка спектра, чтобы увидеть спектры массы выбранного пептида в качестве функции времени обмена дейтерия(рисунок 7D,E).
    2. Назначайте палочки и неприсоздайте палочки по мере необходимости с помощью щелчков мыши, чтобы убедиться, что правильное распределение изотопов было расположено в данных и что каждый пик изотопа был назначен (назначенные палочки будут отображаться синим цветом). Нажатие на любой из спектров в сложенном спектральном участке(рисунок 7D,E) позволит пользователю назначить / неподзначить палочки в окне активного просмотраданных (рисунок 7C).
    3. Проверьте назначения палки для каждого состояния заряда, свергая состояние заряда в верхней части сложенного спектрального окна участка.
    4. Повторите шаги 7.1.1-7.1.3 для каждого биохимического состояния интереса. Биохимическое состояние также можно переключать в верхней части сложенного спектрального окна участка. Для наиболее точных измерений разницы поглощения дейтерия убедитесь, что палочки назначаются для одного и того же набора состояний заряда для каждого биохимического состояния.
    5. Повторите шаги 7.1.1-7.1.4 для каждого пептида в пептидном списке.
    6. Проверьте стандартное отклонение значений поглощения пептидного дейтерия с помощью карты покрытия.
      1. Доступ к карте покрытия из меню Views, которое отображает каждый пептид в пептидном списке, отображенном вдоль аминокислотной последовательности белка интереса(рисунок 8C). Цвет пептидов в соответствии с относительным стандартным отклонением (единицы Da).
      2. Визуально ищите карту для выброса пептидов с высоким относительным стандартным отклонением. Нажмите на выброс пептидов на карте покрытия, чтобы заполнить сложенные спектральные участки(рисунок 8B) и окно просмотра данных(рисунок 8A) с целевым пептидом.
      3. Используя сложенный спектральный участок, тщательно проверяйте, что все состояния заряда и все время точки выброса пептида имеют надлежащим образом назначенные палочки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чаще всего пептиды с большими стандартными отклонениями (Nogt;0.3 Da) имеют изотопные пики, которые не были надлежащим образом назначены палочки программного обеспечения (как указано на рисунке 8B). Назначение любых недостающих палочек, как правило, позволяет относительно стандартное отклонение пептида быть сокращены до lt;0.3 Da.
      4. Скрыть пептид из списка, если относительно стандартное отклонение не может быть уменьшено до менее чем 0,3 Да.
  2. Данные о разнице экспорта HDX между двумя биохимическими состояниями для отображения на структурную модель белка интереса.
    1. Отображение разницы интересов на карте покрытия. Нажмите правой кнопкой мыши на карте покрытия, чтобы экспортировать данные о разнице в .csv файл. Экспорт государственных данных (в .csv формате) путем навигации по данным | Данные об экспортном состоянии в основной инструментарии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующее форматирование данных о разнице и файлов государственных данных предоставляется в вспомогательной информации.
    2. Импорт данных разницы, данные положения, и архив pdb протеина интереса в Deuteros28. Выберите 99% интервал доверия, выберите сумму включенияи обработать данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MATLAB должны быть установлены на ПК для того, чтобы запустить Deuteros. Deuteros будет использовать измерения репликации в наборе данных для расчета стандартного отклонения данных поглощения для каждого пептида. Это стандартное отклонение будет использоваться для определения интервала доверия для значительного обмена, который будет отображаться на участках.
    3. В соответствии с PyMOL Options, выберите экспортное поглощение | экспорт для создания скрипта Pymol для карты регионов значительной курсовой разницы на структуру pdb белка интереса с помощью программного обеспечения PyMOL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя рабочий процесс, описанный в этом протоколе, 99% интервал доверия для значительной разницы поглощения дейтерия для данного пептида в одной точке времени, как правило, 0,3-0,5 Да. 99% интервал доверия к разнице, суммируются по всем пунктам обменного времени, как правило, 0,7-1,0 Da.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Необходимо оценить качество протеолитического пищеварения и воспроизводимость рабочего процесса для каждого набора выборочных инъекций. Таким образом, перед выполнением анализов HDX-MS необходимо создать эффективные условия для протеолиза белка интереса, для разделения пептидов с использованием обратной фазовой жидкой хроматографии и ионные подвижности газовой фазы, а также для обнаружения пептидов с использованием MS. Для этого следует сначала изукомить эталонные образцы белка интереса (собранные при отсутствии дейтерия...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Рабочий процесс HDX-MS, представленный в этом протоколе, обеспечивает удивительно надежную платформу для картирования пространственного распределения структурно динамических элементов в белках и для изучения того, как эти динамики меняются в ответ на возмущение (связывание лиганда, фермент мутагенез и т.д.). HDX-MS имеет ряд явных преимуществ по сравнению с другими структурными подходами биологии, которые обычно используются для исследования конформации динамики. Примечательно, что требуется лишь небольшое количество бел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Фондом природы Квебека и технологией, Канадским фондом инноваций и фондами стартапов Университета Макгилла.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
[glu-1]-фибринопептид B (Glu-Fib)BioBasicNA
0,5 мл Amicon Ultracel 10k центробежное фильтрующее устройство (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
ацетонитрилFisherA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
муравьиная кислотаThermo Fisher28905
гуанидин-HClVWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
Магния хлоридSiGMA-Aldrich63068-250G
ХлоридкалияBioBasicPB0440
фосфат калияBioBasicPB0445
TCEP гидрохлоридTRC КанадаT012500пептид был синтезирован по запросу
Наименование материала/ Оборудование>CompanyНомер в каталогеКомментарии/Описание
software
DeuterosAndy M C Lau, et alверсия 1.08
DynamXWatersверсия 3.0
MassLynxWatersверсия 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersверсия 3.0.3
PyMOLSchrö dingerверсия 2.2.2
Наименование материала/ Оборудования<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии/Описание
>Прибор и оборудование
ACQUITY UPLC BEH C18 аналитическая колоннаВоды186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-columnWaters186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX ManagerWaters
Microtip pH-электродThermo Fisher13-620-291
Waters Enzymate BEH колонка или Pepsin solumnWaters186007233 Waters Synapt
Воды
G2-Si

Ссылки

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Конформационная динамика белковвзаимодействия фермента с субстратомультраэффективная жидкостная хроматографиямасс-спектрометрический анализизмерение поглощения дейтериябиосинтез лантипептидовструктурная характеристика белков
Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.