Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммуноокрашивание яичек дрозофилы цельной горы для 3D конфокального анализа крупных сперматоцитов

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61061

⸱

27 августа 2020 г.

 ,  , 
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем улучшенный протокол для получения и иммуноокрашивания яичек Drosophila, подходящий для конфокальной микроскопии, а также позволяющий воспроизводимую и надежную маркировку. Мы иллюстрируем этот протокол 3D-представлением и количественной оценкой экспериментов по колокализации на больших сперматозоидах S4-S5.

Аннотация

Яички Drosophila являются мощной модельной системой для изучения биологических процессов, включая биологию стволовых клеток, ядерную архитектуру, мейоз и развитие сперматозоидов. Однако иммуномаркировка всего яичка дрозофилы часто связана со значительной неравномерностью окрашивания из-за проникновения антител. Раздавленные препараты лишь частично преодолевают проблему, так как это снижает качество 3D анализов. Здесь мы описываем протокол цельного крепления с использованием NP40 и гептана во время фиксации вместе с иммуномаркировкой в жидких средах. Он сохраняет объем, пригодный для конфокальной микроскопии, вместе с воспроизводимой и надежной маркировкой. Показаны различные примеры 3D-восстановления ядер сперматоцитов из конфокальных срезов. Воспроизводимость внутри- и межясыков позволяет проводить 3D-количественную оценку и сравнение флуоресценции между отдельными клетками разных генотипов. Мы использовали различные компоненты внутриядерной структуры MINT (Mad1-содержащую Intra Nuclear Territory), а также два компонента, связанных с комплексом ядерных пор, чтобы проиллюстрировать этот протокол и его приложения на крупнейших клетках яичка, сперматоцитах S4-S5.

Введение

Яички дрозофилы являются ценной моделью для изучения ядерной архитектуры. В митотических сперматозоидах ядерный объем в значительной степени занят хроматином. Эти клетки проходят четыре раунда деления, производя кисту из 16 первичных сперматоцитов. В течение следующих нескольких дней сперматоциты проходят через 6 стадий развития (S1-S6), значительно увеличиваясь в объеме, примерно в 20 разв 1,2раза. Они также меняют свою ядерную морфологию. Очертания ядра, выявленные ламином Dm0, становятся неровными и показывают глубокие инвагинации1,3. Это сопровождается обширными изменениями экспрессии генов и модификациями в организации хроматина1,4,5,6,7. Межфазные хромосомы хорошо определены на стадии S4-S5, образуя три различные массы, соответствующие 2 основным двухвалентным аутосомам и паре X-Y, состыковывающейся с ядрышком.

Mad1 был первоначально изолирован как ключевой компонент митотического контрольно-пропускного пункта (рассмотрен в8). В интерфазе он описывается как расположенный в основном в ядерной оболочке, но также и в нуклеоплазме9,10,11. В Drosophila testis мы сообщили, что Mad1 занимает видное место в нуклеоплазме, тесно связанной с двумя основными аутосомными массами хроматина и в меньшей степени с хроматином XY. Мы определили эту хроматин-ассоциированную структуру как MINT (Mad1-содержащая внутриядерная территория)12. Четыре других белка были связаны с MINT в сперматоцитах: нуклеопорин Mtor/Tpr, пептидаза SUMO Ulp1, белок митотической контрольной точки Mad2 и субъединица поликомбоподобного комплекса Raf212.

Чтобы завершить описание MINT, нам нужно было использовать антитела, и мы столкнулись с техническими проблемами, обычно встречающимися с иммуноокрашиванием в яичках: плохая проницаемость, приводящая к значительной неравномерности окрашивания в глубине яичка, особенно в крупных сперматоцитах. Sподавлял препараты, увеличивая доступ антител, но приводил к сжатию изображений, ограничивая 3D-анализы и предотвращая измерение количественной флуоресценции, включая колокализацию. Проблема проникновения антител также может быть решена с помощью пермеабилизирующих агентов, таких как 0,3% Na дезоксихолат13,но эта процедура в наших руках не дала воспроизводимых результатов. Поскольку мы провели много экспериментов по совместной маркировке, мы хотели улучшить протокол пермеабилизации. Комбинация 1% NP40 плюс гептан привела к большей воспроизводимости, особенно при изучении крупных сперматоцитов.

Этот протокол выполняет фиксацию и иммуноокрашивание яичек во суспензии, улучшая качество образца, а также повышая воспроизводимость и делая его пригодным для конфокальной микроскопии. Мы использовали протокол для лучшего определения пространственных отношений определенных белков ядерной оболочки с нуклеоплазмическими структурами крупных сперматоцитов. Этот метод позволит лучше изучать изменения, которые сопровождают развитие сперматоцитов, например, динамические структурные изменения ядра, включая хроматин, нуклеоплазму и ядерные поры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Коллекция яичек дрозофилы

ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые самцы (0-15 ч после эклозии) необходимы для исследования диплоидных половых клеток (т.е. сперматогонии и сперматоцитов).

  1. Выбирайте молодых мух как можно больше, чтобы свести к минимуму помехи от развивающихся сперматид.
  2. Обезболивают мух при кратковременном воздействии углекислого газа и переносят на налетную площадку14,15.
  3. Под рассекающим микроскопом (10-кратное увеличение) используйте щипцы для удаления головы.
  4. Перенесите от 5 до 10 обезглавленных мух в 100 мкл буфера Рингера (183 мМ KCI, 47 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCI, 1 мМ ЭДТА, полный ингибитор белка, рН 6,8) на стеклянной горке с силиконовым покрытием на черной фоновой подложке.
  5. С рассекающим микроскопом при 40-кратном увеличении используйте одну пару щипцов числа 5, чтобы удерживать муху между грудной клеткой и брюшком, а с другими щипцами оттягивайте брюшную полость от грудной клетки. Быстро изолируют яички и прилегающие ткани от туши мухи15 и помещают в новую каплю буфера Рингера на том же слайде.
  6. Как только все яички будут готовы, очистите яички от оставшихся тканей (дополнительной железы и наружных половых органов).
  7. Удалите из капли лишний буфер, содержащий рассеченные яички. Как правило, используйте пипетку p200 с наконечником 10 мкл, установленным поверх наконечника 200 мкл. Это позволяет удалить избыток жидкости через небольшое отверстие. Поместите каплю 4% параформальдегида фиксатора поверх капли, содержащей рассеченные яички, а затем быстро перенесите яички в пробирку, содержащую свежий фиксаторный раствор.

2. Фиксация параформальдегида

  1. Перед применением готовят 2 мл фиксаторного раствора: 600 мкл 4% параформальдегида, разведенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) с 30 мкл NP40 20% плюс 1200 мкл гептана в 2 мл силиконизированной микроцентрифужной трубки. Используйте 4% параформальдегид в PBS, приготовленный в 600 мкл аликвот и хранящийся при -20°C.
    Внимание: Гептан и параформальдегид токсичны и должны обрабатываться в вытяжном капюшоне. Распоряжайтесь ими в соответствии с правилами принимающего института.
  2. Перенесите яички с помощью микропипетки p200 с широким наконечником диафрагмы в раствор PFA/NP40/гептан. Встряхните трубку вверх и вниз в течение 30 с вручную. Продолжайте фиксацию яичек на ротационном смесителе при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Остановите вращающийся смеситель и поместите трубку в стойку для труб, чтобы обеспечить разделение фаз и чтобы яички осели на дно трубки.
  4. Удалите весь гептан и фиксаторный раствор и быстро промойте яички три раза с 1x PBS.
  5. Переложить в чистую индивидуальную трубку 200 мкл. Выполните все инкубации в этих небольших трубках, чтобы свести к минимуму количество используемых антител.
  6. Удалите лишний буфер с помощью микропипетки 200 мкл с прикрепленными наконечниками P200 и P10. Позаботьтесь о том, чтобы не аспирировать яички.
  7. Держите яички в 1x PBS на льду, пока все образцы не будут готовы.

3. Окрашивание антител в растворе

  1. Откажитесь от PBS и оставьте яички в 0,3% PBS-T в течение 30 мин при комнатной температуре для пермеабилизации клеточных мембран.
  2. Предварительно инкубировать в том же буфере плюс 5% нормальную козью сыворотку (NGS) в течение 1 ч.
  3. Добавьте 200 мкл первичного антитела, разведенного в 0,3% PBS-T плюс 5% NGS(Таблица материалов).
  4. Инкубировать первичное антитело в течение ночи при 4 °C (или комнатной температуре) с легким перемешиванием на коромысле.
  5. Промыть 3 раза по 0,3% PBS-T в течение 15 мин на коромысле комнатной температуры. Дайте яичкам осязить на дно трубки под действием силы тяжести.
  6. Добавьте 200 мкл вторичного антитела, разбавленного 1:500 из конъюгированного ряда DyLight.
  7. Инкубируют вторичное антитело в темной камере в течение 4 ч при комнатной температуре.
  8. Промывайте в 0,3% PBS-T в течение 15 мин на коромысле комнатной температуры. Затем повторяют с 0,2% PBS-T и 0,1% PBS-T, каждый раз в течение 30 мин на коромысле при комнатной температуре. Сделайте окончательную стирку в 1x PBS в течение 30 минут, чтобы удалить моющее средство.
  9. Добавьте 180 мкл раствора DAPI при 1 мкг/мл в 1x PBS в течение 15 мин. Стандартный раствор составляет 10 мг/мл вH2O. Избегайте приготовления стока раствора в PBS, который может уменьшить сигнал окрашивания DAPI на диффузном хроматине в более крупных сперматоцитах.
  10. Стирайте по 3 раза по 5 минут.
  11. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистом слайде.
  12. Аспирируйте яички и положите их на слайд. Предварительное промывание широкоугольного наконечника отверстия с 0,1% PBS-T предотвращает прилипание яичек к наконечнику. Удалите излишки PBS.
  13. Добавьте каплю (примерно 100 мкл) Citifluor AF1.
  14. Осторожно поместите стеклянную крышку поверх ткани, заботясь о том, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха.
  15. Запечатайте крышку на слайде прозрачным лаком для ногтей.
  16. Наблюдайте за слайдами на микроскопе.

4. Анализы колокализации

  1. Получайте конфокальные изображения. Мы использовали конфокальный микроскоп Zeiss LSM 710 (63x План Апохроматическое масло) с z-разрешением 0,5 или 1 мкм.
  2. Выделите разные клетки из независимых яичек.
  3. Импорт изображений в программное обеспечение для обработки (например, Imaris).
  4. Определите ядро путем ручной сегментации, чтобы исключить соседние ядра. Использовать программное обеспечение Coloc; он собирает коэффициенты корреляции Пирсона (PCC) внутри всего объема между 2 флуорофорами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Основным препятствием для получения адекватного окрашивания яичек Drosophila является ограниченная проникаемость антител, которая была частично устранена с помощью раздавленных препаратов, но за счет ограничения 3D-анализов (например, 3D-представление или мера колокализации). Процедура позволяет равномерно маркировать и сохраняет объем всех клеток яичка. Здесь мы сосредоточили иллюстрацию метода на 3D-представлении сперматоцитов S4-S5, так как они являются самыми крупными клетками и, следовательно, более чувствительны к ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает метод успешной иммуномаркировки цельноукладных яичек взрослых дрозофил. Как сообщалось в других процедурах, необходимо использовать молодых мужчин (мы даже сократили возраст до менее чем 20 часов после эклозии), чтобы свести к минимуму наличие развивающейся спермы, которая рискует затруднить сперматоциты. Рассечение должно быть быстрым, а разбавление антител должно быть скорректировано для оптимизации отношения сигнал/шум21,22,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим. Веррийзера, Й. Йохансена Х., Охуру за антитела и А. Дебека, Блумингтонский и Венский центры для мух. Спасибо К. Джексону за предложения и стимулирующие дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyOПодарок от А. Дебека (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFPJ Cell Sci. 2011 15 мая; 124(Часть 10):1664-71.
Mtor RNAi VDRCID 110218Венский центр РНК-интерференции дрозофилы
Materials
DAPI ТермоD1306Стоковый раствор должен быть приготовлен в H2O
Dumont #5 Fine Forseps Fine Science Tools
MBP Наконечники для пипеток с широким отверстиемFisherbrand11917744Наконечник с широкой апертурой
Thermo Scientific  0,2 мл Индивидуальная пробиркаThermoAB-0620
2 мл микроцентрифужные пробирки СигмаТ3531-200ЕА Силиконизированный тюбик 2 мл
Цитифтор АФ1ЦитифторАФ1
ДакопенСигмаZ377821-1ЕА 
Нормальная козья сыворотка (NGS)SigmaNS02L-1ML
Параформальдегид 4%SigmaP6148-500G Параформальдегид (4%) растворен в PBS 1X ; аликвота на 600 мл 
PBS 1XThermo14190094DPBS, без кальция, без магния
0,1% (0,2 или 0,3%) PBS-T PBS 1X  содержащий 0,1% (0,2% или 0,3%) Triton X-100
Triton X-100, для молекулярной биологии, SigmaT8787
Antibodies
GFP boosterChromotekgba4881/200
Мышиный анти-Mtor1/40 подарок от J. Johansen, Университет штата Айова
Rat anti-Nup621/200 подарок от H. Ohkura (Университет Эдинбурга, Великобритания
Морская свинка анти-Ulp11/200 подарок от К.. Веррийцера, Университет Эразма, Роттердамский
кролик анти-Raf21/200 подарок от К.. Веррийцера, Университет Эразма, Роттердамская
серия конъюгированных DyLight Thermo1/500 Donkey anti-(морская свинка, мышь, кролик или крыса) в качестве вторых антител

Ссылки

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NP403D
Иммуноокрашивание яичек дрозофилы цельной горы для 3D конфокального анализа крупных сперматоцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.