Бивентрикулярная оценка сердечной функции и плотно-объемных петель с помощью закрытой грудной катетеризации у мышей

Краткое содержание

Здесь представлен протокол оценки бивентрикулярной функции сердца у мышей путем генерации контуров давления-объема (ВП) из правого и левого желудочков у одного и того же животного с использованием закрытой катетеризации грудной клетки. Основное внимание уделяется техническому аспекту хирургии и сбору данных.

Аннотация

Оценка сердечной функции имеет важное значение для проведения сердечно-сосудистых и легочно-сосудистых доклинических исследований. Петли давления-объема (ПВ-петли), генерируемые регистрацией как давления, так и объема во время катетеризации сердца, имеют жизненно важное значение при оценке как систолической, так и диастолической функции сердца. Функции левого и правого отделов сердца тесно связаны, что отражается во взаимозависимости желудочков. Таким образом, регистрация бивентрикулярной функции у одного и того же животного важна для получения полной оценки сердечной функции. В этом протоколе у мышей принят закрытый грудной подход к катетеризации сердца, соответствующий способу выполнения катетеризации у пациентов. Несмотря на сложность, стратегия закрытой грудной клетки является более физиологичным подходом, потому что вскрытие грудной клетки приводит к серьезным изменениям в преднагрузке и постнагрузке, которые создают артефакты, в первую очередь падение системного артериального давления. В то время как эхокардиография высокого разрешения используется для оценки состояния грызунов, катетеризация сердца неоценима, особенно при оценке диастолического давления в обоих желудочках.

Здесь описана процедура выполнения инвазивных, закрытых грудных клеток, последовательных петлей левочелюстного и правого желудочкового давления-объема (ВП) у одного и того же животного. Петли PV регистрируются с помощью технологии допуска с помощью катетера, находящегося под давлением, и с помощью системы измерения давления-объема. Описывается процедура, начиная с рассечения шеи, которая необходима для доступа к правой яремной вене и правой сонной артерии, до введения и позиционирования катетера и, наконец, сбора данных. Затем обсуждаются критерии, необходимые для обеспечения получения высококачественных фотоэлектрических контуров. Наконец, кратко описан анализ петель ВП левого и правого желудочков и различные гемодинамические параметры, доступные для количественной оценки систолической и диастолической функции желудочков.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире как для мужчин, так и для женщин ^1,2,3. Многие исследования сосредоточены на диагностике и улучшении нарушений сердечной функции⁴. Для этих применений решающее значение имеет качественная и воспроизводимая оценка сердечной функции. Для оценки как этиологического, так и терапевтического ответа требуются высокоточные и воспроизводимые данные катетера. Например, оценка сердечной функции имеет важное значение для оценки эффективности лекарств и других методов лечения в доклинических моделях инфаркта миокарда⁵. В то время как многие сердечно-сосудистые исследования сосредоточены на функции левого желудочка, функция правого желудочка также является критическим фактором, определяющим функциональную способность и прогноз у пациентов с легочно-сосудистыми заболеваниями ^6,7. У пациентов с прогрессирующей сердечной недостаточностью постоянно повышенное правостороннее и левостороннее давление наполнения является предиктором комбинированного риска смерти, сердечно-сосудистой госпитализации и трансплантации сердца⁸. При комбинированном заболевании аорты и митрального клапана предоперационная функция миокарда (отражающаяся в таких параметрах, как сердечный индекс и фракция выброса левого желудочка) является основным предиктором долгосрочной выживаемости⁹. Функция правого желудочка является основным предиктором заболеваемости и смертности при легочной артериальной гипертензии^10,11. Таким образом, оценка функции правого желудочка является необходимым компонентом комплексного доклинического исследования с использованием моделей легочной артериальной гипертензии^12,13,14.

Функцию левого и правого желудочков часто изучают независимо друг от друга. Однако, поскольку функции левого и правого желудочков тесно связаны, идеальным вариантом является получение бивентрикулярной оценки систолической и диастолической функции с помощью одного теста¹⁵. Например, правый желудочек имеет общие косые волокна межжелудочковой перегородки с левым желудочком, который представляет собой одно из механических звеньев между сократительной функцией левого и правого желудочков^16,17. Это явление, известное как систолическое желудочковое взаимодействие, позволяет сокращению левого желудочка усиливать сокращение правого желудочка. Также важны желудочковые взаимодействия во время диастолы. Во время диастолы объем одного желудочка влияет на объем противоположного желудочка и, таким образом, изменяет диастолическую податливость и преднагрузку^18,19. При патологических состояниях снижение функции одного желудочка или нарушение объемной нагрузки могут прямо или косвенно нарушать функцию другого желудочка²⁰. Как следствие систолического желудочкового взаимодействия глобальное снижение функции левого желудочка может снижать сократительную функцию правого желудочка¹⁵. У пациентов с сердечной недостаточностью, обусловленной систолической функцией левого желудочка и повышением конечного диастолического давления, давление в легочной артерии повышено, опосредованно увеличивая постнагрузку правого желудочка^21,22. И наоборот, повышенное давление в правом желудочке и объемная перегрузка при тяжелой легочной гипертензии оказывает механическое давление на левые отделы сердца. Это D-образное уплощение левого желудочка, вызванное смещением межжелудочковой перегородки влево, уменьшает объем левого желудочка и нарушает систолическую и диастолическую функцию 23,24,25,26,27. Таким образом, оценка как левого, так и правого желудочков имеет важное значение для оценки глобальной сердечной функции в доклинических моделях заболеваний человека.

Сердечную функцию также можно оценить с помощью неинвазивной эхокардиографии, магнитно-резонансной томографии (МРТ) и инвазивной катетеризации^28,29,30. Эхокардиография является наиболее часто используемым методом визуализации в сердечно-сосудистых исследованиях, поскольку она относительно недорогая и доступная³¹. Тем не менее, эхокардиография имеет ряд технических ограничений, включая косвенное измерение давления наполнения и ограниченную способность количественно оценить диастолическую функцию. Кроме того, качество данных, полученных с помощью эхокардиографии, сильно зависит от оператора. МРТ сердца является относительно новым дополнением к арсеналу доклинической визуализации, которое имеет большой потенциал для количественной оценки бивентрикулярной функции. Количественная оценка с помощью МРТ сердца является точной, так как она не делает геометрических предположений о форме желудочков, в отличие от эхокардиографии³². Однако платформа для МРТ-визуализации стоит дорого и редко доступна. Кроме того, обработка данных МРТ требует квалифицированной поддержки со стороны физика или аналогичного ученого, чего нет во многих доклинических лабораториях³³. Аналогичным образом, использование микрокомпьютерной томографии (МикроКТ) в доклинических исследованиях позволяет получать количественные трехмерные (3D) анатомические данные с высоким разрешением, которые могут быть получены неинвазивным способом, что позволяет проводить лонгитюдные исследования³⁴. Тем не менее, микрокомпьютерная томография требует введения контрастных веществ, которые часто являются дорогостоящими. Платформа визуализации MicroCT, как и МРТ, также стоит дорого и требует квалифицированного специалиста.

Напротив, катетеризация является инвазивным методом, который заключается во введении катетера в правый и/или левый желудочек для измерения давления и/или объема. Инструменты, необходимые для проведения катетеризации сердца, стоят не так дорого, как эхокардиография, КТ или МРТ. Тем не менее, требуются значительные технические знания для катетеризации и анестезии мелких животных. Катетеризация позволяет проводить прямую и точную оценку сердечной функции²⁸. В этом протоколе для оценки сердечной функции используется приемный PV-катетер. Эта технология, основанная на различных свойствах электропроводности крови и сердечной мышцы, позволяет одновременно регистрировать давление и объем в полости сердца и генерировать петли PV в режиме реального времени ^5,35. Вкратце, катетер состоит из электродов возбуждения и электродов записи. Электроды возбуждения генерируют электрическое поле внутри правого или левого желудочка. Внутренний регистрирующий электрод измеряет изменение напряжения, которое пропорционально изменению сопротивления. Вывод объема желудочков основан на законе Ома (напряжение = ток x сопротивление), из которого вычисляется проводимость (т.е. величина, обратная сопротивлению). В этом случае измеренное значение проводимости представляет собой комбинацию проводимости крови и мышечной проводимости. В электрическом поле кровь обладает исключительно резистивными свойствами, в то время как мышцы обладают как емкостными, так и резистивными свойствами. Емкостные свойства мышц вызывают временную задержку измеряемого сигнала. Отслеживание этой задержки, известной как «фазовый» угол, сообщает о вторжении сердечной ткани в поле при сокращении сердца. Это измерение является наибольшим при систоле и наименьшим при диастоле. Это свойство позволяет отделить мышечную составляющую проводимости от проводимости крови и позволяет близко приблизиться к абсолютным систолическим и диастолическим объемам. Петли «давление-объем» обеспечивают ряд гемодинамических параметров, которые не могут быть легко измерены другими методами, такими как простая ретроградная катетеризация с использованием катетеров, заполненных жидкостью, для измерения сердечного давления. Петли «давление-объем» измеряют давление в желудочках, а также предоставляют данные о сократительной способности, эластичности, мощности, энергетике и эффективности. Кроме того, фотоэлектрические петли обеспечивают надежные количественные измерения³⁶. Таким образом, оценка сердечной функции с помощью ФВ-петель, генерируемых катетеризацией, стала золотым стандартом в доклинических исследованиях³⁷. Кроме того, доклинические методы имеют отношение к заболеваниям человека, при которых распространена катетеризация сердца, хотя и с помощью катетеров, заполненных жидкостью. Однако катетеризация сердца у грызунов требует безупречной анестезии и отличной техники для предотвращения чрезмерной потери крови, гиповентиляции или изменения температуры тела.

У пациентов катетеризация сердца выполняется в закрытой грудной клетке, а сосудистый доступ достигается через яремную или подключичную вену для правого желудочка и лучевую или бедренную артерию для левого желудочка. Из-за небольшого размера мышей закрытый грудной подход часто бывает сложным. Таким образом, в исследованиях, проводимых на мышах, обычно используется открытый подход грудной клетки. Этот метод включает в себя вскрытие грудной клетки, тем самым обнажая сердце, и облегчение введения катетера путем пункции верхушки левого и/или правого желудочка³⁸. Несмотря на то, что этот подход технически менее сложен и достаточно воспроизводим, его основные ограничения включают кровотечение и другие осложнения при апикальном введении катетеров, а также заметное падение внутрисердечного давления в результате открытия грудной полости до атмосферного давления. Вскрытие грудной клетки у грызуна, находящегося на искусственной вентиляции легких, вызывает снижение систолического давления в левом желудочке на 5–10 мм рт.ст. и давление в правом желудочке на 2–5 мм рт.ст.³⁹. Таким образом, был разработан закрытый подход грудной клетки, который менее травматичен для сердца и дает более физиологически значимые измерения, которые легче переводятся в клиническую оценку сердечной функции.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями по биобезопасности и этике Университета Квинс (ROMEO/TRAQ#6016826). Последующие процедуры были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами. Это терминальная процедура. Из-за инвазивности правого и левого катетеризации животных следует усыплять сразу после сбора данных. Эвтаназия должна проводиться в соответствии с рекомендациями учреждения по проведению исследований на животных.

1. Подготовка и постановка эксперимента

1. Поместите катетер в шприц объемом 10 мл с физиологическим раствором/гепарином при комнатной температуре за 30 минут до начала эксперимента (рис. 1А).
2. Через 30 минут откалибруйте катетер (например, исходный уровень и систему сбора данных) в соответствии с рекомендациями производителя. Система сбора данных отображает высокие и низкие значения калибровки, которые используются для калибровки системы сбора данных перед началом эксперимента. Выведите эти значения и убедитесь, что они совпадают.
   1. Используйте кнопку «Контроль баланса давления», «Грубый +/-» или «Точный +/-», чтобы установить базовое значение давления равным нулю.
   2. Выполните двухточечную калибровку для высокого и низкого сигнала.
      1. На консоли управления нажмите «Настройка системы» в «Меню катетера».
      2. Нажмите «Отправить сигнал калибровки» в меню «Настройки системы», чтобы отправить низкий сигнал. Убедитесь, что давление, объем, фаза и величина находятся на уровне 0 мм рт.ст., 0 мкл, 0° и 0 мкс соответственно.
      3. Нажмите "Enter", чтобы отправить высокий сигнал. Убедитесь, что давление, объем, фаза и величина находятся на уровне 100 мм рт.ст., 150 мкл, 20° и 5 000 мкс соответственно.
      4. Нажмите «Enter», чтобы вернуться в «Меню настроек системы».
      5. Нажмите «6», чтобы вернуться в «Меню катетера». Затем нажмите «Получить данные».
3. Согните иглу 30 G примерно на 90° (рис. 1B, C). Эта изогнутая игла будет использоваться для прокола яремных и сонных сосудов.

2. Анестезия и контроль температуры тела

1. Поместите мышь (28 г, C57BL/6 в данном протоколе) в камеру для анестезии, содержащую анестезирующий газ (например, кислород 100%, изофлуран 3–4% для индукции).
2. Когда животное находится под наркозом, не реагируя на пощипывание лапы или хвоста, положите мышь на грелку, установленную на 37 °C.
3. Подключите мышь к респиратору через носовой конус, обеспечивающий смесь 100% кислорода и 2% изофлурана. Чтобы автоматически рассчитать рекомендуемые настройки вентиляции, введите вес животного в фирменное программное обеспечение аппарата ИВЛ с помощью сенсорного экрана. Для расчетов используется следующая формула:
   Дыхательный объем = 6,2 х^{масса животного 1,01} (кг),
   Частота дыхания = 53,5 х масса ^{животного-0,26} (кг).
4. Включите анестезиологическую магистраль от наркозной камеры к носовому конусу.
5. Вставьте датчик с температурной обратной связью в прямую кишку, а зонд-подушечку — между подушечкой и задней частью мыши, установив желаемую температуру тела на 37–37,5 °C. Контролируйте температуру животного на экране монитора (рис. 2A, B).
6. Примотайте передние лапы и одну дистальную лапу мыши к нагревательному одеялу с помощью хирургической ленты, оставив одну заднюю лапу свободной для контроля глубины анестезии.

3. Доступ к хирургическому участку

1. Выполните H-образный вентральный срединный разрез шейки матки диаметром 2 см от манубриума до уровня подъязычной кости.
   1. Отразите кожу от подлежащих мышц. При необходимости эти мышцы могут быть иссечены для лучшей визуализации.
   2. Аккуратно отодвиньте подчелюстную железу в сторону.
   3. Рассекают мягкие ткани шейного отдела и обнажают щипцами грудино-ключично-сосцевидную и грудино-подъязычную мышцы методом тупого рассечения.
   4. Расщепите фасцию посередине, перекрывая парную грудиновидную кость. Позвольте парной грудино-подъязычной кости втянуться в сторону, чтобы обнажить трахею. Будьте осторожны, чтобы не повредить сонные артерии и блуждающие нервы, которые проходят вдоль трахеи.
2. Проденьте щипцы под трахею, чтобы приподнять ее. Затем проденьте хирургический шелковый шов 4,0 под трахею и сделайте потенциальный узел в середине шва, который позже будет затянут для фиксации эндотрахеальной трубки (Рисунок 3A).
3. С помощью ножниц сделайте небольшой надрез между хрящевыми кольцами трахеи ниже уровня гортани. Введите эндотрахеальную трубку (рисунок 3B).
4. Подсоедините трахеостомическую трубку к респиратору и начните вентиляцию со 100% кислородом и 2% изофлураном. Затяните узел вокруг трахеи, чтобы закрепить эндотрахеальную трубку, и примотайте трубку респиратора к операционному столу. Убедитесь, что трахея не заблокирована и не коллапсирована (рисунок 3C).

4. Изоляция правой яремной артерии и правой сонной артерии

1. Изоляция правой сонной артерии
   1. Используя тупое рассечение, сместите грудино-подъязычную мышцу латерально, чтобы обнажить и изолировать правую сонную артерию.
   2. Изолируют сонную артерию от блуждающего нерва путем тупого рассечения с помощью щипцов.
   3. Наложите три хирургических шва (4,0) под сонную артерию, исключая блуждающий нерв.
2. Изоляция правой яремной вены
   1. Сместите подчелюстную и околоушную железы латерально, чтобы визуализировать правую яремную вену. Тупо рассеките и обнажите правую яремную вену с помощью щипцов. Аккуратно рассеките вену и удалите окружающую фасцию.
   2. Проденьте щипцы под яремную вену.
   3. Наложите один хирургический шов под яремную вену, затем перевяжите его на краниальной стороне вены. Наложите на этот шов мягкое вытяжение по направлению к головке с помощью гемостатического зажима.
   4. Наложите два дополнительных шва под яремную вену. Осторожно натяните самый дистальный шов в каудальном направлении с помощью гемостатического зажима. Сделайте свободный, потенциальный узел в среднем шве.
   5. Капните несколько капель подогретого физиологического раствора на сосуд в месте предполагаемой венотомии.

5. Хирургические процедуры по катетеризации правого и левого желудочков

1. Катетеризация правого желудочка (рис. 4 А–Г).
   1. С помощью стереомикроскопа определите яремную вену.
   2. Аккуратно нанесите превосходное вытяжение на вену. Выполните венотомию, вставив изогнутую иглу 30 G между черепным швом и средним швом. Введите иглу под углом 140° относительно вены, чтобы убедиться, что она входит коаксиально.
   3. После введения расширяйте венотомию, перемещая иглу. Вставьте наконечник катетера в венотомию под иглу. Затем аккуратно перевяжите средний шов, закрепив катетер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы не завязать шов слишком туго, так как чрезмерное усилие может повредить катетер.
   4. Освободите каудальный шов и продвиньте катетер в правый желудочек, обнаружив классическую форму волны давления в правом желудочке на непрерывном мониторе.
   5. Стабилизируют давление в правом желудочке. Обеспечьте правильное расположение катетера в правом желудочке, чтобы создать оптимальную петлю PV.
      1. Стабилизируйте магнитуду, отражающую кровь и мышцы, чтобы создать петли давления-величины (т.е. давление по оси Y, величина оси X). При необходимости осторожно поверните стержень катетера, чтобы добиться оптимального расположения катетера вдоль оси правого желудочка.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное значение фазы, отражающее мышцу, должно быть ниже 7°.
   6. Когда сигнал петли давления-величины оптимален, нажмите «Enter» на консоли во время съемки, чтобы выполнить базовое сканирование. Убедитесь, что частота сердечных сокращений, отображаемая на экране монитора в ударах в минуту (уд/мин), находится в физиологическом диапазоне (т. е. 400–600 ударов в минуту).
   7. Сгенерируйте петли PV. Измените "Magnitude" на "Volume" в качестве параметра для оси X и оставьте давление в качестве оси Y. Когда сигнал фотоэлектрических петель будет оптимальным, запись в течение 30 секунд.
   8. Остановите запись. Оттяните катетер и аккуратно протрите марлей. Поместите катетер в раствор гепарина/натрия хлорида и завяжите каудальный шов, чтобы остановить кровотечение из яремной вены.
2. Катетеризация левого желудочка (рис. 5 А–Г).
   1. Осторожно приподнимите правую сонную артерию, которая ранее была изолирована (5А), скользя изогнутыми щипцами под артерию.
   2. Перевяжите предыдущий шов, тем самым закупоривая артерию. Затем аккуратно наложите краниально направленное вытяжение с помощью гемостатического зажима.
   3. Натяните самый дистальный шов в каудальном направлении с помощью гемостатического зажима. Сделайте свободный потенциальный узел на среднем шве.
   4. Нанесите несколько капель подогретого физиологического раствора на сосуд в месте предполагаемой артериотомии. Сосредоточьтесь на краниальном участке, между каудальным и средним швами, используя стереотаксический микроскоп.
   5. Аккуратно надавите на артерию. Выполните артериотомию, вставив изогнутую иглу 30 G между черепным швом и средним швом. Введите иглу под углом 140° относительно артерии, чтобы убедиться, что она входит коаксиально.
   6. Вставьте наконечник катетера в артериотомию, а затем затяните средний шов, чтобы зафиксировать катетер. Одновременно снимите дистальный шов и введите катетер в аорту, чтобы начать запись. Убедитесь, что в канале давления виден типичный след аорты.
   7. Продвигайте ретроградный катетер через аортальный клапан в левый желудочек. Вход в левый желудочек будет очевиден по внезапному заметному падению диастолического давления со стороны аорты.
   8. Стабилизируют давление в левом желудочке. Обеспечьте правильное расположение катетера в левом желудочке, чтобы создать оптимальную петлю PV.
      1. Стабилизируйте магнитуду, отражающую кровь и мышцы, чтобы создать петли давления-величины (т.е. давление по оси Y, величина оси X). При необходимости осторожно поверните стержень катетера, чтобы добиться оптимального расположения катетера вдоль оси левого желудочка.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное значение фазы, отражающее мышцу, должно быть ниже 7°.
   9. Остановите запись. Отодвиньте катетер и поместите его в раствор гепарина/натрия хлорида. Затем перевяжите хвостовой шов.
   10. Очистите катетер ферментативным моющим средством (например, эндозимом).
       ПРИМЕЧАНИЕ: После операции усыпите животное в соответствии с рекомендациями учреждения по проведению исследований на животных. 

6. Анализ данных

1. Выполняйте анализ контура PV в соответствии с установленными рекомендациями.
   1. Выберите оптимальную кривую давления-объема (в идеале полную, стабильную запись в течение 30 секунд). В программном обеспечении нажмите «Дополнительно», нажмите «Циклы», а затем нажмите «Автономный расчет».
   2. Выберите объем в качестве объемного канала и давление в качестве напорного канала.
   3. Для стабильного результата необходимо минимум 20 петель.

Результаты

Катетер помещали в шприц объемом 10 мл, содержащий раствор гепаринизированного физиологического раствора комнатной температуры за 30 мин до катетеризации (рис. 1А). Иглу 30 G согнули на ~90° (рис. 1B, C) и подготовили трахеотомическую канюлю диаметром 1,45 мм (рис. 1C).

Поддержание физиологической температуры тела имеет решающее значение. Мышь была заклеена скотчем и подключена к респиратору через носовой конус. Зонд обратной связи был размещен между ковриком и тыльной стороной мыши. Для контроля температуры тела животного был введен ректальный зонд (рис. 2А). Контролировали температуру тела (37,1 °С) и температуру прокладки (40,7 °С) (рис. 2Б).

Фотографии критических этапов процедуры интубации представлены на рисунке 3A–C. Успешная и беспрепятственная интубация привела к регулярной частоте дыхания со стабильным пиковым давлением (рис. 2B).

На рисунке 4D показаны изображения критических этапов катетеризации правых отделов сердца, от изоляции яремной вены (рис. 4A–C) до введения катетера в яремную вену. На рисунке 5 показаны критические этапы катетеризации левых отделов сердца, включая изоляцию правой сонной артерии (рисунок 5 A, B) и введение катетера (рисунок 5 C, D)

Катетер вводили в яремную вену и продвигали в правый желудочек. Затем стабилизировалось давление в правом желудочке и проверялось правильное положение. Все электроды катетера (длина оси 6 мм) должны находиться в камерах правого желудочка и не соприкасаться со стенками желудочков. Оптимальное расположение катетера, как показано на рисунке 6А , создавало оптимальные петли PV (т.е. треугольные, правильные). Неправильное расположение, как схематически показано на рисунке 6B (т.е. контакт со стенкой желудочка), приведет к дефектным петлям PV (т.е. схлопыванным и нерегулярным петлям).

Катетер вводили в сонную артерию, продвигали в аорту, затем продвигали ретроградно через аортальный клапан в левый желудочек. Давление в левом желудочке стабилизировалось, а положение справа было проверено. Все электроды катетера (длина оси 6 мм) должны находиться в камерах левого желудочка и не соприкасаться со стенками желудочков. Оптимальное расположение катетера, как показано схематически на рисунке 6C , создавало оптимальные петли PV (т.е. прямоугольные, правильные). Неправильное позиционирование, как схематически показано на рисунке 6D (т.е. контакт со стенкой желудочка), привело к дефектным петлям ФВ (т.е. схлопывающимся, непрямоугольным и нерегулярным петлям).

Репрезентативная гемодинамика, генерируемая петлями левой и правой ФВ, показала частоту сердечных сокращений 410 уд/мин, сердечный выброс 9 107 мкл/мин и ударный объем 24,5 мкл. Специфические параметры правого желудочка показали систолическое давление правого желудочка 21,9 мм рт.ст., конечное диастолическое давление правого желудочка 1,049 мм рт.ст., фракцию выброса 56,1%, дп/дт макс. 1,469 мм рт.ст./с, dp/dt max -1,504 мм рт.ст./с, конечный диастолический объем 38,4 мкл, ударная работа 0,068 мДж, объемная площадь 0,089 мДж, эластика легочной артерии (Ea) 0,83 мм рт.ст./мкл и Тау-фактор 12,8 мс. Специфические параметры левого желудочка показали: систолическое давление левого желудочка 77,1 мм рт.ст., конечное диастолическое давление левого желудочка 2,33 мм рт.ст., фракция выброса 59,1%, дп/дт макс. 4,695 мм рт.ст./с, дп/дт макс. -3,553 мм рт.ст./с, конечный диастолический объем 36,9 мкл, ударная работа 0,14 мДж, объемная площадь 0,22 мДж, артериальная эляция (Ea) 5,37 мм рт.ст./мкл и тау-фактор 15,1 мс (табл. 1).

Гемодинамические параметры
Управление персоналом (BPM)	410,6 ± 23,3
CO (мкл/мин)	9107 ± 1016
SV (мкл)	24,5 ± 2,3
Функция RV
РВСП (мм рт. ст.)	21,9 ± 2,15
РВЭДП (мм рт. ст.)	1,042 ± 0,12
ЭФ (%)	56,1 ± 4,4
dP/dt max (мм рт.ст./с)	1469 ± 170
dP/dt max (- мм рт.ст./с)	1504 ± 215
EDV (мкл)	38,4 ± 3,7
SW (мДжоули)	0,068 ± 0,008
ПВА (мДжоули)	0,084 ± 0,009
Эа (мм рт.ст./мкл)	0,83 ± 0,09
Тау-фактор (мс)	12,8 ± 0,8
Функция LV
LVSP (мм рт. ст.)	77,1 ± 2,4
ЛВЭДП (мм рт. ст.)	2,33 ± 0,17
ЭФ (%)	59,1 ± 3,6
dP/dt max (мм рт.ст./с)	4695 ± 355
dP/dt max (- мм рт.ст./с)	3553 ± 373
EDV (мкл)	36,9 ± 4,8
SW (мДжоули)	0,14 ± 0,013
ПВА (мДжоули)	0,22 ± 0,03
Эа (мм рт.ст./мкл)	5,37 ± 0,9
Тау-фактор (мс)	15.07 ± 1.7
СО, сердечный выброс; Ea, артериальная эластика; EDV, конечный диастолический объем; ЧСС, частота сердечных сокращений; LVEDP, конечный диастолический объем левого желудочка; LVSP, систолическое давление в левом желудочке; ПВА, область объема давления; РВЭДП, конечное диастолическое давление правого желудочка; RVSP, систолическое давление в правом желудочке; SV — объем удара; SW, работа с ударами; Тау-фактор, Тау Мирского. N= 6 мышей. Значения выражаются ± SEM

Таблица 1: Таблица гемодинамических показателей. Гемодинамический параметр левого и правого желудочков измеряли у шести мышей.

Рисунок 1: Подготовка и постановка эксперимента. (A) Катетер в шприце 10 мл с физиологическим раствором/гепарином, (B), (C) игла 30 G, изогнутая примерно на 90°, (D) канюля для трахеотомии, диаметр 1,45 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Анестезия, контроль температуры тела . (A) Мышь с тремя лапами, подключенными к респиратору через носовой конус, с обратной связью и вставленными ректальными зондами. Обратите внимание, что грелка находится под хирургическим одеялом. (B) Контроль температуры, показывающий температуру тела (ректальная) и прокладка (обратная связь), а также параметры вентиляции: частоту дыхания (установленный RR), средний дыхательный объем (Meas TV), пиковое давление (PeakPress) и минутную вентиляцию (MinVol). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Процедура интубации. (А) Кожа была снята и разрезана. Подчелюстная железа была осторожно отодвинута в сторону. Грудино-ключично-сосцевидная и грудино-подъязычная мышцы были раздвинуты, а затем щипцы были введены под трахею, используя мягкое, тупое рассечение. (Б) Хирургический шелк (4,0) был введен под трахею, а спереди был сделан небольшой разрез между двумя хрящевыми кольцами трахеи. Трахеостома была вставлена и перевязана. (C) Трахеостомическая трубка была подключена к аппарату искусственной вентиляции легких, и шов был наложен вокруг трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Катетеризация правого желудочка. (А), (В), (В) Правая яремная вена была изолирована, затем под ней был наложен один хирургический шов и наложен на краниальную сторону вены. На этот шов накладывали щадящее вытяжение по направлению головки с помощью гемостатического зажима. Два дополнительных шва накладывались дистально, под яремной веной. Самый дистальный шов осторожно натягивали в каудальном направлении с помощью гемостатического зажима. В среднем шве был сделан свободный, потенциальный узел. (D) Катетер был введен в яремную вену, средний шов был наложен на катетер. Изображения на рисунках (C) и (D) увеличиваются с помощью стереомикроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Катетеризация левого желудочка. (А), (Б) Правая сонная артерия была изолирована, затем один хирургический шов был наложен под яремную вену и перевязан на краниальной стороне вены. На этот шов накладывали щадящее вытяжение по направлению головки с помощью гемостатического зажима. Под сонной артерией наложили два дополнительных шва. Самый дистальный шов осторожно натягивали в каудальном направлении с помощью гемостатического зажима. Был сделан свободный, потенциальный узел в среднем шве. (C) Наконечник катетера был введен в сонную артерию, а затем средний шов был привязан к катетеру для его фиксации. (D) Катетер осторожно продвигали ретроградно вниз по сонной артерии к аорте. Изображения на рисунках (B), (C), (D) увеличиваются с помощью стереомикроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Схематическое изображение расположения катетера и результирующих петель PV. (А) Оптимальное расположение катетера в правом желудочке. Кончик катетера находится в середине желудочка, изолирован от стенок желудочка. Репрезентативные петли PV, возникающие в результате оптимального расположения катетера в правом желудочке (т.е. стабильные, треугольные). (Б) Неправильное расположение катетера в правом желудочке. Кончик катетера соприкасается со стенками желудочков. Репрезентативный шум петли ФВ, возникающий в результате неоптимального расположения катетера в правом желудочке (т.е. коллапсированный, нерегулярный). (C) Оптимальное расположение катетера в левом желудочке. Кончик катетера находится в середине желудочка, изолирован от стенок желудочка. Репрезентативные петли PV, возникающие в результате оптимального расположения катетера в левом желудочке (т.е. стабильные, прямоугольные). (D) Неправильное расположение катетера в левом желудочке. Кончик катетера соприкасается со стенками желудочков. Репрезентативные петли ФВ, возникающие в результате неоптимального расположения катетера в левом желудочке (т.е. коллапсированные, нерегулярные). Для генерации фотоэлектрических петель был применен КИХ-фильтр с частотой 50 Гц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Оценка сердечной функции является важным этапом для доклинических сердечно-сосудистых и легочно-сосудистых исследований. В данной работе нами предложен протокол закрытой грудной бивентрикулярной оценки сердечной функции у мышей. С помощью этого подхода можно сгенерировать петли PV правого и левого желудочков в одной и той же мыши. Этот подход обеспечивает надежную и полную оценку сердечной функции, позволяя измерять систолическую и диастолическую функцию, а также ударный объем и сердечный выброс. В отличие от подхода с открытой грудной клеткой, традиционно используемого для катетеризации грызунов, этот метод закрытой грудной клетки приводит к более стабильной физиологии и более физиологически значимым данным. Несмотря на то, что с технической точки зрения это более сложная задача и требует навыков оператора для успешного позиционирования катетера в правом и левом желудочке, закрытый грудной доступ ограничивает травму и кровотечение, связанные с открытой операцией на грудной клетке, и уменьшает резкие изменения давления, связанные с воздействием атмосферного давления на легкие. Закрытый грудной метод также лучше имитирует процедуру катетеризации сердца, выполняемую у пациентов, что повышает актуальность использования этой методики в доклинических исследованиях.

Хирургическое вмешательство является критическим этапом протокола. Даже при использовании хирургического микроскопа для введения катетера в яремную вену или сонную артерию, что рекомендуется, эта процедура требует практики и технических навыков. Тщательное рассечение сосудов, свободных от окружающих фасций, с помощью мягкого, тупого рассечения увеличит успех канюляции, сводя к минимуму риск кровотечения. Чтобы свести к минимуму кровопотерю, крайне важно канюлировать сонную артерию последовательно: 1) ввести кончик катетера в сонную артерию; 2) аккуратно перевязать шов вокруг той части артерии, которая содержит катетер; 3) освободите надежный шов, позволяя катетер двигаться, сохраняя при этом мягкое вытяжение вверх, чтобы свести к минимуму кровотечение; 4) продвинуть катетер к аорте. Позиционирование катетера в желудочке, определяемое с помощью мониторинга формы сигнала в режиме реального времени, является наиболее сложной частью этого протокола. Все электроды катетера должны находиться в полости желудочка, и ни один из них не должен касаться стенки. Любое неправильное расположение катетера приведет к нерегулярным петлям PV и отрицательно повлияет на сбор данных или сделает их невозможными. Распознавание характерной формы волны давления-объема, возникающей в результате нахождения всех электродов в желудочке, позволяет быть уверенным в правильном положении катетера. Крайне важно получить стабильную форму волны желудочкового давления и стабильные петли давления-величины перед переходом в режим PV и объемным захватом. Правильное знание физиологии и анатомии сердца имеет важное значение для успеха этой процедуры. Онлайн-считывание следов ФВ из предсердия, области трехстворчатого клапана и правого желудочка покажет продвижение катетера и поможет добиться правильного позиционирования. Очень важно знать нормальную частоту сердечных сокращений (400–600 ударов в минуту), а также ожидаемые формы волн и давления (например, систолическое давление в правом желудочке 18–25 мм рт.ст., диастолическое давление <5 мм рт.ст., систолическое давление в левом желудочке 60–120 мм рт.ст., диастолическое давление <8 мм рт.ст.) у мышей^{, чтобы} оператор мог оценить достоверность наблюдаемых данных.

Качество и воспроизводимость данных будет зависеть от скорости проведения процедуры и кровопотери или кровотечения. Процедура от анестезии до завершения сбора данных занимает в среднем ~30–40 минут на мышь. Катетеризация правых отделов сердца от введения катетера до сбора данных занимает 5–10 минут, катетеризация левых отделов сердца от введения катетера до сбора данных занимает еще 10–15 минут. Данные публикационного качества получаются в ~75% случаев. Последовательность этапов катетеризации сердца должна быть постоянной между животными. При этой процедуре мышей сначала интубируют, затем проводят катетеризацию правого желудочка и, наконец, катетеризацию левого желудочка. Решение о продолжении операции в таком порядке основано на большей сложности и риске кровотечения при катетеризации левых отделов сердца по сравнению с правыми. Может наблюдаться неспецифический артефакт записи шума с частотой 50 Гц. Этот шум может быть уменьшен с помощью КИХ-фильтра с высоким срезом на частоте 50 Гц и низким значением 0 в программном обеспечении. Для канала громкости создайте новый канал/фильтр/КИХ-фильтр. Режекторный фильтр с частотой 50 Гц также может быть применен во время сбора данных для устранения шума сети и устранения любых радиочастотных помех.

Чем быстрее проводится катетеризация, тем лучше качество данных. Исходя из предыдущего опыта, рекомендуется собирать данные в течение 15 минут. Увеличение времени катетеризации увеличивает физиологическую нагрузку на животное и повышает риск развития аритмии из-за наличия катетера в полости. Эти силы могут уменьшить объем хода и ухудшить воспроизводимость и интерпретируемость осциллограмм. Кроме того, кончик катетера острый и может повредить или проколоть желудочек. Это особенно важно для правого желудочка, который составляет ~ 1/3^{толщины левого} желудочка.

Инвазивная трахеостомия и искусственная вентиляция легких с положительным давлением приводят к стабильному и контролируемому дыханию мышей и снижают вариабельность получения петель ФВ. Тем не менее, положительное давление в конце выдоха (PEEP) резко контрастирует с нормальной вентиляцией, которая является феноменом отрицательного давления. Вместе вентиляция с положительным давлением и PEEP снижают сердечный выброс и снижают давление в правых отделах сердца. Таким образом, несмотря на то, что механическая вентиляция легких, а также кардиодепрессивные эффекты анестезии необходимы для получения стабильных данных, они будут влиять на контуры ФВ и должны рассматриваться как ограничение. Для устранения этого потенциального источника артефактов используется временное прекращение механической вентиляции во время кратковременной регистрации фотоэлектрических контуров. Отметим, что эффективность вентиляции может быть подтверждена капнографическим контролем углекислого газа.

Технические навыки, необходимые для подхода с закрытой грудной клеткой, могут быть ограничением этой техники. Кроме того, сложно добиться правильного, стабильного расположения катетера в желудочке. Шансы на успех увеличиваются в зависимости от опыта оператора, а также от размера и веса мышей. Катетеризация мышей с массой тела ниже 20 г является чрезвычайно сложной задачей. Уникальная геометрия камеры правого желудочка может повлиять на измерение объема, и это следует учитывать. Используемый анестетик, частота сердечных сокращений, температура и штамм животного могут повлиять на параметры гемодинамики, и о них следует тщательно сообщать и контролировать.

В заключение, в этом протоколе катетеризация правого и левого желудочков выполняется у одной и той же мыши. В зависимости от конкретных целей ученого, катетеризация левого или правого желудочка может быть выполнена независимо друг от друга, используя соответствующую часть бивентрикулярной процедуры. Однако представленный подход оптимален для полной оценки сердечной функции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ADVantage Система давления-объема (ADV500)	Transonic	FY097B
Endozime AW triple plus	Ruhof	34521
Оптоволоконный двойной гусиный шеек	Volpi Intralux	# 6000-1
Щипцы	F.S.T	11052-10
Щипцы	F.S.T	11251-20
Марлевые губки	Dermacea	441400
Гемостатический зажим	F.S.T	13003-10
Гемостатический зажим	F.S.T	13018-14
Гепарин натрия	Sandoz	023-3086	100 Ед/л
Высокоточный приемный катетер	Scisence; Transonic	FTH-1212B-3518
Изофторан	Baxter	CA2L9108
labScribe v4 программное обеспечение	iworx	LS-30PVL
(30 калибр)	BD	305106
впрыскивание хлорида	натрия Baxter	JB1309M	0,9%(масс./об.)
Стереомикроскоп	Cole-Parmer	OF-48920-10
Хирургический шовный материал	SERAFLEX	ID158000	черным плетеным шелком, 4.0
Хирургическая лента	3M, Transpore	SN770
Настольные системы анестезии для одиночных животных	Гарвардский аппарат	72-6468
Трахеотомическая канюля диаметром 1,45 мм	Гарвардский аппарат	72-1410
Аппарат искусственной вентиляции легких, дальний инфракрасный согреватель для мышей и крыс PhysioSuite	Kent научная корпорация	# ПС-02