Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Live-Cell Imaging жизненного цикла бактериального хищника Bdellovibrio бактериоворуса с использованием Time-Lapse флуоресценции микроскопии

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61105

⸱

8 мая 2020 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол, описываемый мониторинг полного жизненного цикла хищной бактерии Bdellovibrio bacteriovorus с использованием замедленной микроскопии флуоресценции в сочетании с агарозной площадкой и клеточной визуализацией посуды.

Аннотация

Bdellovibrio bacteriovorus является небольшой грамотрицательных, обязательных хищных бактерий, которая убивает другие грамотрицательных бактерий, в том числе вредных патогенов. Поэтому он считается живым антибиотиком. Чтобы применить B. bacteriovorus в качестве живого антибиотика, сначала необходимо понять основные этапы его сложного жизненного цикла, в частности его распространение внутри добычи. До сих пор было трудно контролировать последовательные этапы хищнического жизненного цикла в режиме реального времени. Здесь представлен комплексный протокол для визуализации в режиме реального времени полного жизненного цикла B. bacteriovorus,особенно во время его роста внутри хозяина. Для этого используется система, состоящая из агарозной площадки в сочетании с клеточной визуализацией посуды, в которой хищные клетки могут свободно перемещаться под агарозной площадкой, в то время как обездвиженные клетки добычи способны образовывать бделлопласты. Применение штамма, производящего флуоресцентно помеченный к югу от полимеразы ДНК III, позволяет контролировать репликацию хромосом во время фазы размножения жизненного цикла B. bacteriovorus.

Введение

Bdellovibrio бактериоворус является небольшой (0,3-0,5 мкм на 0,5-1,4 мкм) грамотрицательная бактерия, которая охотится на другие грамотрицательных бактерий, в том числе вредных патогенов, таких как Klebsiella пневмонии, Pseudomonas aeruginosa, и Shigella flexneri1,2,3. Поскольку B. bacteriovorus убивает патогенные микроорганизмы, он считается потенциальным живым антибиотиком, который может быть применен для борьбы с бактериальными инфекциями, особенно вызванными штаммами с множественной лекарственной устойчивостью.

B. bacteriovorus демонстрирует своеобразный жизненный цикл, состоящий из двух фаз: свободной жизни не реплицативной фазы атаки и внутриклеточной репродуктивной фазы(рисунок 1). В фазе свободной жизни эта очень пестрая бактерия, которая движется со скоростью до 160 мкм/с, ищет свою добычу. Прикрепив к внешней мембране добычи, она попадает в периплазму4,,5. Во время межпериплазмической репродуктивной фазы B. bacteriovorus использует множество гидролитических ферментов для деградации макромолекул хозяина и повторного использования их для собственного роста. Вскоре после вторжения в периплазму, клетка-хозяин умирает и раздувается в сферическую структуру, называемую бделлопластом, внутри которого хищная клетка удлиняется и реплицирует свои хромосомы. Процесс репликации начинается с происхождения репликации(oriC)6 и продолжается до тех пор, пока несколько копий хромосомы не будут полностью синтезированы7. Интересно, что репликация каждой хромосомы не сопровождается делением клеток. Вместо этого хищник удлиняется, образовав длинные, многонуклеоидные и нитевидные клетки. После истощения питательных веществ, нить проходит синхронную перегородку и потомство клетки высвобождаются из bdelloplast8.

Прежде чем B. bacteriovorus может быть использован в качестве живого антибиотика против бактериальных инфекций, очень важно понять основные этапы его жизненного цикла, особенно те, которые связаны с его распространением внутри добычи. В течение сложной работы была сложная живая клеточная визуализация бактериоворуса B. из-за различных морфологических форм хищника и его добычи в течение сложного жизненного цикла. До сих пор взаимодействия между B. bacteriovorus и его клетки-хозяина были в основном изучены электронной микроскопии и оснастки выстрел анализа 2,9,10, оба из которых имеют ограничения, особенно когда они используются для мониторингапоследовательныхэтапов хищнического жизненного цикла. Эти методы обеспечивают высокое разрешение изображений клеток B. bacteriovorus и позволяют наблюдение небольшого хищника во время атаки или фазы роста. Тем не менее, они не позволяют отслеживать одиночные B. бактериоворусные клетки на протяжении обеих фаз жизненного цикла.

Здесь представлен комплексный протокол использования замедленной микроскопии флуоресценции (TLFM) для мониторинга полного жизненного цикла B. bacteriovorus. Система, состоящая из агарозы площадку используется в сочетании с клеточной визуализации блюдо, в котором хищные клетки могут свободно перемещаться под агарозой площадку в то время как обездвиженные клетки добычи способны образовывать bdelloplasts (Рисунок 2). Эта настройка подготовлена на основе конкретных штаммов кишечной палочки и B. bacteriovorus, но протокол может быть легко изменен, чтобы соответствовать индивидуальным штаммам пользователя (например, проведение различных маркеров отбора, белки, слитые с различными флюорофорами и т.д.).

В этом случае, чтобы визуализировать B. bacteriovorus во время фазы атаки, был построен специфический штамм (HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil'-mCherry), который выражает флуоресцентно помеченную версию цитоплазмического белка, Pil' (доступен в нашей лаборатории позапросу) 7. Этот штамм дополнительно производит DnaN (раздвижной зажим), подразделение ДНК-полимеразы III голоэнзима, слитого с флуоресцентным белком. Это позволяет контролировать текущую репликацию ДНК внутри хищных клеток по мере их роста в пределах бделлопластов.

Хотя описанный протокол и программное обеспечение, используемое для получения изображений, относятся к перевернутому микроскопу, предоставленную конкретным производителем (см. таблицу материалов),этот метод может быть скорректирован для любого перевернутого микроскопа, оснащенного экологической камерой или другим внешним держателем отопления и способного изображения замедленного действия. Для анализа данных пользователи могут выбрать любое доступное программное обеспечение, совместимое с отдельными форматами вывода.

Схема жизненного цикла Bdellovibrio; атакующая и репродуктивная фазы; процесс бактериальной инвазии.
Рисунок 1: B. бактериоворусный жизненный цикл в кишечной палочке в качестве клетки-хозяина. Во время фазы атаки свободно плавающие клетки B. bacteriovorus ищут и прикрепляются к клетке кишечной палочки. После вторжения хищная клетка локализируется в периплазме жертвы, изменяя форму клетки-хозяина и образуя бделлопласт. Репродуктивная фаза начинается с образования бделлопласта. Хищная клетка переваривает клетку добычи и повторно использовать простые соединения для создания собственных структур. B. bacteriovorus растет как длинная нить внутри периплазмы хозяина. Когда ресурсы клетки добычи исчерпаны, бактериоворусная нить B. синхронно септирует и образует клетки потомства. После того, как клетки потомства развивают свою флагеллу, они высасывают бделлопласт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка лизоворуса B. для микроскопического анализа

  1. В колбе 250 мл, создать кокультуру, объединив 1 мл свежих 24 ч B. бактериоворной культуры (например, HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil'-mCherry) и 3 мл ночной культуры добычи (например, E. coli S17-1 p'M100) с 50 мл буфера Ca-HEPES (25 мМ HEPES, 2 мМ CaCl2 «pH » 7,6 ») дополняется антибиотиками, когда это необходимо (здесь, 50 мкг/мл канамицин).
  2. Инкубировать кокультуру в течение 24 ч при 30 градусов по Цельсию при тряске при 200 об/мин.
  3. Убедитесь, что клетки добычи полностью облизаны жидкой фазово-контрастной микроскопией. В этот момент, многочисленные motile фазы атаки B. бактериоворусные клетки должны присутствовать, и не E. coli cell или bdelloplast должны быть видны.
  4. Фильтр B. bacteriovorus культуры через 0,45 мкм поры размер фильтра для удаления любых оставшихся клеток-хозяина. Хищные клетки (0,3–0,5 мкм х 0,5–1,4 мкм) свободно проникают в поры 0,45 мкм, в то время как клетки-хозяина сохраняются на поверхности фильтра.
  5. Спин вниз фильтрат в течение 20 мин при 2469 х г и 30 градусов в 50 мл конической трубки для сбора хищных клеток. Resuspend гранулы B. bacteriovorus в 3 мл буфера Ca-HEPES (до окончательного OD600 примерно 0,2) и инкубировать при 30 кк и 200 об /мин в течение 30 мин.

2. Подготовка ячеек-хозяйских клеток к вторжению бактериоворусов В.

  1. Используйте одну колонию штамма хозяина(E. coli S17-1 p'M100 рекомендуется из-за различных размеров клеток, приводящих к образованию неравномерного размера bdelloplasts) для прививки 10 мл YT среднего (0,8% Bacto tryptone, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl (рН 7,5), который был дополнен антибиотиками, если это необходимо (здесь, 50 мкг/мл канамицин). Культурные клетки на ночь при 37 градусах Цельсия и 180 об/мин.
  2. Передача 2 мл ночной культуры кишечной палочки (OD600 из 3,0 евро) в пробирку 2 мл и центрифугу при комнатной температуре (RT) и 2469 х г в течение 5 мин. Переусердуйте гранулы в 200 МКЛ буфера Ca-HEPES.

3. Настройка микроскопа (см. Таблицу материалов)

  1. Предварительно разогреть микроскопическую камеру с целью погружения масла 100x до 30 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 ч перед использованием. Этот шаг необходим для предотвращения ошибок в поддержании фокуса во время эксперимента.
  2. Включите как микроскоп, так и автоматизацию микроскопии. Инициализируйте программное обеспечение управления и выберите соответствующие фильтры для получения изображений яркого поля/DIC/phase-contrast и флуоресценции( по мере необходимости (здесь: изображения BF, полихромный фильтр GFP/mCherry и эмиссия/возбуждение для mCherry и GFP).

4. Сборка макетов для флуоресцентной микроскопии замедленного действия

  1. Смешайте 200 мг низкой флуоресцентной молекулярной градозы с 20 мл буфера Ca-HEPES (1% окончательной концентрации агарозы) и растворите агарозу в микроволновой печи. Пакет можно повторно использовать несколько раз после того, как он затвердевает, так что просто повторите шаг нагрева.
  2. Налейте 3 мл расплавленной агарозы в 35 мм стеклянное дно блюдо(Таблица материалов). Позвольте агарозе затвердеть.
  3. Используя лабораторный микро-шпатель, тщательно снимите агарозную площадку с 35-мм тарелки, не нарушая центральный полюс агарозной площадки. Переверните нижнюю сторону площадки вверх и поместите ее в крышку чашки Петри(рисунок 2).
  4. Положите 5 мкл концентрированной подвески кишечной палочки поверх перевернутой колодки и распределите клетки в центре полюса с помощью цикла прививки. Добавьте 5 МКЛ концентрированной подвески B. bacteriovorus (OD600 из 0,2) на поверхность с покрытиемкишечной палочки. Не распределять клетки.
  5. Быстро верните гель агарозы в 35-мм стеклянное дно блюда (вверху лицом вниз), затем накройте крышкой. При необходимости удалите пузырьки воздуха, осторожно прижимая агар к пластине.

Схема постановки бактериального эксперимента; Чашка Петри, E. coli, B. bacteriovorus, инвертированный микроскоп.
Рисунок 2: Схематическое изображение экспериментального рабочего процесса. Агарозная подушечку снимают с 35-мм тарелки и переворачиваются так, чтобы нижняя сторона лицом вверх. Свежие суспензии хищных клеток и ночная культура хищных клеток помещаются на перевернутую площадку, чтобы покрыть «нижнюю» сторону. После этого агарозная подушечку переворачивается на первоначальную ориентацию и помещается обратно в 35-мм тарелку, которая устанавливается на перевернутую сцену микроскопа в микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

5. Проведение замедленной микроскопии флуоресценции

  1. Поместите 35-мм тарелку в держатель чашки Петри таким образом, чтобы она не двигаться в ходе эксперимента. Поместите одну каплю масла погружения (1,518 рефракционного индекса) на цель, а также дно 35 мм тарелки.
  2. Намонтировать держатель на сцене перевернутого микроскопа в камере микроскопа.
  3. Настройка опций в программном обеспечении управления микроскопом для сбора нескольких изображений на нескольких позициях стадии с течением времени.
    1. Установите увеличение (100x) и полихромный объектив (GFP/mCherry). Используя кусок глаза и яркое поле (BF), найти координационный самолет и открыть точку список менеджеров.
    2. Выберите по крайней мере 10 позиций, представляющих интерес, перемещая сцену и сохраняя координаты для каждой позиции в программном обеспечении микроскопа, нажав кнопку точка марка. Избегайте позиций, расположенных близко друг к другу, чтобы предотвратить фотоотчетность и фототоксичность. Поверните клапан камеры из окуляра на монитор и откалибровать каждую точку, установив фокусную плоскость и нажав кнопку «Замена точки» в менеджере списка тока.
    3. Откройте проект эксперимента и установите все экспериментальные параметры в каждой вкладке следующим образом:
      1. Немаркированная коробка для укладки.
      2. Выберите флуоресцентные каналы и установите оптимальные настройки освещения. Здесь использовались следующие настройки: для канала mCherry, наборы фильтров mCherry (EX575/25; EM625/45), 50% интенсивности и 200 мс времени экспозиции; для канала GFP набор фильтров GFP (EX475/28; EM525/48), 50% интенсивности и 80 мс; и для изображений BF, канал POL, интенсивность 5% и 50 мс.
      3. Выберите интервалы между получением изображений и общим временем эксперимента. Здесь в течение 10 часов эксперимента было выполнено 5 минут интервалов.
      4. Включите фокус-обслуживание выбранных позиций (для системы, используемой здесь, путем маркировки фокуса Maintain с помощью чековой коробки UltimateFocus).
      5. Выберите папку данных, в которой файлы изображения должны быть автоматически сохранены.
      6. Перепроверьте все настройки в микроскопе управления программным обеспечением, а затем начать промежуток времени эксперимента.
  4. После первого часа эксперимента убедитесь, что все позиции на сцене все еще находятся в фокусе. При необходимости отрегулируйте фокус во время интервалов между получением изображения.
  5. Когда эксперимент с промежуток времени будет закончен, удалите чашку Петри и используйте 35-мм тарелку с агарозой в соответствии с протоколом биобезопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все подступы после шага 5.2 специфичны для пользователей DeltaVision Elite. Исследователя используя другие системы нужно отрегулировать установки согласно индивидуальным системам.

6. Обработка изображений замедленного действия и генерация фильмов с использованием программного обеспечения Фиджи

  1. Передача экспериментальных данных на компьютер, загруженный с помощью программного обеспечения Фиджи. Запустите программу Фиджи и откройте изображение с помощью файла (ru) Откройте или просто перетащите и сбросив файл изображения на Фиджи.
  2. В Bio-Formats Варианты импорта, выбрать просмотр стек с Hyperstack в стеке просмотра вариантов, Нажмите на режиме цвета Композитный в цветовых опциях, и пометить Autoscale.
  3. Прокручивая стеки изображений, оцените, оставались ли клетки и bdelloplasts в фокусе в течение эксперимента. Проверьте, присутствуют ли зеленые флуоресцентные пятна от DnaN-mNeonGreen в клетках B. bacteriovorus внутри bdelloplasts на протяжении всей фазы роста, и убедитесь, что все этапы хищного жизненного цикла могут быть визуализированы.
  4. Для анализа конкретного B. bacteriovorus ячейки / bdelloplast, пометить его с помощью инструментов отбора в меню Фиджи (Rectangle, Овальный , Полигон, или Freehand). Дублируйте выбранный регион с помощью изображения Дублировать или с помощью Ctrl и Shift .
  5. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала флуоресценции следующим образом:
    1. Чтобы выбрать один канал, откройте инструменты канала, нажав на изображение Цвет (ru) Инструменты каналов или Ctrl и Shift, и выберите канал интереса (Канал 1: mCherry, Канал 2: mNeonGreen, Канал 3: brightfield).
    2. Отрегулируйте яркость и контрастность изображений в канале флуоресценции, открыв меню B и C в изображении Отрегулируйте Яркость/контрастность или нажав ctrl и Shift .
  6. Добавить планку масштабирования с помощью анализа Инструменты (ru) Шкала бар. Добавьте штамповщик времени к изображениям, нажав на изображения Стеки Время Stamper.
  7. Чтобы сохранить измененные изображения, перейдите в файл Сохранить как и выбрать TIFF сохранить в качестве последовательности изображений, AVI для производства фильма, или PNG, чтобы сохранить одно изображение текущего кадра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанная система на основе TLFM позволяет вовремя отслеживать отдельные клетки бактериоворуса B. (рисунок 3, Movie 1) и предоставляет ценную информацию о каждом этапе сложного хищнического жизненного цикла. Слияние Пиле-мчерри позволяет маркировать всю хищную клетку в фазе атаки, а также на ранней стадии фазы роста(рисунок 3). Переход от атаки к репликационной фазе был визуализирован не только образованием хозяина bdelloplast, но и поя...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В связи с повышенным интересом к использованию B. bacteriovorus в качестве живого антибиотика необходимы новые инструменты наблюдения за хищным жизненным циклом, особенно взаимодействия хищника и патогена. Представленный протокол используется для отслеживания всего жизненного цикла B. bacteriovorus, особенно во время его роста внутри хозяина, в режиме реального времени. Кроме того, применение штамма, производящего флуоресцентно помеченный бета-зажим ДНК полимеразы III голоэнзима, позволило контролироват...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Грантом Национального научного центра Opus 2018/29/B/N'6/00539 в J.Q.C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЦентрифугаMPW MED. INSTRUMENTSMPW-260RРотор арт. 12183
СертифицированныйМолекулярная биология АгарозаBIO-RAD161-3100низкофлуоресцентная агароза для агарозной прокладки
FijiImageJhttps://imagej.net/FijiПакет обработки изображений с открытым исходным кодом
Стеклянное дно Тарелка 35 ммibidi81218-200стекло
без покрытияМикроскопGEDeltaVision EliteMicrotiter Stage, лазерный модуль с максимальной фокусировкой, камера DV Elite CoolSnap HQ2, SSI в сборе FP DV, комплект obj. Oly 100x oil 1.4 NA, призма Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filter 0.45 &; mSartorius16555----------KАцетат целлюлозы, стерильный, с люэровской блокировкой Запуск розетки
SoftWoRxGEПрограммное обеспечение для визуализации, поставляемое производителем

Ссылки

  1. Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
  2. Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
  3. Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
  4. Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
  5. Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
  6. Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).
  7. Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
  8. Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
  9. Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
  10. Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Live-Cell Imaging жизненного цикла бактериального хищника Bdellovibrio бактериоворуса с использованием Time-Lapse флуоресценции микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.