Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация регуляторных клонов Т-клеток человека

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61075

⸱

17 мая 2020 г.

 , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, New York University School of Medicine, 2Immunobiology and Immunotherapy in Chronic Diseases, Institute for Advanced Biosciences, Université Grenoble Alpes, Inserm U1209/CNRS UMR 5309, 3Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается клонирование и экспансия регуляторных Т-клеток человека для получения жизнеспособного человеческого Treg сверхвысокой чистоты со стабильным деметилированием в Treg-специфичной деметилированной области (TSDR) и специфичными для Treg фенотипическими особенностями.

Аннотация

Известно, что регуляторные Т-клетки человека (Treg) трудно выделить в высокой чистоте, учитывая современные методы обогащения Treg. Эти методы основаны на идентификации Treg с помощью нескольких активационно-зависимых маркеров клеточной поверхности с различными уровнями экспрессии при различных физиологических и патологических состояниях. Таким образом, популяции, выделенные как "Treg", часто содержат значительное количество не-Treg эффекторных клеток (т.е. Teff), которые препятствуют точной фенотипической и функциональной характеристике этих клеток, их геномной и протеомной характеристике, их надежному перечислению при различных состояниях здоровья и заболевания, а также их выделению и расширению в терапевтических целях. Последнее, в частности, остается серьезным препятствием, поскольку непреднамеренная экспансия эффекторных клеток, нацеленных на Treg-релевантные клеточные компартменты (например, CD4+CD25+ Т-клетки), может сделать иммунотерапию на основе Treg неэффективной или даже вредной. В данной работе представлен метод, который обходит проблемы, связанные с популяционной изоляцией и экспансией Treg, и показывает, что генерация клонов-кандидатов Treg с последующим отбором, культивированием и экспансией только тщательно проверенных моноклональных клеток позволяет получить сверхчистый клеточный продукт Treg, который может храниться в культуре в течение многих месяцев. Это позволяет проводить последующие исследования этих клеток, в том числе для возможного терапевтического применения.

Введение

Целью данного протокола является обеспечение возможности размножения in vitro клонального человеческого Treg сверхвысокой чистоты. Выделение популяций, обогащенных Treg, и последующее клонирование позволяет отбирать желаемые фенотипы Treg и расширять их для дальнейшего изучения биологии этих клеток, изучения их потенциальной терапевтической полезности и других экспериментальных применений.

Клонирование Treg даст значительно более высокую чистоту Treg, чем подходы с поликлональной изоляцией и расширением. Это связано с надежным, контролируемым исключением из очищенной популяции Т-эффекторных клеток со сходными или иными фенотипами, включая FOXP3-экспрессирующие (FOXP3intCD45RAnegCD25int) non-Treg и CD4+ CD25+ FOXP3-Teff1, среди прочих. Клональные клеточные линии, полученные с помощью этого подхода, не сталкиваются с проблемой избыточного роста быстро распространяющимися клонами без Трега, что делает очень длительную экспансию (т.е. несколько месяцев) и культивирование клеток in vitro практически невозможным или, по крайней мере, чрезвычайно сложным. Clonal Treg также позволяют проводить обширную проверку их фенотипических особенностей после экспансии, в том числе с помощью методов, признанных стандартными для оценки эпигенетических особенностей, указывающих на добросовестность человеческого природного Treg 1,2,3,4 (например, стабильное деметилирование в TSDR).

Трег-экспансия в основном осуществлялась в форме экспансии поликлональных клеток как в исследовательских, так и в терапевтических целях 5,6,7. Проблемы, связанные с контаминацией Teff, являются серьезным препятствием для успешного внедрения подходов к иммунотерапии на основе клеток Treg. Предыдущие попытки расширения/создания моноклонального Treg в литературе немногочисленны и не смогли продемонстрировать сохранение функций Treg в долгосрочной перспективе8.

Этот метод будет интересен всем, кто изучает клеточные, молекулярные и метаболические свойства истинного человеческого Treg. В частности, сверхчистый продукт Treg, полученный с помощью этого протокола, поддается анализу с использованием геномных подходов. Учитывая относительно низкие скорости расширения, которые характеризуют человеческий Treg в целом, этот метод может быть ограничен в использовании для тех, кто стремится к быстрому расширению огромного количества клеток. Однако, учитывая чрезвычайно высокую чистоту Treg, полученного с помощью этого протокола, меньшее количество Treg может иметь аналогичную или даже лучшую эффективность, чем более крупные расширения поликлональных клеточных линий, которые содержат эффекторные клетки, ограничивающие общий супрессивный потенциал полученного продукта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Настоящий протокол соответствует всем институциональным руководящим принципам, относящимся к этическому проведению исследований с использованием человеческих образцов. Работа с человеческими клетками и другими продуктами человеческой крови должна проводиться как минимум в среде, сертифицированной BSL-2, в соответствии с рекомендациями BLS-2 по безопасности.

1. Преобогащение мононуклеарных клеток периферической крови человека на CD4+CD127loCD25hi cells

ВНИМАНИЕ: Используйте стерильную технику на протяжении всего процесса. Немедленно выбросьте острые предметы в подходящий контейнер для острых предметов. Отбеливайте все, что контактировало с кровью и/или продуктами крови, перед утилизацией. Работа в шкафу биобезопасности.

  1. Получите периферическую кровь человека или продукты крови, предварительно обогащенные человеческими лейкоцитами (т.е. «лейкопаками») путем забора периферической крови или лейкафереза. Обрабатывайте клетки сразу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если невозможно избежать ночного хранения, храните и транспортируйте клетки при комнатной температуре (RT). Избегайте воздействия холода.
  2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) путем градиентного центрифугирования на среде с градиентом плотности, как описано ранее9.
  3. Тщательно подсчитайте ПМК с помощью гемоцитометра или клеточного счетчика. Если возможно, используйте не менее 300 x 106 PBMC для продолжения изоляции Treg.
  4. Ресуспендируйте PBMC в изоляционном буфере (2% объединенная сыворотка AB человека [PHS-AB] с 1,5 мМ ЭДТА в фосфатно-солевом буфере [PBS]) в концентрации 50 x 106 клеток/мл и приступайте к магнитной сортировке в соответствии с инструкциями производителя используемого сортировочного набора. Например, используйте магнитную сортировку клеток (Table of Materials) для отрицательного выделения популяции CD4+CD127lo T-клеток с последующей сортировкой по положительному отбору для CD25+ клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для магнитной очистки Treg можно использовать различные продукты, в том числе с использованием колонок и без них. В качестве альтернативы может быть выполнена флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) с гейтированием на CD127loCD25с высоким содержанием CD4+ Т. Однако полная стерильность невозможна при использовании стандартного оборудования FACS, что создает значительный риск загрязнения. Кроме того, нельзя исключать клеточное напряжение и повреждения, вызванные жидкостной системой, и лазеры прибора могут повлиять на результаты.
  5. Проверьте полученную популяцию, обогащенную Treg, на чистоту путем окрашивания на CD4, CD3, CD127 и CD25 (рис. 1). Для получения точного результата выберите антитело против человеческого CD25, которое распознает CD25-связывающий домен, отличный от того, который используется в сортировочном наборе, например, указанного в таблице материалов. Окрашивайте и фиксируйте клетки с помощью стандартного протокола окрашивания поверхности, такого как описанный в Nowatzky et al.10.

2. Клонирование Treg из предобогащенной суспензии CD4+ Т-клеток человека CD127lo CD25hi

  1. Ресуспендируйте обогащенные Treg (CD4+CD127loCD25hi) клетки, полученные на этапе 1.4, в среде Т-клеток ([TCM]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% стрептомицина/пенициллина, 1% HEPES, 1% заменимых аминокислот и 1% глутамина) с 300 МЕ/мл человеческого рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2) (Таблица материалов) с целью достижения концентрации ~1−3 x 106 клеток/мл и подсчет. Прежде чем продолжить, получите как минимум три отдельных подсчета ячеек и рассчитайте среднее количество ячеек, потому что точный подсчет имеет решающее значение.
  2. Приготовьте одноклеточную суспензию клеток в двух концентрациях: (1) 3 клетки/мл и (2) 6 клеток/мл. Загрузите пять планшетов с круглым дном 96 лунок со скоростью 100 мкл/лунку суспензии 1 и пять планшетов с суспензией 2. При загрузке планшетов соблюдайте осторожность при удержании элементов во взвешенном состоянии, чтобы обеспечить распределение 0,3 и 0,6 ячейки/лунку соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не увеличивайте концентрацию клеток до 1 клетки/лунки, потому что это увеличивает риск получения олигоклональных клеточных линий, а не истинных клонов.
  3. Получить питающие клетки из свежевыделенных аллогенных PBMC человека, полученных методом центрифугирования с градиентом плотности, как описано на шаге 1.2.
  4. Подготовьте не менее 10 x 106 фидерных клеток на каждую клонирующую пластину для облучения путем ресуспендирования человеческих аллогенных PBMC в ТКМ без IL-2 в полипропиленовой пробирке объемом 50 мл в концентрации ~10 x 106 PBMC/мл. Плотно закройте трубку и облучайте с температурой 35 Гр в гамма-облучателе или рентгеновском облучателе.
    Примечание: Облучение вызывает секрецию большого количества цитокинов из питателей, которые способствуют пролиферации Teff, но может отрицательно повлиять на расширение Treg. Затем они будут удалены путем промывки.
  5. Центрифугируйте ячейки при 450 x g и RT в течение 5 мин после облучения и отсасывайте надосадочную жидкость. Промывайте ячейки, повторно суспендируя их в TCM без IL-2, используя как минимум в 10 раз больший объем гранулированной питательной ячейки по сравнению с фильтрующим материалом/PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется определить профиль экспрессии человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) в донорских клетках, подлежащих клонированию. Это может быть сделано с помощью простого окрашивания для одного или нескольких типов HLA, которые распространены в популяции, из которой получен соответствующий донор (т.е. HLA-A2 или HLA-A24). PBMC, используемые в качестве фидерных клеток, не должны экспрессировать этот HLA, чтобы обеспечить повторную идентификацию/изоляцию клеток-мишеней из экспансионных культур до индуцированного облучением апоптоза питателей.
  6. Ресуспендирование облученных и промытых питающих клеток в ТКМ с концентрацией 300 МЕ/мл ИЛ-2 в концентрации 1 х 106 клеток/мл.
  7. Добавьте фитогемагглютинин-L (PHA-L) (таблица материалов) в концентрации 4 мкг/мл (в 2 раза больше необходимой концентрации в культуре) и быстро перейдите к шагу 2.8.
  8. Добавьте 100 000 облученных питающих ячеек в 100 мкл ТКМ с 4 мкг/мл PHA-L и 300 МЕ/мл IL-2 к покрытым Treg-обогащенным клеткам, в результате чего общий объем составит 200 мкл и концентрация PHA-L 2 мкг/мл в каждой лунке. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз 5 раз. Ограничьте время воздействия PHA-L на питающие клетки перед их добавлением в Treg до абсолютно необходимого минимума и держите во взвешенном состоянии до тех пор, пока они не погаснут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте концентрацию PHA-L 2 мкг/мл в культуре на начальной стадии посева, но используйте более низкую концентрацию 1 мкг/мл при последующем размножении клонов Treg. Используйте 300 МЕ/мл IL-2 на протяжении всего приема.
  9. Инкубировать при 37 °C. Меняйте 50% среды с помощью ТКМ с 300 МЕ/мл IL-2, но без PHA-L на 5−7 день.

3. Экспансия Treg и поддержание клонов в культуре

  1. Начиная с 12 дня, проверяйте культуры на наличие гранул пролиферирующих клеток.
    Примечание: Существуют гранулы, образованные фидерными клетками, но при микроскопическом исследовании они будут выглядеть как маленькие, круглые, умирающие или мертвые клетки, в то время как пролиферирующие Т-клетки будут больше по размеру, с ярким контрастом и здоровым внешним видом, часто образуя кластеры соседних клеток, которые кажутся коричневыми при макроскопическом исследовании.
  2. Продолжайте осматривать культуры каждые 1−2 дня. Изолируйте пролиферирующие пробные клоны, перенеся их в одиночные лунки. Поместите каждый пробный клон на одну 96-луночную пластину, чтобы избежать перекрестного загрязнения любого конкретного предварительного или укоренившегося клона при непреднамеренном переносе клеток из других лунок.
  3. Поддерживайте клетки с помощью 50% изменений среды каждые 2−3 дня и разделяйте по мере необходимости. Внимательно следите за клетками.
    Примечание: Задержка смены среды и расщепление могут повредить клетки, а «чрезмерное расщепление» может остановить их пролиферацию и привести к их гибели.
  4. Рестимулируйте клетки облученными аллогенными фидерами, как описано на этапах 2.3−2.9, но используйте более низкие концентрации PHA-L (т.е. 1 мкг/мл в ТКМ с 300 МЕ/мл IL-2). Рестимуляция, когда размер клеток уменьшается и клетки становятся круглыми, в отличие от вытянутых овальных, которые обычно происходят через 2-3 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте исходную клонированную культуру не менее 6−8 недель. Многие из «ранних» клонов, которые становятся видимыми через 2 недели или вскоре после них, как правило, не являются истинными Treg, а быстро пролиферируют клетками, не относящимися к Treg/Teff, и с большей вероятностью не пройдут проверку, чем «поздние» клетки, некоторым из которых потребуется более 1 месяца, чтобы заметно проявиться в культуре.

4. Проверка предварительных клонов Treg

  1. Начинайте проверку предварительных клонов после того, как они пролиферировали до ~1 x 106 клеток на моноклональность и статус метилирования TSDR.
  2. По желанию, предварительный скрининг экспансии клеток путем окрашивания на CD3, CD4, CD127 и CD25 с целью идентификации представляющих интерес (т.е. CD3+CD4+CD127loCD25hi) для дальнейшей оценки (рисунок 2).
  3. Установление моноклональности путем идентификации наличия одной Vβ-цепи в клеточном продукте путем окрашивания Vβ с использованием наборов коммерчески доступных окрашивающих антител (Таблица материалов; Рисунок 3) следуя инструкциям производителя. Убедитесь, что вы регистрируете не менее 1 x 106 событий при прохождении проб на проточном цитометре для надежного анализа, чтобы можно было обнаружить незначительные загрязняющие популяции. Используйте краситель для повышения жизнеспособности.
  4. Имеют статус метилирования TSDR в локусе FOXP3, оцененном коммерческими поставщиками или собственными11,12. Получите хотя бы 1 x 105 клеток для получения адекватных результатов.
  5. После того, как идентификация и клональность Treg будут подтверждены на этапах 4.3 и 4.4, криоконсервируйте клетки или используйте для последующих применений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативными, но гораздо менее надежными подходами к проверке являются определение фенотипа Treg с помощью окрашивания FACS 1,10 и анализов in vitro или in vivo13,14. Избегайте чрезмерной зависимости от анализов с подавлением Treg13. Анализы обычно, но не исключительно, основаны на кокультуре Treg в градуированных количествах с Т-клетками-ответчиками (т.е. PBMC или очищенными Т-клетками, иногда обедненными Treg) в присутствии антигенпрезентирующих клеток третьей стороны или CD3/CD28 с разведением красителя, представляющим пролиферацию в качестве считывания. Многие из этих анализов имеют серьезные ограничения и могут либо переоценивать, либо недооценивать фактическую степень подавления, опосредованного Treg. Статус метилирования TSDR остается наиболее определенным/надежным показателем фенотипа Treg или «идентичности»3,15,16. Обратите внимание, что FOXP3 расположен на Х-хромосоме и у женщин одна Х-хромосома инактивируется метилированием ДНК, что влияет на результаты анализа метилирования TSDR.

5. Криоконсервация трега

ПРИМЕЧАНИЕ: Трег можно хранить в течение длительного времени после успешной криоконсервации с помощью ДМСО и PHS-AB.

  1. Определите количество криоприемников, необходимых для криоконсервации клеток. Это равно общему конечному объему клеточной суспензии (в мл), подлежащей криоконсервации, поскольку в одном флаконе замораживается 1 мл. Добавьте запас прочности в 10% к этому объему, чтобы учесть потери из-за пипетирования/поверхностного натяжения.
    Клетки могут быть криоконсервированы в широком диапазоне концентраций, обычно в диапазоне 0,1−100 x 106 клеток/мл.
  2. Пометьте криовиалы.
  3. Сгенерируйте раствор A (SA): смешайте 50% RPMI и 50% PHS-AB или человеческую плазму. Если используется плазма, вращайте при 2 000 x g в течение 20 минут при 4 °C.
    Примечание: Объем SA должен составлять 75% от общего конечного объема клеточной суспензии, подлежащей криоконсервации, как определено на шаге 5.1.
  4. Сгенерируйте раствор B (SB): смешайте 60% (v/v) PBS или RPMI и 40% (v/v) диметилсульфоксид (DMSO).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем SB должен составлять 25% от общего конечного объема клеточной суспензии, подлежащей криоконсервации, как определено на шаге 5.1.
  5. Охладите оба раствора до 4 °C.
  6. Приготовьте среду для заморозки, смешав весь SB с равными частями SA и держите на льду.
  7. Spin Treg с шага 4.5 при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C. Отсасывайте и отбрасывайте среды, а также ресуспендируйте клетки в оставшемся ледяном СА и оставайтесь на льду.
  8. Медленно добавляйте охлажденную замораживающую среду в соотношении 1:1 к ячейкам, ресуспендированным в SA в большой пробирке на льду, встряхивая пробирку.
  9. Быстро аликвотировать в криовиалы по 1 мл/флакон. Немедленно поместите криовиалы в коробку для шкафа при температуре RT и без промедления переложите в морозильную камеру при температуре -80 °C. Переложите в жидкость N2 через 24 ч.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешная реализация этого протокола приведет к получению стабильных регуляторных клонов и линий Т-клеток человека.

Предварительный отбор/преобогащение CD4+CD127loCD25hi клеток был простым методом получения исходной популяции, содержащей наибольшее количество человеческого Treg (рис. 1A–C). Не все клоны демонстрировали фенотип Treg. Предварительный скрининг клонов путем измерения экспрессии CD25hiCD127

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Данный протокол описывает размножение сверхчистых регуляторных Т-клеток человека путем выделения, экспансии и тщательной проверки клеток, полученных методом ограничения разведения и экспансии фидерных клеток из исходных популяций, содержащих Treg.

Важнейшими шагами в этом подходе являются: 1) выбор подходящей исходной популяции. Как правило, CD127loCD25 hi компартмент CD4+ Т-клеток в PBMC человека содержит широкий спектр Treg, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект был поддержан Национальным институтом глаза Национальных институтов здравоохранения под премией No K08EY025324 (Nowatzky) и премией Colton Scholar Award от Центра аутоиммунных заболеваний Джудит и Стюарт Колтон (Nowatzky).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m Stericup, 500 млMillipore5500Хранение и приготовление сред
100x Заменимые аминокислотыGibco11140-050Компонент среды
15 мл конические центрифужные пробирки (50/пакетик, кейс 500)ThermoFisher Scientific339650
1M HEPESGibco15630-080Компонент среды
25 мл Однолуночный пипетка БассейнFischer Scientific13-681-508
Коническая центрифужная пробирка 50 мл (25/втулка)ThermoFisher Scientific339652
50x Пенициллин Стрептомицин SolnCorning Corning, 30-001-ClМедиа компонент
Криопробирка Флакон Int Резьба Круглая Btm Starfoot PP Винтовая пробка Стерильная PP 1,8 млNalge Nunc377267
DMSOCorning25-950-CQC
EasySep Human CD25 Набор для отбора положительныхStemcell Technologies18231Альтернативы - FACS или MACS колонная сортировка
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment KitStemcell Technologies19231Альтернативы - FACS или MACS колоночная сортировка
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (альтернатива пункту 12)Stemcell Technologies18063Альтернативами являются колонная сортировка FACS или MACS
FicollGE Healthcare17-5442-03PBMC очистка из периферической крови от продуктов лейкафереза; градиент плотности среда
Human AB Serum (PHS-AB)Valley Biomedical IncHP1022Медиа компонент
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Dead Stain Kit, для возбуждения ультрафиолетаThermo FischerL-34962Viability dye
Фитогемагглютинин-L (PHA-L)Стимуляция Миллипор/Сигма11249738001Т-клеток
Рекомбинантный IL-2 (например, PROLEUKINâ )Стимуляция и поддержание Т-клетокPrometheus
RPMI 1640Gibco21870-076Медиакомпонент
Окрашивание антител для профлоцитометрии (Treg фенотипирование)См. "Комментарии"Окрашивающиеантитела включены в: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. В случае использования набора для подбора положительного результата EasySep Human CD25, окрасьте его анти-CD25 антителом 2A3 или BC96, например: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Anti-Human (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Репертуарный набор; IOTest Beta MarkBeckman CoulterPN IM3497Проверка расширений для моноклональности
Тканевая культуральная пластина, 96 лунок, U-образное дно с крышкой с низким испарениемCorning 353077
клеток / Медиакомпонент

Ссылки

  1. Miyara, M., et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity. 30 (6), 899-911 (2009).
  2. Polansky, J. K., et al. DNA methylation controls Foxp3 gene expression. European Journal of Immunology. 38 (6), 1654-1663 (2008).
  3. Toker, A., et al. Active demethylation of the Foxp3 locus leads to the generation of stable regulatory T cells within the thymus. The Journal of Immunology. 190 (7), 3180-3188 (2013).
  4. Garg, G., et al. Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation. Cell Reports. 26 (7), 1854-1868 (2019).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  6. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Science Translational Medicine. 3 (83), 41(2011).
  7. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), 189(2015).
  8. Dromey, J. A., et al. Generation and expansion of regulatory human CD4(+) T-cell clones specific for pancreatic islet autoantigens. Journal of Autoimmunity. 36 (1), 47-55 (2011).
  9. Sabado, R. L., et al. Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. Journal of Visual Experiments. (78), e50085(2013).
  10. Nowatzky, J., Stagnar, C., Manches, O. OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3 Expressing Human CD4(+) Treg Subsets. Cytometry A. 95 (3), 264-267 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Genome-wide DNA methylation analysis identifies hypomethylated genes regulated by FOXP3 in human regulatory T cells. Blood. 122 (16), 2823-2836 (2013).
  12. Spreafico, R., et al. A sensitive protocol for FOXP3 epigenetic analysis in scarce human samples. European Journal of Immunology. 44 (10), 3141-3143 (2014).
  13. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 21-37 (2011).
  14. Workman, C. J., et al. In vivo Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 119-156 (2011).
  15. Feng, Y., et al. Control of the inheritance of regulatory T cell identity by a cis element in the Foxp3 locus. Cell. 158 (4), 749-763 (2014).
  16. Toker, A., Huehn, J. To be or not to be a Treg cell: lineage decisions controlled by epigenetic mechanisms. Science Signaling. 4 (158), 4(2011).
  17. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  18. Fuhrman, C. A., et al. Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226. The Journal of Immunology. 195 (1), 145-155 (2015).
  19. Gu, J., et al. Human CD39(hi) regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions. Cellular & Molecular Immunology. 14 (6), 521-528 (2017).
  20. Genevee, C., et al. An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (V alpha 1-w29/V beta 1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction. European Journal of Immunology. 22 (5), 1261-1269 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Регуляторные Т-клеткиизоляция Tregклоны Tregклонирование клетокмоноклональные клеткиэкспансия Tregхарактеристика Tregчистота Tregкультура Tregселекция Treg

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.