Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Электрохимилуминесценция на основе анализ для MeCP2 Белковые варианты

28K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61054

⸱

22 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

В этой статье

Краткое содержание

Электрохимилюминесценционный иммуноанализ (ECLIA) является новым подходом к количественному выявлению эндогенных и экзогенно применяемых белков meCP2 вариантов, который производит высококоличественные, точные и воспроизводимые измерения с низкой внутри- и межанализу ошибки в широком рабочем диапазоне. Здесь описан протокол MeCP2-ECLIA в формате 96 скважин.

Аннотация

ECLIA является универсальным методом, который способен количественно эндогенных и рекомбинантных белков в формате 96-наилучшим образом. Чтобы продемонстрировать эффективность ECLIA, этот анализ был использован для анализа внутренних уровней MeCP2 в ткани мозга мыши и поглощения TAT-MeCP2 в человеческих кожных фибробластов. MeCP2-ECLIA производит высокоточные и воспроизводимые измерения с низкой погрешностью внутри- и межанализа. Таким образом, мы разработали количественный метод для оценки вариантов белка MeCP2, которые могут быть использованы в высокопроизводительных экранах.

Введение

Электрохимилюминесценция иммуноанализ (ECLIA) основана на процессе, который использует этикетки, предназначенные для испускания люминесценции, когда электрохимически стимулировали. Это широко применимый метод количественного обнаружения биологических аналитов в основных отраслях промышленности и научных исследованиях, пищевой промышленности, а также в клинической диагностике1. Обычно используется одноразовая 96-колодная пластина с углеродными чернилами. Эти электроды выступают в качестве твердой фазы носителя для иммуноанализ. Вторичное антитело спрягается с электрохимилюминесцентной этикеткой, и при применении электричества к системе срабатывает световое излучение химической этикетки. Ультра-низкий шум заряда связаны устройства (CCD) записывает интенсивность света, который прямо пропорциональна антигена связаны с захватом антитела в результате количественной оценки целевого анализ образца2. По сравнению с фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA), ECLIA считается выгодным, поскольку он предлагает более высокую чувствительность и воспроизводимость, а также лучшую автоматизацию и консистенцию3.

Здесь мы проанализировали уровень связывающего белка метил-CpG 2 (MeCP2) в образцах происхождения человека и мурина, а также различные варианты рекомбинантного белка с использованием недавно разработанной системы ECLIA. MecP2 — это x-связанный нуклеиновой кислотно-связывающий белок, который, как известно, взаимодействует с метилированными последовательностями ДНК. Этот белок был вовлечен в регуляцию экспрессии генов4,,5. Потеря функции мутаций в гене, который кодирует этот белок являются основными виновниками вызывая синдром Ретт (RTT), тяжелое расстройство нервнойсистемы 6. Другой MeCP2 связанных расстройство, синдром дублирования MECP2, также приводит к неврологическим симптомам, которые могут перекрываться с RTT7. Примечательно, что женщины в основном страдают от RTT в то время как мужчины в основном страдают от синдрома дублирования MECP2 6,7.

Эти расстройства связаны с недостаточным или избыточным уровнем MeCP2 соответственно в центральной нервной системе (ЦНС). Таким образом, варианты лечения RTT, которые включают повышение уровня MeCP2 в ЦНС необходимо, чтобы избежать пагубных последствий, связанных с превышением MeCP27. В связи с этим, очень чувствительныи и точные количественной оценки уровня белка MeCP2, как это предусмотрено системой ECLIA, имеет решающее значение для развития RTT, а также MECP2 исследования синдрома дублирования. Точные измерения эндогенных и экзогенных уровней MeCP2 из клеточных линий человека и образцов тканей мыши, а также рекомбинантный белок, состоящий из изоформы человека MeCP2 (также известный как изоформный e1), и минимальный N-терминальный ВИЧ-TAT трансдукционный домен (TAT-MeCP2), который имеет потенциал, чтобы пересечь гематоген-барьер8,представлены в этой работе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Разрешение на закупку биопсии кожи в исследовательских целях было получено от Комитета по этике исследований человека Детской больницы в Вестмиде, Австралия. Согласие на эксперименты на животных было получено от Федерального министерства науки, исследований и экономики Австрии, которые были выполнены в соответствии с местными правилами защиты животных (ГЗ: 66.009/0218-II/3b/2015).

ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип системы ECLIA изображен на рисунке 1.

1. Выбор антител

  1. Оцените соотношение сигнала к шуму для ряда различных антител MeCP2 и определите наилучшую силу сигнала и самую высокую специфичность в сочетании первичного моноклонального антитела MeCP2 мыши (клон Mec-168) и антитела обнаружения обнаружения кролика Polyclonal MeCP2 (обычное). Для вторичного антитела, используйте системно-специфические антитела (Таблица материалов), который также был экспериментально проверен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 дает обзор всех проверенных антител во время разработки MeCP2-ECLIA и их проверенных диапазонов разбавления.
ФункцииИмяКлонРазбавления
ОсновнойМышь, анти-MeCP2Mec-1681:500-1:10,000
ОсновнойМышь, анти-MeCP24B61:250-1:4,000
ОсновнойМышь, анти-MeCP2Мужчины-81:500-1:4,000
ОсновнойМышь, анти-MeCP21B111:500-1:4,000
ОсновнойКролик, анти-MeCP2D4F31:500-1:4,000
ВторичногоКролик, анти-MeCP2Поликлональных1:2,000-1:20,000
ВторичногоКролик, анти-MeCP2Поликлональных1:2,000-1:20,000
ОбнаруженияSULFO-TAG помечены анти-кроликПоликлональных1:500-1:1,000

Таблица 1: Список антител и используемых рабочих разбавлений.

  1. Кроме того, используйте каждую пару meCP2-антител, которые хорошо работают с обычными ELISA.

2. Лечение HdFs с белком синтеза TAT-MeCP2

ПРИМЕЧАНИЕ: TAT-MeCP2 был рекомбинантно выражен в escherichia coli и очищен с помощью стандартных хроматографических методов, как ранее описано8 и хранится при -80 градусов по Цельсию.

  1. Плита 1 х 106 человека дермальной фибробласт (HDF) клетки в 100 мм блюд и расти клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2, пока они не достигнут около 90% confluency.
  2. Вынвейте один флакон белка синтеза TAT-MeCP2. Оттепель на льду и аккуратно перемешать.
  3. Разбавить TAT-MeCP2 до конечной концентрации 500 нм в 50 мл носителей культуры HDF.
  4. Удалите средства массовой информации из 100 мм посуды и инкубировать клетки с 500 нм TAT-MeCP2 при 37 градусах Цельсия для различных инкубационных периодов до 24 ч.
  5. Удалите раствор TAT-MeCP2 из ячеек. Вымойте клетки 2x с предварительно подогретых Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS).
  6. Лечить клетки с 2 мл 0,05% трипсин-EDTA раствор в течение 5 мин при 37 КС10.
  7. Добавьте 6 мл средств массовой информации культуры HDF, чтобы инактивировать трипсин и собрать клетки в трубках 15 мл.
  8. Пелле клетки центрифугации при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Удалить супернатант и мыть клетки 2x с ледяной DPBS. Храните гранулы на льду и приступайте к подготовке образца.

3. Подготовка образцов

  1. Лисаты HDF
    1. Определите самые высокие уровни белка MeCP2 с помощью метода REAP для субклеточной фракционирования в цитоплазмамические и ядерные субклеточные отсеки в соответствии с Suzuki et al.11. Ограничьте фракционирование не более чем шестью образцами за эксперимент.
  2. Мышиные мозговые лисаты
    1. Приготовьте 100 мл каждого гипотонного лисисового реагента и буфера извлечения.
      1. Для гипотонического лисис-реагента хорошо перемешайте 10 мМ HEPES, 1,5 мм хлорида магния и 10 мм хлористого калия.
      2. Для буфера извлечения хорошо смешайте 20 мМ HEPES, 1,5 мм хлорида магния, 0,42 М хлористого натрия, 0,2 мм ЭДТА и 25% (v/v) глицерола.
      3. Отрегулируйте рН обоих буферов до 7,9.
      4. Добавьте 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 1x коктейль-ингибитор протеазы в оба буфера свежего. Охладите на льду перед использованием.
    2. Приостановить 100 мг общего мозга мыши (напряжение: C57BL/6J, дикий тип мужчины и женщины и B6.129P2 (C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous мужского и гетерозиготного женского пола; возраст: 4'8 недель) в 1 мл ледяного гипототониса реагент.
    3. Гомогенизировать мозг с предварительно охлажденной Dounce все стекла ткани гомогенизатор 15 ударов гомогенизатора А (свободный, для большого клиренса) и B (жесткий, для небольшого зазора), соответственно.
    4. Перенесите гомогенизированные клетки в чистую трубку и центрифугу при 10 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта (или держите его в качестве цитоплазматической фракции для дальнейшего использования).
    5. Приостановите гранулы в 140 л из буфера экстракции на 100 мг исходного материала. Поместите трубку в предварительно охлажденный термоблок и аккуратно перемешайте в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
    6. Центрифуга трубки при 16000 г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант (т.е. ядерную фракцию) в новую предварительно охлажденный трубку и храните при -80 градусов до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка лизатов, полученных из мозга мыши и HDFs может быть оценена по анализу белка BCA.

4. Протокол MeCP2-ECLIA

  1. Приготовление стирального раствора, блокирование буфера и асси разбавите (день 1)
    1. Добавьте 500 л Tween от 20 до 1 л PBS, чтобы подготовить 0,05% Tween 20 в растворе PBS, энергично перемешайте и наметите как «стиральное решение».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что используется только свежеприготовленный буфер для стирки.
    2. Подготовьте блокирующее решение 3% блокатора A(Таблица материалов)в фосфатно-буферизированном сольнике (PBS). Смешайте нежным помешивая, фильтр стерилизовать и держать их в холодильнике до использования в течение максимум двух недель.
    3. Добавьте 5 мл блокирующего раствора в 10 мл PBS для подготовки разбавителя (1% блокатор а в PBS).
  2. Покрытие высокосвязных пластин
    1. Выньте 96-хорошо многослойной одной пластины высокой связывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокосвязные пластины имеют большую связывающую способность и, следовательно, больший динамический диапазон, чем стандартные пластины с гидрофобными поверхностями.
    2. Оттепели моноклональные мыши анти-MeCP2 антитела на льду и смешать 0,67 л антитела с 4 мл PBS (1:6,000 разбавления антител в PBS). Vortex антитела решение хорошо перемешать и этикетки трубки как "покрытие решение".
    3. Тщательно распределите 25 зл покрытия раствора в нижнем углу каждой скважины с помощью многоканального пипетатора; это называется методом покрытия раствора. Нажмите 96-ну хорошо пластины осторожно с каждой стороны, чтобы убедиться, что покрытие решение охватывает дно каждого колодца.
    4. Запечатать тарелку клейкой фольгой и инкубировать тарелку в холодильнике при цене 4 градусов по Цельсию на ночь (12–16 ч).
  3. Блокировка (день 2)
    1. Вынуть тарелку из холодильника и удалить фольгу.
    2. Удалите раствор покрытия антител, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите на тарелку на бумажном полотенце, чтобы удалить все покрытие раствор из колодцев.
    3. Добавьте 125 л блокирующего раствора на скважину. Запечатайте пластину снова и поместите ее на орбитальный микроплитный шейкер.
    4. Инкубировать тарелку в течение 90 минут при комнатной температуре при постоянной тряске при 800 об/мин.
  4. Подготовка стандартов и образцов
    1. Во время инкубации подготовьте стандарты белка MeCP2 и/или TAT-MeCP2 и различные образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Lysis буфер, используемый для стандартного разбавления, должен быть таким же, как и в исследуемых образцах.
    2. Выняйте один флакон из раствора протеинового запаса MePC2 и/или TAT-MeCP2 (250 мкг/мл), щелочаций мозга мыши и лисатов HDF от -80 градусов по Цельсию. Оттепель их на льду.
    3. Разбавить стандартный складраствор (MeCP2 и/или TAT-MeCP2) в чистых трубках в соответствии с таблицей 2.
    4. Разбавить образцы в буфере лисиса следующим образом: 1–20 мкг щели мозга мыши на 25 л буфера из лисиса и 0,25-1 мкг лизата HDF на 25 л буфера лисиса. Подготовьте достаточный объем каждого образца для проведения анализа в тройном.
СтандартныйКонцентрацииРазбавления
Стандарт 11800 нг/мл1,08 л стандартный фондовый раствор 148,92 л люсиса буфера
Стандарт 2600 нг/млБуфер 50 Зл Стандарт 1 100 Л Люсиса
Стандарт 3200 нг/млБуфер 50 Зл Стандарт 2 и 100 л люсиса
Стандарт 466,67 нг/мл50 зЛ Стандартный 3 й 100 l L Lysis буфер
Стандарт 522.22 нг/млБуфер 50 Зл Стандарт 4 и 100 л люсиса
Стандарт 67,41 нг/млБуфер 50 Зл Стандарт 5 и 100 л люсиса
Стандарт 72,47 нг/млБуфер 50 Зл Стандарт 6 и 100 л люсиса
Стандарт 80,82 нг/млБуфер 50 Зл Стандарт 7 и 100 Л Люсиса
Стандарт 90,27 нг/мл50 зЛ Стандарт 8 и 100 л люсиса буфер
Стандарт 100 нг/млБуфер 150 Л Lysis

Таблица 2: Стандартная серия от 0 до 1800 нг/мл.

  1. Добавление образцов и стандартных решений
    1. Удалите блокирующее решение, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце, чтобы удалить все блокирующие растворы из колодцев.
    2. Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
    3. Добавьте 25 ул стандартов и образцов в нижний угол скважины с помощью одного канала пипетки.
    4. Печать пластины и инкубировать пластину в течение 4 ч при комнатной температуре с постоянной тряски на 800 об/мин.
  2. Антитела немаркированного обнаружения
    1. Оттепель поликлональных кролика анти-MeCP2 антитела на льду. Разбавить антитела 1:6,000 в расса разбавить раствор.
    2. Удалите стандарты и образцы, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
    3. Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
    4. Добавьте 25 зл немаркированных антител обнаружения к каждому колодцу с многоканальным пипеттором. Печать пластины и инкубировать его в течение 1 ч с постоянной тряски при 800 об/мин при комнатной температуре.
  3. Специфические конъюгированные антитела
    1. Вынизить из холодильника специфическое вторичное антитело(Таблица материалов)и поместите его на лед. Разбавить антитела 1:666.67 в ассе разбавитель раствора и аккуратно перемешать.
    2. Удалите свободные немаркированные вторичные антитела, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
    3. Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
    4. Добавьте 25 зл и специфические конъюгированные антитела(Таблица материалов)к каждому колодцу с многоканальным пипеттором. Печать пластины и инкубировать в течение 1 ч с постоянной тряски при 800 об/мин при комнатной температуре.
  4. Чтение тарелки
    1. Удалите свободные спряжение антитела (Таблица материалов), щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
    2. Вымойте тарелку 3x с 150 зл стирки раствора.
    3. Добавьте 150 зл 1x Tris основе золото читать буфер (Таблица материалов) с сурфактант, содержащий трипропиламин в качестве со-реценгенанта для светогенерации на пластину. Избегайте любых пузырьков воздуха, используя обратные методы пипетки.
    4. Поместите пластину на платформу обнаружения микроплит(Таблица материалов)и немедленно начните измерение. Используйте настройки для приобретения пластины 96 колодцев.
    5. Захват электрохимилуминеционных сигналов встроенной камерой CCD в системе обнаружения электрохимилуминесценции(Таблица материалов)и запись количества сигналов, которые соответствуют относительному световому агрегату (RLU) и прямо пропорциональны интенсивности света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При электрохимической стимуляции метка рутения, привязанная к углеродовому электроду, излучает свет люминесценции на уровне 620 нм. Анализ данных с помощью программного обеспечения, сопровождаемого инструментом(Таблица материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принцип системы ECLIA описан на рисунке 1. Стандартные кривые для двух вариантов MeCP2 отображаются на рисунке 2. Точная количественная оценка была возможна в широком диапазоне концентраций (1–1800 нг/мл). На рисунке 3были проанализированы уровни lysates MeCP2, полученные из мозга мыши и HDFs. Выражение MeCP2 в ядерных лисатах мозга от гетерозиготных, диких и нокаутовых мышей сравнивалось на рисунке 3A,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для измерения эндогенных уровней MeCP2, рекомбинантных MeCP2 и TAT-MeCP2 была разработана 96-колодная пластина ECLIA. Было показано, что потеря функции белка MeCP2 приводит к синдрому RTT6, для которого лечение в настоящее время ограничивается симптомам управления и физической терапии. Одним из перспективных путей лечения является так называемая белковая заместительная терапия, где уровни MeCP2 могут быть тистрированы до их необходимой концентрации12,,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы очень благодарны доктору Брижит Штурм за ее поддержку инструментом ECLIA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,4-Дитиотреитол (DTT)Sigma-AldrichD9779Реагент для гипотонического лизиса, экстракционный буфер
Bio-Rad Protein Assay Концентрат красителяBio-Rad Laboratories Inc.500-0006Обнаружение предварительного анализа образцов
AB SULFO-TAG меченый анти-кроличийДиагностика мезомасштабаR32AB-1
Инструментальный стенд для обнаружения антител 4.0Программное обеспечениеобнаружения
DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029Подготовка образцов
Dulbecco' s PBS (стерильный)Sigma-AldrichD8537-500MLПодготовка образцов, Промывочный раствор, Раствор для покрытия
EDTASigma-AldrichEDSЭкстракционный буфер
Фетальная бычья сывороткаSigma-AldrichF9665Подготовка образцов
ГлицеринSigma-AldrichG2025Экстракционный буфер
Gold Reading Buffer T (1x) с поверхностно-активным веществомMeso Scale ДиагностикаR92TGMeCP2 ECLIA протокол
HEPESSigma-AldrichH3375Реагент для гипотонического лизиса, экстракционный буфер
KIMBLE Dounce набор для измельчения тканейSigma-AldrichD8938Лабораторный шейкер для подготовки образцов
, качающееся движение (низкая скорость)GFL3014MeCP2 ECLIA протокол
Магния хлорид гексагидрат (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Реагент для гипотонического лизиса, экстракционный буфер
MeCP2 (человек) Рекомбинантный белок (P01)Abnova CorporationH00004204-P01Клеточная обработка
Microseal B sealBio-Rad Laboratories Inc.MSB1001для пломбирования пластин
Monoclonal Anti-MeCP2, полученный у мыши, клон Mec-168, очищенный иммуноглобулинSigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075Антитела, Покрытие Раствор
Блокатор MSDA Диагностика мезомасштабаR93BA-4Блокатор
MSD SECTOR Imager 2400Диагностика мезомасштабаI30AA-0MeCP2 Протокол ECLIA
Multi-Array 96-луночный планшетМезомасштаб ДиагностикаL15XB-3/L11BX-3MeCP2 Протокол ECLIA
Пенициллин-стрептомицинgibco от Life Technologies15140122Подготовка образцов
поликлонального анти-MeCP2, полученного в кроликеEurogentec S.A.специально разработанноеантитело
Хлорид калия (KCl)Merck KGaA1049361000реагент для гипотонического лизиса
Первичный AB Mouse, анти-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296Антитела
первичной AB мыши, анти-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411
Антитело первичной AB мыши, анти-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075
Антитела первичной AB мыши, анти-MeCP2 (мужчины-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235
Антитела первичного AB кролика, анти-MeCP2 (D4F3)Технология клеточной сигнализации3456S; RRID:AB_2143849
Коктейль ингибиторов протеазы антител (100X)Sigma-Aldrich8340Реагент для гипотонического лизиса, экстракционный буфер
вторичный AB, кролик, анти-MeCP2Eurogentec S.A.индивидуальноеантитело
вторичное AB, кролик, анти-MeCP2Merck07-013Антитело
Хлорид натрия (NaCl)Экстракционный буферSigma-AldrichS3014
SULFO-TAG Меченый антикролик антитело (козье)Meso Scale ДиагностикаW0015528Sантитела
TAT-MeCP2 слитый белоксобственного производстваКлеточная обработка
Трипсин ЭДТА 0,25% (1X)gibco от Life Technologies25200-056Клеточная обработка
Tween 20Sigma-AldrichP9416Моющий раствор
для мезомасштаба

Ссылки

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MeCP296Tween 20Blocker AMeCP2Tris Base Gold
Электрохимилуминесценция на основе анализ для MeCP2 Белковые варианты
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.